UJI PIROGEN

I. Tujuan
Untuk mengetahui adanya pirogen hidup atau atau yang mempunyai daya
hidup di dalam suatu sediaan steril.

II. Prinsip
Uji LAL
Uji LAL merupakan pengujian untuk memperkirakan konsentrasi
endotoksin bakteri yang mungkin ada dalam contoh bahan. Pengujian ini
pada prinsipnya merupakan koagulasi protein yang ada dalam reagensia
LAL oleh endotoksin. Pengujian tersebut ialah dinyatakan positif apabila
terjadi pembentukan gel dan dinyatakan negatip bila tidak terjadi
pembentukan gel. Pembentukan gel akan terjadi apabila kandungan
endotoksin dalam contoh sediaan lebih besar daripada sensitivitas reagen
yang dinyatakan dalam Endotoksin Unit per ml (EU/ml) atau ng/ml
(Aulton, Michael, 2010).

III. Teori
Pirogen berasal dari kata pyro yang artinya keadaan yang
berhubungan dengan panas, dan kata gen yang artinya membentuk atau
menghasilkan. Pirogen adalah suatu produk mikroorganisme, terutama
dari bakteri gram negatif. Pirogen adalah senyawa dengan berat molekul
tinggi yang dinyatakan sebagai senyawa lipopolisakarida yang diproduksi
oleh kira-kira 5-10% massa total bakteri. Pirogen ini merupakan senyawa
yang jika masuk ke dalam aliran darah akan mempengaruhi suhu tubuh
dan biasanya menghasilkan demam. Pengobatan demam yang disebabkan
oleh pirogen sangat sulit dan pada beberapa kasus dapat menyebabkan
kematian. Pirogen berasal dari kelompok senyawa yang luas, meliputi
endotoksin (LPS). Endotoksin adalah suatu molekul yang berasal dari
membran luar bakteri gram negatif. Organisme gram negatif membawa 3-
4 juta LPS pada permukaannya yang meliputi 75% permukaan membran
luar (Usman, 1988).
Pirogen merupakan substansi yang mampu menyebabkan demam
dan sering mencemari sediaan farmasi. Sampai saat ini, substansi
pirogenik yang diketahui paling aktif dan paling sering mencemari sediaan
farmasi adalah endoktoksin, selain itu masih banyak substansi pirogenik
lainnya seperti bakteri, fungi, DNA–RNA virus, protein, polipeptida dan
lain. Endotoksin merupakan suatu produk mikroorganisme terutama dari
bakteri gram negatif yang terdiri atas suatu senyawa kompleks
lipopolysakarida yang pyrogenic, suatu protein dan suatu lipid yang inert.
Pada saat ini endoktoksin diketahui merupakan pirogen yang paling kuat,
namun kehadiran pirogen lain dalam suatu sediaan perlu diperhitungkan
karena manusia tidak hanya dipengaruhi endoktoksin saja tetapi juga
pirogen yang lain (Lucas, 2006).
Sifat-sifat pirogen adalah termostabil, sehingga hanya dapat
dihilangkan dengan pemanasan pada suhu 650C selama 1 menit, 2500C
selama 15 menit atau 1800C selama 4 jam, larut dalam air sehingga tidak
bisa memakai penyaring bakteri, tidak dipengaruhi oleh bakterisida yang
biasa dan tidak menguap, destilasi biasa ada yang ikut bersama percikan
air serta berat molekul (BM) antara 15.000-4.000.000. Pirogen
dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu pirogen endogen dan pirogen
eksogen. Pirogen endogen yaitu faktor-faktor yang berasal dari dalam
tubuh kita sendiri sebagai reaksi kekebalan melawan kuman penyakit yang
masuk ke tubuh. Misalnya interleukin-1 (IL-1), interleukin-6(IL-6), alpha-
interferon, dan (TNF) tumor necrosis factor (Sudjadi, 2008).
Pirogen eksogen yaitu faktor eksternal tubuh yang menyebabkan
gangguan pada fungsi tubuh manusia. Misalnya bagian dari sel bakteri dan
virus. Selain itu, bisa juga berupa zat racun (toksin) yang dihasilkan oleh
bakteri atau virus tertentu. Jika suatu pirogen masuk ke tubuh, maka
pirogen menjadi suatu benda asing yang dapat menimbulkan respon imun
berupa demam. Demam yaitu suatu keadaan ketika temperatur tubuh di
atas batas normal yang dapat disebabkan oleh kelainan dalam otak sendiri
atau oleh bahan-bahan toksik yang mempengaruhi pusat pengaturan
temperatur. Penyebab-penyebab tersebut meliputi penyakit bakteri, tumor
otak, dan keadaan lingkungan yang dapat berakhir dengan serangan panas.
Pada manusia reaksi pyrogenic dimanifestasikan dengan demam dan
menggigil. Setelah di injeksikan sekitar 45-90 menit, kemudian terjadi
kenaikan suhu tubuh, diikuti dengan menggigil, sakit kepala dan malaise.
Dingin berlangsung 10 sampai 20 menit dan mencapai puncaknya pada
jam kedua atau ketiga. Biasanya efeknya dapat dikontrol dengan
pemberian obat antypiretic, tetapi dapat dibayangkan bahwa kenaikan
suhu pada pasien yang sakit dapat memiliki konsekuensi yang parah pada
penyakitnya. Ketika pirogen memang terjadi dalam produk parenteral,
mereka datang dari salah satu dari tiga sumber yaitu air yang digunakan
sebagai pelarut, wadah dengan larutan yang telah datang ke kontak selama
persiapan, pengemasan, penyimpanan, atau administrasi, atau bahan kimia
yang digunakan dalam persiapan dari larutan (James, 2008).
Metode LAL merupakan pengujian in-vitro, maka mulailah
perusahaan-perusahaan melihat kemungkinan untuk menggantikan uji
pirogenitas kelinci dengan metode LAL. Mulai saat itu muncullah
argumentasi-argumentasi sebagai akibat perbandingan antara uji kelinci
dan uji LAL. Sebagian menyatakan keuntungan-keuntungan menggunakan
uji LAL dan kerugian-kerugian uji kelinci. Dilain pihak ingin
mempertahankan kelinci dalam melakukan pengujian pirogenitas suatu
sediaan. Uji pirogenitas menggunakan kelinci pertama kali diperkenalkan
oleh Hort dan Penfold pada tahun 1911. Dalam percobaan mereka dengan
kelinci didapatkan hasil bahwa faktor terkait yang menyebabkan
peningkatan temperature pada kelinci yaitu setelah penginjeksian ekstrak
kultur bakteri, sedangkan dengan larutan steril bebas dari endotoksin tidak
menyebabkan efek samping terebut. Kelinci digunakan sebagai model uji
pirogen dikarenakan kelinci menghasilkan respons fisiologi yang serupa
dengan manusia terhadap pirogen. Griesman dan Hornick menunjukkan
bahwa kelinci dan manusia menghasilkan respon yang sama terhadap
kuantitas nanogram/kilogram dari pirogen. Untuk uji tersebut digunakan
kelinci dewasa sehat yang ditempatkan masing-masing satu kelinci dalam
satu kandang pada suhu 20-23 dan bebas dari gangguan yang
menimbulakan kegelisahan. Untuk kelinci yang belum pernah digunakan
untuk uji pirogen, adaptasikan kelinci tidak lebih drai 7 hari dengan uji
pendahuluan yang me;iputi tahap pengujian yang tertera pada prosedur,
kecuali penyuntikan. Kelinci tidak boleh digunakan untukuji pirogen lebih
dari sekali dalam waktu 48 jam atau sebelum 2 minggu setelah digunakan
untuk uji pirogen bila menunjukkan kenaikan suhu maksimum 0, 60 atau
lebih, atau bila setelah digunakan untuk melakukan uji sediaan uji yang
mengandung pirogen (Donacki, 2004).
IV. Daftar Pustaka

Aulton, Michael. 2010. Pharmaceutical Practice. Oritic Livingston:

London, New York

Donacki, Nanci. 2004. Aseptic techniques used by Cell Culture specialists

in handling products from and/or mammalian cells. http://protocol-
online.org (Diakses pada 5 December 2015)

James, Daniel E. 2008. Nine Safe Practices for the Microbiology

Laboratory Carolina Biological Supply, Burlington, NC.John C. Schof
ield, B.V.Sc., M.R.C.V.S. Essentials for Animal Research: A Primer for
Research Personnel: Principles of Aseptic Technique.
http://www.unmc.edu/Education (Diakses pada 5 December 2015)

Lucas, S. 2006. Formulasi Steril. Yogyakarta : Penerbit Andi

Sudjadi, Harman. 2008. Bioteknologi Kesehatan. Yogyakarta : Penerbit

Kanisius

Usman, Suwandi. 1988. Uji Pirogenitas dengan Kelinci dan Limulus

Amebocyt Lysate, Cermin Dunia Kedokteran No. 52