PERCOBAAN III

KROMATOGRAFI KOLOM

I. Tujuan

Adapun tujaun dari percobaan ini yaitu sebagai berikut :

1. Memisahkan pigmen atau komponen – komponen dari ekstrak daun

pandan suji (Dracaena angustifolia)

2. Memisahkan Cr(III) dan Cr(IV) dari campurannya.

II. Dasar Teori

Kromatografi adalah suatu metode pemisahan campuran yang terdiri

dari dua macam komponen atau lebih berdasarkan distribusi dua fasa yaitu
fasa diam dan fasa gerak (Staf Pengajara Pemisahan Analitik, 2013).

Kromatografi berasal dari 2 kata yaitu Chorama yang artinya warna

dan graphein yang artinya menulis. Kromatografi pertama kali ditemukan
oleh Mickhael Tsweet pada tahun 1906. Seorang botanist Rusia yang bekerja
diuniversitas Warsawa, melakukan pemisahan klorofil dari pigemen-pigmen
lain pada ekstrak tanaman menggunakan peralatan sederhana yaitu berupa
kolom gelas yang diisi bubuk kalsium karbonat (Anonim, 2013).

Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan molekul berdasarkan

perbedaan pola pergerakan antara fase gerak dan fase diam untuk
memisahkan komponen (berupa molekul) yang berada pada larutan.
Molekul yang terlarut dalam fase gerak, akan melewati kolom yang
merupakan fase diam. Molekul yang memiliki ikatan yang kuat dengan
kolom akan cenderung bergerak lebih lambat dibanding molekul yang
berikatan lemah.Dengan ini, berbagai macam tipe molekul dapat dipisahkan
berdasarkan pergerakan pada kolom (Anonim, 2013).

Kromatografi kolom merupakan metode kromatografi klasik yang

masih banyak digunakan. Kromatografi kolom digunakan untuk
memisahkan senyawa-senyawa dalam jumlah yang banyak berdasarkan
adsorpsi dan partisi. Kemasan adsorben yang sering digunakan adalah silika
gel G-60, kieselgur, Al2O3, dan Diaion. Cara pembuatannya ada dua macam :
1. Cara kering yaitu silika gel dimasukkan ke dalam kolom yang telah
diberi kapas kemudian ditambahkan cairan pengelusi.
2. Cara basah yaitu silika gel terlebih dahulu disuspensikan dengan cairan
pengelusi yang akan digunakan kemudian dimasukkan ke dalam kolom
melalui dinding kolom secara kontinyu sedikit demi sedikit hingga
masuk semua, sambil kran kolom dibuka. Eluen dialirkan hingga silika
gel mapat, setelah silika gel mapat eluen dibiarkan mengalir sampai
batas adsorben kemudian kran ditutup dan sampel dimasukkan yang
terlebih dahulu dilarutkan dalam eluen sampai diperoleh kelarutan yang
spesifik.
Kemudian sampel dipipet dan dimasukkan ke dalam kolom melalui
dinding kolom sedikit demi sedikit hingga masuk semua, dan kran dibuka
dan diatur tetesannya, serta cairan pengelusi ditambahkan. Tetesan yang
keluar ditampung sebagai fraksi-fraksi.

Dalam bidang bioteknologi, kromatografi mempunyai peranan yang

sangat besar. Misalnya dalam penentuan, baik kualitatif maupun kuantitatif,
senyawa dalam protein. Protein sering dipilih karena ia sering menjadi
obyek molekul yang harus di-purified (dimurnikan) terutama untuk
keperluan dalam bio-farmasi. Kromatografi juga bisa diaplikasikan dalam
pemisahan molekul-molekul penting seperti asam nukleat, karbohidrat,
lemak, vitamin dan molekul penting lainnya. Dengan data-data yang
didapatkan dengan menggunakan kromatografi ini, selanjutnya sebuah
produk obat-obatan dapat ditingkatkan mutunya, dapat dipakai sebagai data
awal untuk menghasilkan jenis obat baru, atau dapat pula dipakai untuk
mengontrol kondisi obat tersebut sehingga bisa bertahan lama.

Dalam bidang clinical (klinik), teknik ini sangat bermanfaat terutama

 dalam menginvestigasi fluida badan seperti air liur. Dari air liur seorang
pasien, dokter dapat mengetahui jenis penyakit yang sedang diderita pasien
tersebut. Seorang perokok dapat diketahui apakah dia termasuk perokok
berat atau ringan hanya dengan mengetahui konsentrasi CN- (sianida) dari
sampel air liurnya. Demikian halnya air kencing, darah dan fluida badan
lainnya bisa memberikan data yang akurat dan cepat sehingga keberadaan
suatu penyakit dalam tubuh manusia dapat dideteksi secara dini dan cepat.
Sekarang ini, deteksi senyawa oksalat dalam air kencing menjadi sangat
penting terutama bagi pasien kidney stones (batu ginjal). Banyak metode
analisis seperti spektrofotometri, manganometri, atau lainnya, akan tetapi
semuanya membutuhkan kerja ekstra dan waktu yang cukup lama untuk
mendapatkan hasil analisis dibandingkan dengan teknik kromatografi.
Kelebihan dan Kekurangan Kromatografi Kolom:
1. Kelebihan kromatografi kolom
a. Dapat digunakan untuk analisis dan aplikasi preparative.
b. Digunakan untuk menentukan jumlah komponen campuran.
c. Digunakan untuk memisahkan dan purifikasi substansi
2. Kekurangan kromatografi kolom :
a. Untuk mempersiapkan kolom dibutuhkan kemampuan teknik dan
manual.
b. Metode ini sangat membutuhkan waktu yang lama (time consuming)
(Anonim, 2013).
Kromatografi bergantung pada pembagian ulang molekul-molekul
campuran antara dua fase atau lebih. Tipe-tipe kromatografi absorpsi,
kromatografi partisi cairan dan pertukaran ion. Sistem utama yang
digunakan dalam kromatografi partisi adalah partisi gas, partisi cairan yang
menggunakan alas tak bergerak (misalnya komatografi kolom), kromatografi
kertas dan lapisan tipis ( Svehla, 1979).

III. Alat dan Bahan

 Adapun alat dan bahan yang digunakan dalam percobaan ini yaitu
sebagai berikut :
A. Kromatografi kolom dengan fasa diam CaCO3
 Alat  Bahan
1. Statif dan klem 1. Ekstrak daun pandan
2. Kolom suji (eter)
3. Gelas kimia 50 mL dan 100 mL 2. Aquadest
4. Erlenmeyer 3. Aseton
5. Rak tabung reaksi 4. Serbuk CaCO3
6. Tabung reaksi 5. Tissue
7. Batang pengaduk
8. Stopwatch
9. Gunting
10. Pipet tetes
11. Mistar

B. Kromatografi kolom dengan fasa diam alumina

 Alat  Bahan
1. Statif dan klem 1. Larutan NH4OH
2. Kolom 2. Larutan HNO3 1 M
3. Gelas kimia 50 mL 3. Larutan Pb(NO3)2 1 M
4. Rak tabung reaksi 4. Larutan sampel Cr(III)
5. Tabung reaksi dan Cr(IV)
6. Pipet tetes 5. Serbuk alumina
7. Stopwatch 6. Aquadest
8. Mistar 7. Tissue
9. Batang pengaduk 8. Larutan NaOH
10. Gunting
11. Kertas saring

IV. Prosedur kerja

 Adapun prosedur kerja dalam percobaan ini yaitu sebagai berikut :
A. Pengepakan kolom
1. Memasukkan kapas pada bagian dasar kolom dan memadatkan
kapas tersebut didalam kolom.
2. Memasukkan fase diam yang telah dibuat bubur kedalam kolom
yang berisis kapas.
3. Memadatkan fasa diam yang telah dimasukkan kedalam kolom
B. Pemisahan ekstrak daun pandan suji (Dracaena angustifolia)
1. Measukkan kertas saring yang memiliki diameter yang sama
dengan diameter kolom.
2. Memasukkan larutan sampel ekstrak daun pandan suji kedalam
kolom.
3. Mengaliri kolom yang berisi sampel dengan fasa gerak
4. Menunggu beberapa lama sampai memperoleh pita yang
berwarna.
5. Mengamati komponen-komponen yang terpisah.
C. Pemisahan Cr(II) dan Cr(VI)
1. Memasukkan kertas saring kedalam kolom yang berisi
adsorben alumina
2. Memasukkan sampel Cr(II) dan Cr(VI) kedalam kolom melalui
dinding kolom secara melingkar, kemudian menaglirkan fasa
gerak agar kolom tidak kering.
3. Menunggu beberapa lama sampai memperoleh pita yang
berwarna.
4. Menampung hasil pemisahan pada wadah yang berbeda
5. Melakuak uji spesifik terhadap hasil pemisahan yang diperoleh
denagn menggunakan larutan NaOH dan Pb(NO3)2

V. Hasil pengamatan

Adapun hasil data yang diperoleh pada percobaan ini yaitu sebagai
berikut :

A. Ekstrak pandan daun suji

No. Pengamatan Hasil

1. Panjang kolom 7 cm
 2. Diameter kolom 1,8 cm

3. Laju elusi 0,15 mL/menit

4. Ekstrak yang dipisahkan Pigmen warna klorofil

5. Eluen yang digunakan Aseton

6. Fase diam yang digunakan CaCO3

7. Komponen yang terpisah Bening, hijau kekuningan

dan hijau

B. Pemisahan ion Cr(III) dan Cr(IV)

No. Pengamatan Hasil

1. Panjang kolom 12 cm

2. Diameter kolom 1,8 cm

3. Laju elusi 0,9 ml/menit

4. Ekstrak yang dipisahkan Cr(III) dan Cr(IV)

5. Eluen yang digunakan

a. Larutan NH4OH Untuk mengelusi Cr(VI)

b. Larutan HNO3 Untuk mengelusi Cr(III)

6. Fase diam yang digunakan Alumina

7. Komponen yang terpisah Cr(III) dan Cr(VI)

8. Pereaksi spesifik

a.Larutan Pb(NO3)2 untuk Endapan kuning

Cr(VI) Endapan putih
b. Larutan NaOH untuk
Cr(III)

 PERSAMAAN REAKSI

1. Cr3+(aq) + 3OH-(aq) Cr(OH)3(s)

 Endapan Putih

2. CrO42-(aq) + Pb2+ (aq) PbCrO4(s)

Endapan Kuning

VI. Pembahasan
Kromatografi adalah suatu metode pemisahan campuran yang terdiri
dari dua macam komponen atau lebih berdasarkan distribusi dua fasa yaitu
fasa diam dan fasa gerak (Staf Pengajara Pemisahan Analitik, 2013).

Kromatografi berasal dari 2 kata yaitu Chorama yang artinya warna

dan graphein yang artinya menulis. Kromatografi pertama kali ditemukan
oleh Mickhael Tsweet pada tahun 1906. Seorang botanist Rusia yang bekerja
diuniversitas Warsawa, melakukan pemisahan klorofil dari pigemen-pigmen
lain pada ekstrak tanaman menggunakan peralatan sederhana yaitu berupa
kolom gelas yang diisi bubuk kalsium karbonat (Anonim, 2013).

Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan molekul berdasarkan

perbedaan pola pergerakan antara fase gerak dan fase diam untuk
memisahkan komponen (berupa molekul) yang berada pada larutan.

Adapun tujuan dari percobaan ini yaitu Memisahkan pigmen atau

komponen – komponen dari ekstrak daun suji Dan memisahkan Cr(III) dan
Cr(IV) dari campurannya (Staf Pengajara Pemisahan Analitik, 2013).

I. Pengepakan kolom

Perlakuan pertama yaitu memasukkan kapas kedalam dasar kolom dan

memadatkan kapas tersebut. Tujuannya yaitu agar tidak ada udara untuk
mencegah agar fasa diam tetap berada pada kolom. Selanjutnya
memasukkan kertas saring kedalam kolom dengan diameter yang sama
dengan diameter kolom dan memasukkan sampel ekstrak pandan daun suji
dan Cr(III) dan Cr(IV) dengan menggunakan pipet. Adapun metode yang
digunakan dalam percobaan ini yaitu metode basah. Metode basah yaitu fasa
diam terlebih dahulu disuspensikan dengan cairan pengelusi yang akan
digunakan kemudian dimasukkan ke dalam kolom melalui dinding kolom
secara kontinue sedikit demi sedikit hingga masuk semua, sambil kran
kolom dibuka. Eluen dialirkan hingga fasa diam tersebut mapat. Setelah fasa
diamnya mapat eluen dibiarkan mengalir sampai batas adsorben kemudian
kran ditutup dan sampel dimasukkan yang terlebih dahulu dilarutkan dalam
eluen sampai diperoleh kelarutan yang spesifik (Anonim, 2013).
Pengisian ini harus hati-hati karena pengisian yang tidak teratur
akan menyebabkan adanya gelembung udara yang memungkinkan
terjadinya eddy difusi dan mass transfer non-equilibrum dan selanjutnya
mengakibatkan pelebaran pita kromatografi. Eddy difusi terjadi akibat dari
panjang jalur gerakan molekul-molekul komponen tidak sama sepanjang
kolom. Molekul-molekul yang masuk bersama-sama pada ujung kolom,
keluar pada waktu yang tidak bersamaan pada ujung yang lain. Variasi
panjang jalur ini salah satunya akibat dari ketidakseragaman kemasan kolom
yang berkaitan dengan adanya gelembung-gelembung udara di dalam
kolom. Gelembung udara ini menyebabkan adanya ruangan kosong (dead
space) yang tidak aktif menjerap linarut, sehingga linarut mengalir tidak
beraturan dan terjadi ketidakseragaman kecepatan turun linarut dan fase
gerak. Mass transfer non equilibrum juga dapat terjadi karena belum terjadi
kesetimbangan yang penuh pada plat teori namun linarut telah turun terlebih
dahulu, hal ini dapat disebabkan karena adanya gelembung-gelembung
udara pada plat teori (Anonim, 2013).

II. Pemisahan ekstak daun pandan suji

Daun pandan suji (Dracaena angustifolia) merupakan tumbuhan perdu
tahunan yang daunnya dapat dimanfaatkan sebagai pewarna hijau alami
untuk makanan. Daun suji memberikan warna hijau yang lebih pekat
daripada daun pandan wangi (Anonim, 2013).
Daun seringkali mengandung beberapa senyawa yang berwarna
(pigmen) antara lain klorofil (hijau), karoten (kuning) dan xantofil (kuning).
Meskipun klorofil mengandung bagian yang polar, akan tetapi secara
keseluruhan strukturnya adalah non polar, seperti hidrokarbon, sehingga
klorofil mudah larut dalam pelarut non polar seperti eter atau petroleum eter.
Ada dua jenis klorofil yaitu klorofil a dan klorofil b, yang membedakan
kedua jenis klorofil ini adalah adanya gugus aldehid pada struktur klorofil b
yang menyebabkan klorofil b ini bersifat sedikit lebih polar dibandingkan
klorofil a (Anonim, 2013).
Pada pemisahan ekstrak daun pandan suji ini menggunakan adsorben
CaCO3 yang merupakan fasa diam yang bersifat polar dan fasa gerak/eluen
yang digunakan yaitu aseton yang bersifat nonpolar. Pemilihan fase gerak
ditentukan oleh kompetisi antara molekul zat terlarut dan molekul eluen
untuik sebuah tempat pada permukaan adsorbent. Parameter eluen zat
terlarut mencerminkan bebas energy untuk kesetimbangan adsorbs-desorpsi
(Khopkar, 1990).
Pemisahan kolom adsorbsi didasarkan pada adsorbsi komponen
campuran asimilasi berbeda-beda terhadap permukaan fase diam. Pada
kromatografi adsorbsi, besarnya koefesiensi distribusi sama dengan
konsentrasi zat terlarut pada fase konsentrasi pada fase larutan.
Ketergantungan jumlah zat terlarut yang teradsorbsi terhadap konsentrasi zat
terlarut dalam larutan dengan isoterm adsorbsi langsung (anonim, 2013).
Selanjutnya yaitu memasukkan kertas saring diatas permukaan
adsorben. Setelah itu memasukkan ekstrak daun pandan suji diatas kertas
saring tersebut dengan menggunakan pipet. Fungsi dari kertas saring yang
dimasukkan diatas permukaan adsorben yaitu agar permukaan bubur dari
CaCO3 tidak rusak pada saat dimasukkan ekstrak daun suji. Selanjutnya
memasukkan fasa gerak kedalam kolom agar kolom tidak kering.
Proses eluen mengelusi dalam komponen-komponennya yaitu sampel
Dituangkan melalui dinding kolom secara melingkar dan dibiarkan mengalir
ke dalam Adsorben. Komponen-komponen dalam campuran diadsorbsi dan
larutan sesuatu atau secara kuantitatif oleh bahan penyerap berupa pita
sempit pada permukaan atas kolom. Dengan penambahan pelarut secara
terus menerus, masing-masing komponen akan bergerak turun melalui
kolom dan pada bagian atas kolom akan terjadi kesetimbangan baru antara
bahan penyerap, komponen dengan lainnya bergerak ke bagian bawah
kolom dengan waktu dan kecepatan berbeda-beda sehingga terjadi
pemisahan (Anonim, 2013).
Selanjutnya yaitu mengamati pita-pita warna yang dihasilkan dari
pemisahan ekstrak daun pandan suji. Pita-pita warna yang dihasuilakn
ditampung pada tempat yang berbeda. Adapun proses eluen mengelusi
sampel yaitu dengan cara mengalir fasa gerak di sepanjang kolom dengan
memanfaatkan gaya gravitasi. Dengan mengalirkan pelarut lebih lanjut,
dengan atau tanpa tekanan udara, masing-masing zat bergerak turun dengan
kecepatan khas hingga terjadi pemisahan dalam kolom yang disebut
kromatogram. Kecepatan bergerak zat dipengaruhi oleh beberapa faktor
misalnya daya serap zat penyerap, sifat pelarut dan suhu dari system
kromatografi. Jika dikehendaki pemisahan beberapa zat khasiat dapat
dilakukan dengan mengalirkan selanjutnya pelarut yang sama atau pelarut
lain yang mempunya daya elusi yang kuat.
Pada percobaan ini kolom yang digunakan untuk memisahakan ekstrak
daun pandan suji memiliki panjang 7 cm dan diameter 1,8 cm dan laju elusi
0,9 mL/menit. Pada saat fasa gerak mengalir sepanjang kolom terjadi
kesetimbangan dinamis antara komponen yang terlarut pada fasa gerak,
dengan komponen yang terdapat pada fasa diam tetapan kesetimbangan
disebut koefisien distribusi. Jika harga Koefisien distribusi besar maka
populasi komponen di dalam fasa diam lebih besar dari pada dalam fasa
gerak, yang berarti komponen- komponen tersebut menghabiskan waktunya
lebih banyak dari fasa diam. Keefektifan proses suatu kolom dalam
memisahkan campuran dari komponen-komponennya tergantung pada laju
migrasi komponen, yang berhubungan erat dengan koefisien distribusi
komponen di antara kedua fasa. Laju migrasi komponen ditentukan oleh :
1. Laju alir gas pembawa
2. Perbandingan volume fasa diam terhadap fasa gerak

3. Koefisien distribusi

Adapun sayarat fase gerak dan fase diam yang digunakan yaitu: untuk
fase gerak yaitu Murni, jernih, viskositasnya rendah, tidak bereaksi dengan
zat pengotor dan dapat melarutkan sampel. Sedangkan fase diamnya adalah
bersifat selektif dan mempunyai daya serap yang tinggi (Anonim, 2013).

III. Pemisahan ion Cr(III) dan Cr(VI)

Pelarut yang mampu menjalankan elusi terlalu cepat tidak akan
mampu mengadakan pemisahan yang sempurna. Pada pemisahan ini
adsorben yang digunakan yaitu alumina. Hal ini disebabkan karena alumina
merupakan salah satu fasa diam yang memiliki daya serap dan kereaktifan
yang dapat diatur dengan cepat sehingga dapat menghasilkan hasil yang
lebih baik (Anonim, 2013).

Pada proses pemisahan ion Cr (III) dan Cr(VI) digunakan 2 jenis eluen
yang berbeda. Dimana untuk mengelusi Cr(III) digunakan eluen HNO3
sedangkan untuk Cr(VI) digunakan eluen NH4OH. Hal ini disebabkan
karena setiap komponen yang akan dipisahkan memiliki sifat yang berbeda-
beda sehingga eluen yang digunakan juga harus berbeda. Disesuaikan
dengan komponen yang akan dipisahkan.
Pertama yaitu memasukkan kertas saring kedalam klom yang berisi
adsorben alumina yang telah dipadatkan. Setelah itu memasukkan sampel
ion Cr(III) dan Cr(VI) kedalam kolom dengan menggunakan pipet tetes.
Selanjutnya yaitu menaglirkan fasa gerak kedalam kolom yang telah berisi
sampel yang akan dipisahkan. Pembentukan zona pada kromatografi kolom,
haruslah sedemikian rupa sehingga bagian suatu zat dari zat yang sama
meninggalkan fase diam pada berbagai waktu yang berbeda. Pertama-tama
cuplikan yang akan dipisahkan tergantung pada konsentrasi dan afinitasnya
akan diabsorpsikan secara bolak-balik (Reversibel) dalam lapisan adsorbsi
bagian atas. Dengan penambahan fase yang bergerak ke bagian yang kurang
kuat terikat seluruhnya atau bertahap akan larut kembali dari permukaan
adsorbsi. Akan terjadi kesetimbangan antara bagian zat yang diadsorbsi dan
bagian yang terlarut.
Hasil pemisahan di antaranya dipengaruhi oleh pemilihan terhadap
bahwa fase yang digunakan. Fase diam (adsorbsi) harus berukuran partikel
seragam, bersifat inert terhadap zat uji dan cukup aktif. Sehingga
memungkinkan perambatan zat uji. Adanya zat pengukur dapat
menyebabkan adsorbsi tidak reversibel atau talling pada senyawa yang akan
dipisahkan. Pemisahan yang lebih baik akan diperoleh dengan mengolah
terlebih dahulu adorben dengan suatu senyawa yang dapat teradsorbsi kuat
sebagai dasar digunakan adorben yang polaritasnya dengan zat uji.
 Adapun sayarat fase gerak dan fase diam yang digunakan yaitu:
a. Fase gerak
1. Murni
2. Jernih
3. Viskositasnya rendah
4. Tidak bereaksi dengan zat pengotor
5. Dapat melarutkan sampel
b. Fase diam
1. Bersifat selektif
2. Mempunyai daya serat yang tinggi

Setelah beberapa saat maka ion Cr(III) dan Cr(VI) akan terpisah dari
campurannya dan akan akan dtampung pada tempat ynag bebrbeda. Setelah
itu melakuakn uji spesifik, dimana uji spesifik pereaksi Pb(NO 3)2 untuk
Cr(VI), setelah ditambahkan perekais spesifik maka terbentuk endapan
kuning yang merupakan padatan PbCrO4 sedangkan pereaksi NaOH untuk
Cr(III) terbentuk endapan putih yang merupakan Cr(OH)3.

VII. Kesimpulan

Berdasarkan tujuan dan hasil pengamtan dapat disimpulkan sebagai

berikut :

1. Pigemen/komponen - komponen dari ekstark daun pandan suji

diperoleh :

a. Komponen I

Berwaarna kuning kehijauan (++++)

b. Komponen II

Berwarna kuning kehijauan (+++)

c. Komponen III
 Berwarna kuning kehiajuan (++)

d. Komponen IV

Berwarna kuning kehijauan (+)

2. Pada proses pemisahan Cr(VI) menggunakan eluen larutan NH 4OH

dengan pereaksi spesifik Pb(NO3)2 dan diperoleh hasil terbentuk
endapan kuning.

Proses pemisahan Cr(III) memasukkan eluen larutan HNO3 dengan

pereaksi spesifik larutan NaOH dan diperoleh endapan berwarna putih.

DAFTAR PUSTAKA

Anonim A. 2013. Kelabihan dan Kekurangan. http://rafaeljosephhimawan

.blogspot .com/ kromatografi-kolom-dan-kromatografi.html (Diakses 19
Mei 2013).

Anonim B. 2013.Kromatografi Kolom. http://jejaringkimia.blogspot .com/

Kromatografi Kolom /kromatografi.html (Diakses 19 Mei 2013).

Staf Pengajara Pemisahan Analitik. 2013. Penuntun Praktikuk Dasar-Dasar

Pemisahan Analitik. Palu: Universitas Tadulako.
Svehla, G. 1979. Vogel Buku Teks Analisis Anorganik Kualitatif Makro dan Semi
Mikro Jilid 1 Edisi Kelima. PT. Kalman Media Pustaka. Jakarta.