I.

Tujuan

1. Menentukkan pengaruh konsentrasi suksinat terhadap Vo

2. Menentukan pengaruh penambahan inhibitor terhadap aktivitas enzim suksinat
dehidrogenase
3. Menentukan pengaruh keberadaan azida terhadap aktivitas enzim suksinat
dehidrogenase
4. Menentukan pengaruh keberadaan suksinat terhadap aktivitas enzim suksinat
dehidrogenase

II. Teori Dasar

Suksinat dehidrogenase, enzim siklus Krebs, merupakan komponen integral dari kompleks II
dari rantai respirasi mitokondria (Saneto, Parikh, & SCohen, 2016). Suksinat dehidrogenase
terdiri dari empat subunit (dinamakan A sampai D) yang di dikodekan oleh genom inti
(Rosenberg & Pascual, 2015). Suksinat dehidrogenase mengatalisis reaksi suksinat + FAD ⇌
fumarat + FADH2 yang berfungsi sebagai penghubung penting antara siklus asam
trikarboksilat dan fosforilasi oksidatif. Kompleks yang mengandung subunit A, dimana
flavoprotein didalam subunit A berperan sebagai situs katalisis dikarboksilat dan subunit B
yang mengandung gugus besi-sulfur berperan dalam memfasilitasi pergerakan elektron (Cook,
Greening, Hards, & Berney, 2014). Mekanisme oksidasi suksinat menjadi fumarat dapat dilihat
pada gambar dibawah.

Gambar 2.1 Oksidasi suksinat menjadi fumarat dengan agen pengoksidasi FAD (Bruice,
2007)
Berbagai spesies kuinon yang terdapat dalam enzim bertindak sebagai pembawa elektron
antara protein bioenergetik, sehingga mekanisme oksidoreduksi 2H+/2e- dari kuinon dan kuinol
telah ditandai dalam beberapa sistem yang berbeda (Iverson, 2013 ).

Gambar 2.2 Reduksi kuinon menjadi kuinol (Iverson, 2013 ).

Dalam siklus TCA enzim suksinat dehidrogenase berperan dalam katalisis reaksi oksidasi
suksinat menjadi fumarat dengan reduksi ubikuinon menjadi ubikuinol. Hal ini terjadi dalam
membran dalam mitokondria dengan cara coupling kedua reaksi secara bersamaan.

Gambar 2.3 Siklus asam trikarboksilat (Taiz & Zeiger, 2003)

 Reaksi oksidasi suksinat menjadi fumarat dapat diukur dengan cara mengamati reduksi
akseptor elektron buatan reagen Hill atau 2,6-diklorofenolindolfenol (DCPIP). Saat pewarna
DCPIP teroksidasi warnanya berupa biru dan saat tereduksi warnanya menjadi tak bewarna.
DCPIP direduksi oleh FADH2 hasil oksidasi suksinat menjadi fumarat.

Gambar 2.3 Reaksi reduksi DCPIP oleh FADH2 (Hollywood, Shadi, & Goodacre, 2010)

Agar akseptor elektron buatan tereduksi, jalur elektron ke ubikuinon harus dihalangi. Hal ini
dapat dilakukan dengan menambahkan NaN3 ke dalam campuran. NaN3 akan menghalangi
transfer elektron ke molekul ubikuinon. Sebagai gantinya elektron diambil oleh DCPIP.
Reduksi DCPIP oleh FADH2 dapat diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang
600 nm (Hollywood, Shadi, & Goodacre, 2010).

Inhibisi kompetitif biasanya disebabkan oleh senyawa yang secara struktur mirip dengan
substrat, dan demikian bergabung pada situs ikat substrat sehingga mencegah substrat terikat.
Hal ini membuat enzim menjadi tidak aktif. Pengikatan bersifat eksklusif satu sama lain,
membentuk kompleks enzim-substrat atau enzim-inhibitor tetapi tidak kompleks terner. Km
ditingkatkan oleh faktor (1 + [I]/Ki) dimana [I] adalah konsentrasi substrat dan Ki adalah
konstanta kesetimbangan inhibitor (Eun, 1996).

Malonat merupakan inhibitor kompetitif dari enzim suksinat dehidrogenase. Malonat

mengikat sisi aktif enzim tanpa bereaksi sehingga berkompetisi dengan suksinat. Malonat
mengurangi respirasi seluler. Malonat menyerupai suksinat tanpa gugus −CH2CH2− yang
dibutuhkan agar proses dehidrogenasi berjalan (Potter & Dubois, 1943).

III. Data Pengamatan

Tabel Absorbansi
Tabung 0' 2' 4' 6' 8' 10'
1 0
2 0.368
3 0.959
4a 1.22 1.221 1.216 1.207 1.202 1.2
4b 1.297 1.308 1.309 1.309 1.315 1.292
5a 1.254 1.261 1.248 1.251 1.242 1.243
(dilanjutkan)
 (lanjutan)
5b 1.261 1.264 1.259 1.251 1.247 1.251
6a 1.239 1.245 1.227 1.227 1.225 1.216
6b 1.252 1.257 1.259 1.247 1.241 1.24
7a 1.267 1.275 1.259 1.26 1.275 1.274
7b 1.253 1.253 1.25 1.249 1.248 1.245
8a 1.248 1.246 1.231 1.236 1.234 1.233
8b 1.226 1.224 1.222 1.221 1.221 1.218
9a 1.232 1.236 1.234 1.245 1.243 1.21
9b 1.248 1.255 1.254 1.251 1.247 1.246

Tabel 3.1 Nilai Absorbansi pada waktu tertentu

IV. Pengolahan Data

Kecepatan enzim ditentukkan menggunakan persamaan:

∆𝐴
𝑉𝑜 = = 𝑔𝑟𝑎𝑑𝑖𝑒𝑛 (1)
𝑡

Perubahan absorbansi dapat ditentukkan dengan faktor koreksi sehingga persamaannya yaitu:

∆𝐴 = 𝐴2 − (𝐴𝑛 − 𝐴3 ) (2)

Dengan menggunakan persamaan (2) nilai ΔA dari tabel 3.1 dapat ditentukkan.

Tabel Delta Absorbansi

Tabung 0 2 4 6 8 10
4 0.0685 0.0625 0.0645 0.069 0.0685 0.081
5 0.0695 0.0645 0.0735 0.076 0.0825 0.08
6 0.0815 0.076 0.084 0.09 0.094 0.099
7 0.067 0.063 0.0725 0.0725 0.0655 0.0675
8 0.09 0.092 0.1005 0.0985 0.0995 0.1015
9 0.087 0.0815 0.083 0.079 0.082 0.099

Tabel 4.1 Nilai delta absorbansi

 0.09
0.08
0.07
0.06 y = 0.0012x + 0.0629
0.05 R² = 0.4986

ΔA
0.04
0.03
0.02
0.01
0
0 2 4 6 8 10 12
t (menit)

Gambar 4.1 Kurva absorbansi substrat 4

0.09
0.08
0.07
y = 0.002x + 0.0633
0.06 R² = 0.8235
0.05
ΔA

0.04
0.03
0.02
0.01
0
0 2 4 6 8 10 12
t (menit)

Gambar 4.2 Kurva absorbansi substrat 5

0.12

0.1

0.08 y = 0.0021x + 0.0769

R² = 0.8605
ΔA

0.06

0.04

0.02

0
0 2 4 6 8 10 12
t (menit)

Gambar 4.3 Kurva absorbansi substrat 6

Namun dikarenakan nilai r2 yang kecil maka data menit ke – 0 dihilangkan sehingga didapatkan
nilai r2 yang lebih besar.
 0.09
0.08
0.07
0.06 y = 0.002x + 0.0568
R² = 0.8133
0.05

ΔA
0.04
0.03
0.02
0.01
0
0 2 4 6 8 10 12
t (menit)

Gambar 4.4 Kurva absorbansi substrat 4

0.09
0.08
0.07
y = 0.0021x + 0.0633
0.06
R² = 0.8235
0.05
ΔA

0.04
0.03
0.02
0.01
0
0 2 4 6 8 10 12
t (menit)

Gambar 4.5 Kurva absorbansi substrat 5

0.12

0.1

0.08 y = 0.0028x + 0.0718

R² = 0.9825
ΔA

0.06

0.04

0.02

0
0 2 4 6 8 10 12
t (menit)

Gambar 4.6 Kurva absorbansi substrat 6

Dikarenakan y = mx+c sudah diketahui dengan meregresi linear kurva diatas maka Vo dapat
diketahui dengan menggunakan persamaan (1) sehingga didapatkan:
 Vo
[S] (M)
(M/menit)
0.00125 0.002
0.0025 0.0021
0.00375 0.0028
Tabel 4.2 Konsentrasi Substrat dan Kecepatan Enzim
Konsentrasi substrat didapat menggunakan persamaan M1*V1 = M2*V2 dimana konsentrasi
awal substrat sama dengan 0.05M.

0.003

0.0025

0.002
y = 0.32x + 0.0015
R² = 0.8421
Vo

0.0015

0.001

0.0005

0
0 0.001 0.002 0.003 0.004
[S] (M)

Gambar 4.4 Kurva pengaruh konsentrasi terhadap keccepatan enzim

Pengaruh Inhibitor Azida dan Substrat

0.12 y = 0.0011x + 0.0914
0.1
y = 0.0008x + 0.0811
0.08
y = 0.0016x + 0.0665
ΔA

0.06
0.04 y = 0.0001x + 0.0673
0.02
0
0 2 4 6 8 10 12
t (menit)

Dengan malonat Tanpa azida

Tanpa suksinat [S] = 0.0025

Gambar 4.4 Kurva pengaruh keberadaan inhibitor,azida, dan substrat

Hanya satu data dari dua kali pengulangan yang digunakan dikarenakan data satunya

V. Pembahasan
 Reagen Hill atau 2,6-diklorofenolindolfenol (DCPIP) berfungsi sebagai akseptor elektron
FADH2 dan karena warnanya yang berbeda pada keadaan tereduksi dan teroksidasi sehingga
parameter yang diukur pada uji kolorimetri aktivitas suksinat dehidrogenase. Azida digunakan
untuk menghalangi transfer elektron ke molekul ubikuinon menjadikan DCPIP sebagai satu-
satunya akseptor elektron. Malonat berfungsi sebagai inhibitor kompetitif dari enzim suksinat
dehidrogenase. Malonat mengikat sisi aktif enzim tanpa bereaksi sehingga berkompetisi
dengan suksinat. Tabung 1 berfungsi sebagai blangko, tabung 2 dan 3 berfungsi sebagai faktor
koreksi blanko, tabung 4,5,6 befungsi untuk menentukkan pengaruh konsentrasi substrat
terhadap laju reaksi enzim, dan tabung 7,8,9 berfungsi untuk menentukkan pengaruh
penambahan malonat, penghilangan azida, dan penghilangan suksinat secara berurutan.

Laju reaksi enzim suksinat dehidrogenase pada konsentrasi substrat 0.00125, 0.0025, dan
0.00375 M di tabung 4, 5, dan 6 secara berurutan yaitu 0.002, 0.0021, dan 0.0028 M/menit.
Dari hasil yang didapat terlihat bahwa seiiring meningkatnya konsentrasi substrat, laju reaksi
enzim juga makin meningkat Percobaan ini sesuai dengan kinetika Michaelis-Menten dimana
laju reaksi enzim berbanding lurus dengan konsentrasi substrat (Nelson & Cox, 1993).

Pada percobaaan ini didapatkan bahwa laju reaksi enzim dengan malonat pada tabung 7 yaitu
0.0001 M/menit lebih kecil dibanding laju reaksi tanpa malonat pada tabung 6 yaitu 0.0021
M/menit. Hasil percobaan ini sesuai dengan percobaan Thorn (1953) dan Butcher (1970).
Malonat merupakan inhibitor kompetitif dari enzim suksinat dehidrogenase. Malonat mengikat
sisi aktif enzim tanpa bereaksi sehingga berkompetisi dengan suksinat. Hal ini menyebabkan
laju reaksi suksinat dehidrogenase berkurang. Jika dilihat dari persamaan kinetika Michaelis-
Menten kesetimbangan inhibitor-enzim memberikan faktor (1 + [I]/Ki) terhadap Km sehingga
persamaannya menjadi (Thorn, 1953) :

𝑉𝑚𝑎𝑥[𝑆]
𝑉𝑜 =
[𝐼]
[𝑆] + 𝐾𝑚 (1 +
𝐾𝑖 )

Dapat dilihat dari persamaan bahwa konsentrasi malonat berbanding terbalik dengan kecepatan
enzim sehingga jika konsentrasi malonat naik maka laju reaksi enzim akan menurun.

Pada percobaan ini terlihat bahwa laju reaksi enzim tanpa menggunakan azida pada tabung 8
adalah 0.0011 M/menit lebih kecil dibanding yang dengan azida yaitu 0.0021 M/menit
meskipun menggunakan konsentrasi substrat yang sama. Hal ini dikarenakan azida berperan
untuk menghalangi transfer elektron ke molekul ubikuinon. Hal ini menyebabkan molekul
DCPIP yang tereduksi. Tidak adanya azida akan membuat transfer elektron terbagi ke molekul
ubikuinon dan DCPIP. Hal ini akan membuat jumlah DCPIP yang tereduksi akan lebih sedikit
dibanding dengan adanya azida. Molekul DCPIP yang mempengaruhi pembacaan
spektrofotometer untuk menentukkan aktivitas enzim sehingga pembacaan laju reaksi enzim
tanpa azida lebih kecil dari larutan dengan azida.

Laju reaksi enzim tanpa suksinat pada tabung 9 yaitu 0.0008 M/menit namun seharusnya
tidak ada laju terbaca. Hal ini ini dapat dikarenakan adanya spesies kimia lain yang dapat
mereduksi DCPIP sehingga mempengaruhi pembacaan absorbansi. Menurut VanderJagt,et
al.(1986) DCPIP dapat direduksi oleh asam askorbat dengan reaksi seperti dibawah.

Gambar 5.1 Reaksi reduksi DCPIP oleh asam askorbat (Advanced Instructional Systems, 2011)

Pada percobaan Cantoni,et al.(2017) menunjukkan bahwa mitokondria menyerap dan

mengakumulasi asam askorbat. Hasil dari percobaan tersebut yaitu terdeteksinya asam
askorbat dengan konsentrasi pada rentang 0.5-1 mM. Konsentrasi asam askorbat berbeda pada
spesies yang berbeda (Ingebretsen & Normann, 1982; Ramanathan,et al., 2003 ). Dengan
diketahuinya efek asam askorbat terhadap DCPIP dan kemampuan mitokondria dalam
akumulasi asam askorbat sehingga dapat diperkirakan bahwa yang mempengaruhi pembacaan
adalah asam askorbat yang terdapat pada suspensi mitokondria.

VI. Kesimpulan

1. Konsentrasi suksinat berpengaruh terhadap laju reaksi enzim suksinat dehidrogenase

dimana konsentrasi substrat 0.00125, 0.0025, dan 0.00375 M memiliki laju reaksi yaitu
yaitu 0.002, 0.0021, dan 0.0028 M/menit secara berurutan
2. Penambahan malonat mempengaruhi aktivitas enzim suksinat dehidrogenase
3. Keberadaan azida tidak mempengaruhi aktivitas enzim suksinat dehidrogenase hanya
mempengaruhi transfer elektron dari FADH2 pada enzim ke ubikuinon atau DCPIP
4. Keberadaan suksinat mempengaruhi aktivitas enzim suksinat dehidrogenase
VII. Daftar Pustaka
Advanced Instructional Systems, I. (2011). Determination of Amount of Vitamin C in a
Commercial. Santa Cruz: Author.

Bruice, P. (2007). Organic Chemistry, 5th Edition. London: Pearson.

Butcher, R. G. (1970). Studies on Succinate Oxidation. Experimental Cell Research, 60 , 54-

60 .

Cantoni, O., Guidarelli, A., & Fiorani, M. (2017). Mitochondrial Uptake and Accumulation of
Vitamin C: What Can We Learn From Cell Cultures Studies? . Antioxidants and Redox
Signaling , 1-42.

Cook, G., Greening, C., Hards, K., & Berney, M. (2014). Energetics of Pathogenic Bacteria
and Opportunities for Drug Development. Microbial Physiology, 65, 1–62.

Eun, H. (1996). Enzymology Primer for Recombinant DNA Technology. Cambridge: Academic
Press.

Hollywood, K., Shadi, I., & Goodacre, R. (2010). Monitoring the Succinate Dehydrogenase
Activity Isolated from Mitochondria by Surface Enhanced Raman Scattering. J. Phys.
Chem. C, 114, 7308–7313.

Ingebretsen, O., & Normann, P. (1982). Transport of ascorbate into guinea pig liver
mitochondria. Biochim Biophys Acta, 684, 21‐26 .
Iverson, T. (2013 ). Catalytic mechanisms of complex II enzymes: A structural perspective.
Biochimica et Biophysica Acta,1827, 648–657.

Nelson, D., & Cox, M. (1993). Lehniger Principle of Biochemistry 4th edition. New York:
Worth Publishers.

Potter, V. R., & Dubois, K. P. (1943). Studies on the Mechanism of Hydrogen Transport in
Animal Tissues : VI. Inhibitor Studies with Succinic Dehydrogenase. The Journal of
General Physiology, 26 (4), 391–404.

Ramanathan, K., Shila, S., Kumaran, S., & Panneerselvam, C. (2003). Ascorbic acid and alpha‐
tocopherol as potent modulators on arsenic induced toxicity in mitochondria. JNutr
Biochem, 14, 416‐420.

Rosenberg, R., & Pascual, J. (2015). Rosenberg's Molecular and Genetic Basis of Neurological
and Psychiatric Disease. Cambridge: Academic Press.

Saneto, R., Parikh, & SCohen, B. (2016). Mitochondrial Case Studies : Underlying
Mechanisms and Diagnosis. Cambridge: Academic Press.

Taiz, L., & Zeiger, E. (2003). Plant Physiology, 3rd Ed. Sunderland: Sinauer Associates.

Thorn, M. B. (1953). Inhibition by malonate of succinic dehydrogenase in heart-muscle

preparations. Biochemical Journal,54(4), 540–547.

VanderJagt, D., Garry, P., & Hunt, W. (1986). Ascorbate in plasma as measured by liquid
chromatography and by dichlorophenolindophenol colorimetry. Clin. Chem, 32(6),
1004–1006.
 LAPORAN PRAKTIKUM
PERCOBAAN V
UJI AKTIVITAS SUKSINAT DEHIDROGENASE

NAMA : RENARD ELYON

NIM : 11217014

KELOMPOK :2

SHIFT : JUMAT PAGI

ASISTEN : ANISSA SHABRINA (11215009)

TANGGAL PENGUMPULAN LAPORAN : 29 MARET 2019

LABORATORIUM BIOKIMIA
PROGRAM STUDI KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG
2019