NAMA :MAIZUN SOPIAN

NIM :B181018
PRODI : ANALIS KESEHATAN
Pewarnaan Gram
Gram
Meskipun lebih dari satu abad telah berlalu sejak Gram menjelaskan tekniknya pada tahun 1884,
alasan kimianya masih belum jelas. Ini mungkin karena campuran faktor, yang paling penting
adalah peningkatan ketebalan, komposisi kimia, dan integritas fungsional dinding sel bakteri
Gram-positif. Ketika bakteri ini mati, mereka menjadi Gram negatif. Prosedur berikut ini hanya
cocok untuk demonstrasi bakteri pada apusan nanah dan dahak. Ini mungkin bermanfaat bagi
ahli patologi di ruang nekropsi di mana teknik cepat seperti ini memungkinkan identifikasi cepat
organisme yang menyebabkan abses paru, infeksi luka, abses septikemia atau meningitis.
Metode Gram untuk bakteri dalam apusan (Gram 1884) Metode 1. Memperbaiki film
kering dengan melewatkannya tiga kali melalui
nyala api atau menempatkan pada blok panas. 2. Noda selama 15 detik dalam kristal
violet 1% atau metil
violet, lalu tuangkan sisa. 3. Banjir selama 30 detik dengan yodium Lugol, tuangkan
kelebihannya. 4. Banjir dengan aseton tidak lebih dari 2-5 detik,
segera cuci dengan air. 5. Atau decolorize dengan alkohol sampai tidak ada lagi
noda yang keluar. Cuci dengan air. 6. Hitung mundur selama 20 detik dengan encer
carbol
fuchsin, atau merah netral yang baru disaring selama 1-2 menit. 7. Cuci dengan air dan
bersihkan dengan hati-hati sampai
kering.
Hasil Organisme Gram-positif biru-hitam Organisme Gram-negatif merah
Solusi Larutan kristal violet (tersedia secara komersial) Kristal violet, alkohol 10% 2 ml
Air suling 18 ml Amonium oksalat, 1% 80 ml Campur dan simpan; selalu saring
sebelum digunakan.
Yodium Gram termodifikasi yang tersedia secara komersial, atau Yodium 2 g Kalium
iodida 4 g Air suling 400 ml
Larutkan kalium iodida ke dalam sejumlah kecil air suling, tambahkan yodium dan
larutkan; tambahkan sisa air suling.
Etil alkohol-aseton Etil alkohol, absolut 50 ml Aseton 50 ml
larutan fuchsin dasar (stok) tersedia secara komersial, atau Fuchsin dasar atau
pararosanilin 0,5 g Air suling 100 ml
Larutkan dengan bantuan panas dan pengaduk magnetik.
Larutan fuchsin dasar (berfungsi) Larutan fuchsin dasar (stok) 10 ml Air suling 40 ml
Asam pikrat-aseton Asam pikrat 0,1 g Aseton 100 ml
Catatan Dengan kekhawatiran tentang meledaknya asam pikrat kering di laboratorium,
Anda disarankan untuk membeli larutan asam asetat pikrat yang dibuat sebelumnya. Ini
tersedia melalui sebagian besar pemasok histologi.
Larutan aseton-xilena Aseton 50 ml Xilena 50 ml
Metode
1. pewarnaanDeparininisasi dan rehidrasi melaluibertingkat
alkoholmenjadi air suling.
2. Noda dengan larutan kristal violet yang disaring, 1 menit.
3. Bilas dengan baik dalam air suling.
Metode Brown-Brenn yang dimodifikasi untuk bakteri Gram-positif dan Gram-
negatif di bagian parafin (Churukian &
4. Larutan yodium, 1 menit.
5. Bilas dalam air suling, blot slide tetapi BUKAN bagian
jaringan. Schenk 1982)
6. Dihilangkan warna oleh celupkan dalam larutan alkohol-aseton Bagian
sampai warna biru berhenti berjalan. (Satu sampai dua Formalin-tetap, 4-5 m, parafin-
embedded bagian.
Dips hanya!)
15 Mikroorganisme
7. counterstain dalam bekerja fuchsin dasar selama
1 menit. Pastikan untuk menggerakkan slide dengan baik di fuchsin dasar sebelum
memulai timer.
8. Bilas dalam air suling dan geser noda tetapi tidak
bagian.
9. Celupkan dalam aseton, satu celup.
10. Celupkan asam asetat pikrat sampai bagian-bagiannya
berwarna merah muda kekuningan.
11. Celupkan beberapa kali dalam larutan aseton-xilena. Pada
titik ini, periksa kontrol untuk diferensiasi yang tepat. (Kembali ke picric acid-acetone
jika Anda membutuhkan lebih banyak diferensiasi.)
12. Bersihkan xylene dan pasang.
Hasil Organisme Gram-positif, fibrin, beberapa jamur,
butiran sel Paneth, keratohyalin, dankeratin
pewarnaan Gram-Twort (Twort 1924; Ollett 1947) Bagian Formalin tetap, parafin.
Solusi Larutan kristal violet (lihat metode sebelumnya) Iodium Gram (lihat solusi
sebelumnya) Pewarnaan twort 1% netral merah dalam etanol 9 ml 0,2% hijau cepat
dalam etanol 1 ml Air suling 30 ml
Campur segera sebelum digunakan.
Metode
1. Deparaffinisasi dan rehidrasi melaluibertingkat
alkoholmenjadi air suling.
2. Noda dalam larutan kristal violet, 3 menit.
3. Bilas dengan air keran yang mengalir dengan lembut.
4. Rawat dengan yodium Gram, 3 menit.
5. Bilas dengan air ledeng, keringkan, dan keringkan sepenuhnya
di tempat yang hangat.
biru
Organisme Gram-negatif merah Nukleus merah Unsur-unsur jaringan lainnya kuning
Pastikan Anda tidak membiarkan bagian-bagian jaringan mengering pada titik mana
pun dalam proses pewarnaan. Jika ini terjadi setelah perawatan dengan yodium,
dekolorisasi akan sulit dan tidak merata.
6. Bedakan alkohol asetat yang dipanaskan terlebih dahulu sampai tidak ada
lagi warna yang tersembur (asam asetat 2% dalam alkohol absolut, dipanaskan sampai
56 ° C). Ini mungkin memakan waktu 15-20 menit; bagian tersebut harus berwarna
coklat muda atau jerami.
7. Bilas sebentar dalam air suling.
8. Noda dalam Twort, 5 menit.
9. Cuci dalam air suling.
10. Bilas dalam alkohol asetat sampai tidak ada lagi yang kehabisan bagian; ini hanya
membutuhkan beberapa detik.
11. Bilas dengan alkohol absolut segar, bening, dan pasang.
Hasil Organisme Gram-positif biru-hitam Organisme Gram-negatif pink-merah Nukleus
merah Sel darah merah dan sebagian besarsitoplasma
struktur
hijau
Serat elastis hitam
Teknik untuk mikobakteri
Organisme ini sulit untuk ditunjukkan dengan teknik Gram karena memiliki kapsul yang
mengandung kapsul. asam lemak rantai panjang (asam mikolik) yang membuatnya hidrofobik.
Kapsul lemak mempengaruhi penetrasi dan ketahanan terhadap penghilangan noda oleh asam
dan alkohol (tahan asam dan alkohol), dan sangat kuat antara berbagai spesies yang membentuk
kelompok ini. Asam fenolik, dan seringkali panas, digunakan untuk mengurangi tegangan
 permukaan dan meningkatkan porositas, sehingga memaksa pewarna menembus kapsul ini.
Kecepatan menghilangkan pewarna primer dengan diferensiasi dengan alkohol asam sebanding
dengan tingkat mantel lemak. Menghindari zat penghilang lemak, atau pelarut, seperti alkohol
dan xylene, dalam metode untuk Mycobacterium leprae, adalah upaya untuk melestarikan kapsul
lemak yang rapuh ini.
Mycobacteria adalah PAS positif karena kandungan karbo- hidrat dinding sel mereka. Namun,
kepositifan ini hanya terbukti ketika konsentrasi besar mikroorganisme hadir. Ketika organisme-
organisme ini mati, mereka kehilangan kapsul berlemak mereka dan akibatnya positif carbol
fuchsin mereka. Hidrat carbo- masih bisa ditunjukkan oleh reaksi methenamine perak Grocott,
yangdapatmembuktikan
Teknik untuk mikobakterium 29berguna ketika prosedur counterstaining
asam-cepatkarena organisme
gagal, terutama jika yang
pasien
telah menerima terapi untuk TB. sedikit dapat dengan mudah dikaburkan. b.
Sumber kontaminasi asam-cepat mungkin ditemukan Dekalsifikasi menggunakan asam kuat
tumbuh dalam bahan kental kadang-kadang melapisi keran dapat menghancurkan tahan asam; asam
air dan setiap tabung karet yang terhubung dengannya. format direkomendasikan. c. Victoria blue
Organisme ini bersifat asam dan alkohol cepat tetapi dapat digantikan dengan carbol fuchsin
dan picric acid untuk counterstain jika buta
biasanya mudah diidentifikasi sebagai kontaminan dengan
warna
penampilan mereka sebagai rumpun, atau floaters, di atas menyebabkan masalah pengenalan.
bidang fokus mikroskopis dari bagian tersebut.

Solusi Carbol fuchsin tersedia secara komersial,

Ziehl-Neelsen (ZN) pewarnaan untuk
Mycobacterium bacilli (Kinyoun 1915)
Bagian Formalin atau fiksatif selain Carnoy's,
paraffin.
Hasil Mikobakteri, poros rambut, badan
Russell, imunoglobulin Splendore-Hoeppli
di sekitar actinomyces, dan beberapa
organisme jamur
merah
merah
atau Basic fuchsin 0,5 g Alkohol absolut 5 ml 5%
fenol encer 100 ml
Aduk rata dan saring sebelum
digunakan.
Alkohol asam Asam klorida 10 ml 70% alkohol 1000
ml Larutan metilen biru (stok) tersedia secara
komersial, atau Metilen biru 1,4 g 95% alkohol 100
ml
Larutan biru metilen (bekerja) Metilen biru (stok) 10
ml Air keran 90 ml

Metode 1. Deparaffinize dan rehidrasi

Latar belakang biru pucat Catatan
a. Counterstain biru mungkin tidak merata
jika ada caseasi luas. Perawatan harus
diambil untuk menghindari over-
melaluibertingkat
alkoholmenjadi air suling. 2. Solusi carbol
fuchsin, 30 menit. 3. Cuci dengan air keran. 4.
Bedakan alkohol asam hingga larutan
berwarnapucat
merah muda. (Ini biasanya hanya
 membutuhkan 2-5 dips.) 5. Cuci dalam air xylene untuk M. leprae). 2. Tuang di atas
keran selama 8 menit, lalu celupkan ke dalampemanasan sebelumnya (60 ° C), larutan
pewarnaan
air suling. 6. Counterstain dalam larutan biru disaring,
metilen 10 menit. 3. Cuci dengan air keran. 4.
hingga bagian berwarna biru pucat. 7. Bedakan 0,5% asam klorida dalam alkohol
Bilas dengan air ledeng, lalu celupkan ke untuk M. tuberculosis, atau 0,5% asam klorida
dalam air suling. 8. Dehidrasi, bersihkan, dan
encer untuk M. leprae. 5. Cuci dalam air keran, 2
pasang. menit. 6. Hilangkan fluoresensi latar belakang
Metode neon untuk Mycobacterium basil dalam 0,5%
(Kuper& Mei1960) kalium permanganat, 2 menit. 7. Cuci
Bagian Formalin tetap, dalam air keran dan keringkan. 8. Dehidrasi
parafin. (bukan untuk M. leprae), bersihkan, dan
pasang di mountant bebas
Larutan Auramin O 1,5 g Rhodamine B 0,75 g
fluoresensi.
Gliserol 75 ml Kristal fenol (dicairkan pada 50 ° C)
10 ml Air suling 50 ml Hasil Mycobacteria kuning keemasan
(menggunakan fluoresensi cahaya biru di bawah
Metode 1. Deparaffinize (1 bagian minyak
530 nm) Latar belakang hijau gelap
kacang tanah dan 2 bagian

15 298 Mikroorganisme Catatan

7. Cuci dalam air keran yang hangat dan mengalir selama 5 menit. Keuntungan dari
peningkatan sensitivitas ini
8. Counterstain dalam warna biru metilen, satu teknik diimbangi dengan ketidaknyamanan
pengaturan
quick dip. (Bagian harus biru pucat.) Mikroskop fluoresensi. Persiapan memudar lebih dari
9. Cuci dalam air keran yang hangat dan mengalir selama 5 menit. waktu, sebagai akibat
dari paparan sinar UV.
10. Sobek bagian dan keringkan dalam oven 50–55 ° C selama 5
menit. 11. Setelah kering, satu celupan cepat dalam xylene.
Metode Modifikasi Fite untuk M. leprae dan Nocardia
12. Pasang dengan mountant permanen. Fiksasi formalin buffered netral 10% (NBF).
Hasil Lihat Gambar 15.1 basil tahan asam termasuk M. leprae merah cerah Bagian
Nukleus dan elemen jaringan lainnya berwarna biru pucat Parafin pada 4-5 μm.
Kontrol kualitas / catatan Solusi
Berhati-hatilah untuk tidak berlebihan dengan metilen biru dan larutan Carbol fuchsin tersedia
secara komersial, atau
jangan biarkan bagian kering antara karbol fuchsin 0,5 g fuchsin dasar dilarutkan dalam 5 mlabsolut
alkoholdan asam. alkohol; tambahkan 100 ml fenol berair 5%. Aduk rata dan saring sebelum
digunakan. Saring sebelum digunakan dengan kertas saring # 1.
Metode Cresyl violet acetate untuk Helicobacter sp. 5% asam sulfat dalam
alkohol 25% etanol 25% Asam sulfat, pekat 95 ml
5 ml
Bagian Formalin difiksasi, parafin.
Metilen biru (stok)komersial
Metode
tersedia, atau
1. Deparaffinize dan rehydrate melalui metilen biru 1,4 gbergradasi
alkoholmenjadi air suling. 95% alkohol 100 ml
2. Saring 0,1% cresyl violet acetate ke slide atau ke dalam
wadah Coplin, 5 menit.
Metilen biru, berfungsi
3. Bilas dengan air suling. Stok metilen biru 5 ml
4. Blot, dehidrasi cepat dalam alkohol, jernih, dan tingkatkan. Air keran 45 ml
Xylene-minyak kacang 1 bagian minyak: 2 bagian xylene
Metode
1. Deparaffinize dalam dua perubahan minyak xylene-kacang,
masing-masing 6 menit. 2. Tiriskan slide secara vertikal di atas tisu dan cuci
dengan air hangat yang mengalir selama 3 menit. (Minyak residu menjaga bagian
dan membantu menonjolkan luntur asam basil.) 3. Noda dalam carbol fuchsin pada suhu
kamar selama 25 menit. (Solusi dapat dituangkan kembali ke dalam botol dan digunakan kembali).
4. Cuci dalam air keran yang hangat dan mengalir selama 3 menit. 5. Kuras kelebihan air dari
slide secara vertikal di atas
tisu. 6. Dekolorisasi dengan asam sulfat 5% dalam alkohol 25%, dua perubahan masing-masing
90 detik. (Bagian harus berwarna merah muda pucat.)
Gambar 15.1 Prosedur Fite yang dimodifikasi diperlukan untuk menunjukkan Mycobacterium
leprae karena kapsul organisme yang rapuh dan berlemak.
Teknik untuk mikobakteri 299
Hasil Helicobacter dan nuklei biru-ungu Warna latar belakang biru-ungu
Catatan Metode sederhana ini memungkinkan diferensiasi Helicobacter sp. dari organisme lain.
Metode Gimenez untuk Helicobacter pylori (Gimenez 1964; McMullen et al. 1987) Bagian
Formalin diperbaiki, parafin.
Solusi Larutan penyangga (buffer fosfat pada pH 7,5, atau 0,1 M) 0,1 M natrium dihidrogen
ortofosfat 3,5 ml 0,1 M disodium hidrogen ortofosfat 15,5 ml
Stok karbol fuchsin Noda basil tahan asam komersial dingin,
atau basa fuchsin dasar
Catatan Masalah terbesar dengan metode ini adalah overstaining atau penyimpangan
pewarnaan, dengan hijau Malachite. Berharga dalam mendemonstrasikan Legionella
bacillusdalam apusan paru postmortem.
Toluidine biru dalam buffer Sorenson untuk Helicobacter Sections Formalin tetap, parafin.
Larutan Toluidine biru dalam pH 6,8 buffer fosfat buffer fosfat Sorenson, pH 6,8 50 ml 1% toluidine
biru 1 ml
Metode 1. Deparaffinize dan rehydrate melaluibertingkat
alkoholke air suling. 2. Noda dalam toluidine biru buffer, 20 menit.
1g
3. Cuci dengan baik dalam air suling. 4. Dehidrasi, bersihkan, dan pasang.
Alkohol absolut 10 ml
Hasil 5% fenol encer 10 ml
Helicobacter biru tua terhadap Saringan yang bervariasi sebelum digunakan.
latar belakang biru
Karbol fuchsin yang berfungsi Penyangga fosfat 10 ml Stok karbol fuchsin 4 ml
Metode Warthin-Starry untuk spirochetes (Warthin & Starry
Filtersebelum digunakan.
1920)
Hijau malachite Hijau malachite
0.8 0.8
Formalin tetap, parafin.
Air suling 100 ml
Solusi
Metode
Buffer asetat, pH 3,6
1. Deparaffinisasi dan rehidrasi melaluibertingkat
Sodium asetat4,1 g alkohol menjadi air suling.
Asam asetat 6,25 ml 2. Noda dalam larutan carbol fuchsin, 2 menit.
Air suling 500 ml
3. Cuci dengan air keran.
1% perak nitrat dalam pH 3,6 buffer asetat 4. Noda dalam warna hijau perunggu, 15-20 detik.
Pengembang 5. Cuci bersih dalam air suling.
Larutkan 3 g hidrokuinon dalam 10 ml pH 3,6 buffer, 6. Ulangi langkah 4 dan 5 sampai bagian
berwarna biru kehijauan
dan campurkan 1 ml larutan ini dan 15 ml hangat 5% dengan mata telanjang.
Lem atau gelatin Scotch; tetap pada 40 ° C. Ambil 3 ml 2%
7. Bagian keringkan, dan keringkan sepenuhnya di udara. 8. Bersihkan dan pasang.
perak nitrat dalam larutan buffer 3,6 pH dan tetap pada 55 ° C. Campurkan kedua
solusi ini segera sebelum digunakan.
Hasil
Metode
 Helicobacter red-magenta
1. Deparaffinize dan rehydrate melalui Background bergradasibiru-hijau
alkoholmenjadi air suling.

15 300 Mikroorganisme
2. Celloidinize dalam 0,5% celloidin, tiriskan, dan mengeras dalam
air suling, 1 menit. 3. Impregnasi dalam larutan perak 55–60 ° C yang dipanaskan
(b), 90-105 menit. 4. Siapkan dan panaskan pengembang di bak air. 5. Perlakukan
dengan pengembang (solusi c) selama 31/2 menit pada 55 ° C. Bagian harus berwarna cokelat
keemasan pada saat ini. 6. Lepaskan dari pengembang dan bilas dalam air keran selama
beberapa menit pada 55-60 ° C, lalu dalam buffer pada suhu kamar. 7. Nada dalam 0,2% emas klorida.
8. Dehidrasi, bersihkan, dan pasang.
Hasil Spirochetes hitam Latar belakang emas-kuning

Catatan Adalah bijaksana untuk mengambil beberapa slide melalui berbagai waktu inkubasi

untuk memastikan pembuahan yang optimal.

Modifikasi Steiner untuk bakteri berfilamen dan non-filamen

(Steiner & Steiner 1944; Modifikasi Swisher 1987) Bagian Formalin diperbaiki, parafin.
 Solusi 1.0% uranyl nitrate tersedia secara komersial, atau Uranyl nitrate 1 g Air suling 100 ml
1% perak nitrat Perak nitrat 1 g Air suling 100 ml
Segarkan setiap kali dan saring dengan kertas saring # 1 atau # 2 sebelum digunakan.
0,04% perak nitrat Perak nitrat 0,04 g Air suling 100 ml
Dinginkan dan gunakan hanya selama 1 bulan.
2,5% gum mastic tersedia secara komersial, atau Gum mastic 2,5 g Alkohol absolut 100 ml Biarkan
larut selama 24 jam, kemudian saring sampai berwarna kuning bening sebelum digunakan.
Dinginkan bagian yang tidak terpakai untuk digunakan kembali.
2% hydroquinone Hydroquinone 1 g Air suling 25 ml Buat solusi segar untuk setiap penggunaan.

Larutan pereduksi Campur 10 ml 2,5% gum damar wangi, 25 ml hidrokuinon 2,0%, dan alkohol absolut 5 ml.

Buat sesaat sebelum digunakan dan filter dengan kertas filter # 4; tambahkan 2,5 ml perak nitrat 0,04%.

Jangan memfilter solusi ini. Ketika permen karet ditambahkan, solusinya akan terlihat seperti susu.

Metode
1. Deparaffinisasi dan rehidrasi melaluibertingkat
alkoholmenjadi air suling. 2. Sensitisasi bagian dalam uranil nitrat berair 1%
pada suhu kamar, dan tempatkan dalam oven microwave sampai larutan tepat pada titik didih, kira-kira.
20–30 detik; jangan sampai mendidih. Atau, letakkan dalam uranyl nitrat 1% yang dipanaskan pada 60 ° C
dalam bak air selama 15 menit, atau dalam oven microwave dan bawa ke titik didih - jangan sampai mendidih;
sulfat dalam 3,7% formalin dapat diganti. 3. Bilas dalam air suling pada suhu kamar sampai
residu uranil nitrat dihilangkan. 4. Tempatkan 1% perak nitrat pada suhu kamar dan microwave
sampai titik didih baru tercapai. Jangan sampai mendidih. Angkat dari oven, tutupi wadah dengan
longgar, dan diamkan dengan nitrat perak panas, 6-7 menit; alternatif,panaskan perak nitrat
selama 20-30 menit dalam 60 ° C mandi air, tambahkan slide, dan memungkinkan untuk
menghamili selama 11/2 jam. 5. Bilas dalam tiga perubahan air suling. 6. Dehidrasi dalam dua
perubahan, masing-masing alkohol 95%
dan alkohol absolut. 7. Obati dengan 2,5% gum damar wangi, 5 menit. 8. Biarkan udara kering,
5 menit. 9. Bilas dalam dua perubahan air suling. Slide
mungkin berdiri di sini sementara mengurangi solusi sedang dipersiapkan. 10. Kurangi dalam larutan reduksi
yang dipanaskan pada 45 ° C dalam
penangas air selama 10–25 menit, atau sampai bagian-bagian telah berkembang secara memuaskan dengan
mikroorganisme hitam dengan latar belakang kuning muda. Hindari latar belakang yang sangat bernoda.
11. Bilas dalam air suling untuk menghentikan reaksi.
12. Dehidrasi, bersihkan, dan pasang.
Gambar 15.2 Sifilis Treponema pallidum, basil (panah), terlihat dengan teknik Steiner yang
dimodifikasi. Resistensi terhadap pewarnaan juga dimiliki oleh Helicobacter, spirochetes,
dan Legionella.
Beberapa bakteri penting 301
Hasil Lihat Gambar 15.2 Spirochetes, organisme cakar kucing, tubuh Donovan, bakteri non-filamen
dari L. pneumophila
terjadi. Stafilokokus cenderung membentuk kelompok. Terkadang multi resistensi terhadap antibiotik.
Neisseria meningitidis (meningococcus) adalah penyebab umum dari meningitis, dan dapat
menghasilkan septikemia fulminasi. Organisme dapat dilihat pada bagian histologis meningitis
meningokokus, tetapi sulit untuk diidentifikasi karena mereka biasanya berada dalam sitoplasma ne trofil.
Neisseria gonorrhoeae (gonococcus) adalah penyebab gonore. Organisme dapat terlihat di dalam polimorf di
bagian serviks, endometrium, atau tuba Fallandia dalam kasus gonore tetapi, sekali lagi, sulit ditemukan.
Anggota Neisseria keluargaumumnya sulit untuk melihat di bagian histologis, meskipun mudah terdeteksi
dalam apusan nanah segar atau cairan serebrospinal (CSF), biasanya berpasangan. Mereka lebih mudah
dideteksi menggunakan metode Gram-Twort. coklat tua -
Lactobacillus acidophilus (basil Döderlein's) adalah hitam
penghuni normalpada vagina manusia dan terlihat pada apusan serviks yang diambil dalam fase
sekretori
Latar Belakang Kuning cerah
hingga kuning keemasan Vaginale Corynebacterium adalah basil Gram-negatif pendek yang dapat
menyebabkan servisitis, danhadir Catatan
dalam sekitar 6% dari wanita usia subur. Mungkin membawa semua solusi ke suhu kamar sebelum
digunakan.
terlihat pada apusan serviks di mana ia menumpuk karena Semua peralatan gelas yang kontak dengan
perak nitrat harus dibersihkan secara kimia. Hindari penggunaan forsep logam dalam larutan perak.
Saat melakukan skrining bakteri, kontrol Gram harus dijalankan bersama dengan slide diagnostik.
Karena spirochetes membutuhkan waktu lebih lama untuk berkembang,Gram
massa bernoda birupada permukaan sel skuamosa diwarnai dengan metode Papanicolaou,
dengan sel-sel ini dikenal sebagai 'sel petunjuk'.
Helicobacter pylori sering terlihat dalamlambung kontrolharus digunakan selainspirochete
biopsi. Organisme spiral spiral sangat tidak dapat dikendalikan. Ketika kontrol Gram diberi warna kuning
sebagai organisme yang menyebabkan banyak kasuskronis penampilan, lepaskan mereka ke air suling,
dan
gastritis. Hal ini terlihat sebagaikecil hematoxifhil lemah pemeriksaanpada mikroskop untuk
mikroorganisme. Kembali ke solusi perak jika mereka tidak siap, dan ulangi, menyadari bahwa
spirochetes akan memakan waktu lebih lama. Sebagian besar solusi dapat dibuat dalam jumlah
besar dan disimpan di lemari es.
organisme (biasanya dalam rumpun) di lumina kelenjar lambung, sering melekat pada permukaan luminal sel
latihan, ini dapat diidentifikasi dari noda H&E. Namun, Warthin-Starry, Steiner, Gimenez, toluidine blue,
atau cresyl.
Beberapa bakteri penting menggunakan
etode violet acetate yang menunjukkannya dengan lebih jelas. Antiserum spesifik komersial baru-baru
ini tersedia untuk demonstrasi mereka. Staphylococcus aureus mungkin merupakanpaling penting yang
Clostridium difficile yang menyebabkan patogen pseudomembran dari kelompok ini. Ini menyebabkan bisul,
luka dan
radang usus besar, radang usus besar. Infeksi luka bakar ini, dan suatu bentuk pneumonia kavitasi
muncul setelah pemberian yang luas pada anak-anak dan orang dewasa. Status septikemia dan
antibiotik spektrum; keseimbangan pembentukan normal beberapa abses tersebar kadang-kadang
anaerobik mikroflora usus terganggu, memungkinkan
15 302 Mikroorganisme organisme berkembang biak tak terkendali. C. difficile adalah
bakteri mungkin sulit untuk diwarnai kecuali dengan sulit untuk menodai tetapi 'lesi gunung berapi' daripurulen
Dieterledan noda perak Steiner yang termodifikasi, dan spekekrosis adalah indikator yang baik.
antiserum cific. Listeria monocytogenes adalah penyebab langka bentuk
Treponema pallidum adalah organisme yang menyebabkan syphimeningitis dan dapat menyebabkan septikemia
pada manusia.
Ini, dan jarang terlihat dalam spesimen biopsi sebagai nekrosis fokus dengan makrofag yang mengandungkecil
lesi primer yangatau 'chancre' didiagnosis batang klini-intraseluler yang diatur dalam 'huruf Cina'formal
secara. Spirochete yang cukup jelas menggunakan mation gelap, dan pewarnaan bervariasi dengan noda Gram,
tanah mikroskop, sebagai 8-13 pMberbentuk pembuka botol merupakan ciri khas penyakit ini.
mikroorganisme yang sering kinks di tengah. Diet- Mycobacterium tuberculosis tetap menjadisignifikan
patogen, Warthin-Starry, atau patogen metode Steiner yang dimodifikasi di negara-negara maju di mana yang
akrab
dapat menunjukkan organisme tersebut. Selain itu, lesi granulomatosa kaseosa spesifik danterkait
antiserum yangjuga tersedia.1–2 μm, ujung tumpul, asam-dan alkohol-cepat
Leptospira interrogans adalah organisme yang menyebabkan lep- masih dapat dilihat. Di Afrika dan
negara-negara lain, ini
tospirosis atau penyakit Weil. Ini adalah karakter penyakit - organisme telah mengembangkan hubungan
oportunistik
oleh spirochetes, dan menyebar dalam urin tikus yang mengidap AIDS, di mana ia merupakan penyebab
utama kematian.
dan anjing-anjing, yang menyebabkan demam, penyakit kuning yang dalam, dan Mycobacterium
avium / intracellulare merupakan
kematian yang terkadang. Spirochetes dapat dilihat dalam kumpulan kelompokoportunistik intraseluler
fase akutdari penyakit di mana mereka muncul pada mikobakteri yang sering ditemukan padakemudian
Warthin-Starrydan teknik Steiner yang dimodifikasi sebagai tahapan imunosupresi, terutama yang memiliki
13 tekananmmmikroorganisme dengandengan keriting yang terkait dengan AIDS. Mereka sering bertahan
pada
ujung menyerupai penjahat gembala. terlepas dari perawatan, dan seringkali mematikan. Lesi-lesi
usus Spirochetosismuncul sebagai infas yang diproduksi secara besar-besaran dan terdiri dari pengumpulan
pada batas luminal usus besar dengan spirochete dari makrofag yangyang sering mengandung
mengalami vakumBrachyspira aalborgi (Tomkins et al. 1986). Ini mengukur sejumlah besar organisme.
Kadang-kadang, ada
2–6 μm panjang, sangat melingkar, dan diatur bukti kuat dari reaksi seluler pada H & E-
dikular ke permukaan luminal usus, memberikan bagian bernoda, dan organisme hanya terdeteksi
mantel hematoksifilis fuzzy dalam noda H&E. Di sana dengan secara rutin melakukan pewarnaanasam, seperti
tahantidak ada respon seluler terhadap keberadaan spiro-ZN ini, pada semua jaringan dari pasien AIDS.
Grup ini
chete. Itu terlihat baik dengan Warthin-Starry dan juga termasuk M. kansasii.
teknik Steiner yang dimodifikasi. Mycobacterium leprae adalah intraseluler obligat,
penyakit Gores Kucingsembuh muncul sebagai mikobakterium neurotropik lokal yangsendiri yang menyerang
dan
limfadenopati tunggal yang muncul sekitar 2 minggu menghancurkan saraf, terutama di kulit. Jaringan
setelah kucing menggaruk atau menggigit. Secara histologis reaksi simpul terhadap kusta tergantung pada status
yang menunjukkan nekrosis fokus atau mikro-abses. Dua Gram tuan rumah. Itu bisa minimal dengan beberapa
makro-
bakterinegatif (Afipia felis dan Bartonella henselae) fag yang dikemas dengan crescentic, runcing, intracyto-
telah terlibat. Karena waktu atau basil matematik (kusta lepromatosa), atau mungkin mengandung
faktor urasi dari bakteri, sulit untuk menggambarkan organisme dan menunjukkan substrat florid granulomatous
pada bagian parafin, tetapi respons yang dimodifikasi (lepra tuberkuloid). M. leprae hanya
Steiner dan metode Warthin-Starry sangat tahan asam dan sering dapat ditunjukkan denganstandar
teknikuntuk mendemonstrasikan organisme ini. teknik dard ZN.
Legionella pneumophila pertama kali diidentifikasi pada tahun 1977 sebagai penyebab pneumonia tipe sporadik
infeksi jamur yang kematiantinggi. Coccobacillus Gram-positif kecil umumnya tersebar di aerosol dari air
yang stagnan.
Fungi tersebar luas di alam, dan manusia adalah reservoir, biasanya di unit pendingin udara. Yang
secara teratur terpapar spora dari banyak spesies,
namun penyakit yang paling sering ditemui adalah mikosis superfisial yang mempengaruhi lapisan subkutan
atau terangsang dari kulit atau poros rambut, dan menyebabkan kondisi seperti kaki atlet atau kurap. Jamur
dermatofit ini termasuk dalam kelompok Microsporum dan Trichophyton dan dapat muncul sebagai ragi atau
bentuk miselia dalam keratin. Mereka terlihat cukup baik di noda H&E, tetapi ditunjukkan dengan baik dengan
noda Grocott dan PAS. Seperti infeksi lainnya, peningkatan jumlah pasien dengan sistem kekebalan yang
berkurang atau terganggu telah meningkatkan kejadian mikosis sistemik, yang memungkinkan serangan
oportunistik oleh jamur, seringkali dengan virulensi rendah, tetapi kadang-kadang mengakibatkan kematian.
Ketika jamur tumbuh di jaringan mereka dapat menampilkan bentuk aseksual (tidak sempurna)
primitif yang muncul sebagai bentuk ragi atau spora . Beberapa mungkin menghasilkan
pertumbuhan vegetatif yang muncul sebagaitubular hifa yang mungkin septate dan
bercabang; fitur-fitur ini penting secara morfologis untuk mengidentifikasi berbagai jenis jamur.
Massa hifa terjalin disebutjamur miselium. Jarang, ketika jamur mencapai rongga terbuka,
permukaan tubuh, atau permukaan luminal seperti bronkus, adalah tubuh buah pembentuk
spora yang disebut sporangia, atau konidia, diproduksi.
Identifikasi jamur
Beberapa jamur dapat menimbulkan berbagai reaksi inang dari eksudatif, nekrotikan, hingga granulomatosa;
 jamur lain menghasilkan sedikit respons seluler untuk menunjukkan keberadaannya. Untungnya, sebagian
besar jamur relatif besar dan dinding sel mereka kaya polisakarida, yang dapat dikonversi oleh oksidasi
menjadi dialdehid dan dengan demikian terdeteksi dengan pereaksi Schiff atau larutan hexamine-silver. Jamur
sering lemah hematoksi-filosofis dan dapat dicurigai pada noda H&E. Beberapa jamur, seperti sporothrix,
mungkin dikelilingi oleh endapan Splendore-Hoeppli stellat, sangat eosinofilik, refraktil dari imunoglobulin inang
dan eosinofil terdegradasi.
Tersedia antibodi spesifik berlabel Fluorokrom pada banyak jamur, dan sedang digunakan di laboratorium mikologi
untuk identifikasi jamur padasegar dan
infeksi jamur 303

bagian parafin. Antibodi ini belum menemukan penggunaan luas, pada jaringan tetap di mana identifikasi

masih bergantung terutama pada metode pewarnaan tradisional.

Pewarnaan H&E, methenamine Grocott (hexamine) - silver (GMS), bagian yang tidak ternoda untuk
mencari pigmentasi, dan atlas warna yang baik (Chandler et al. 1980) ketika pengalaman gagal
memungkinkan sebagian besar infeksi jamur diidentifikasi hingga tingkat yang cukup. untuk
diagnosa. Namun, tidak ada pengganti untuk kultur mikrobiologis.

Grocott methenamine (hexamine) -silver untuk jamur dan Pneumocystis spp. Organisme

(Gomori 1946; Grocott 1955; Swisher & Chandler 1982) Bagian Formalin ditetapkan, parafin.

Solusi 4% asam kromat tersedia secara komersial, atau asam kromat 4,0 g Air suling 100 ml
1% natrium bisulfit Sodium bisulfit 1 g Air suling 100 ml
5% natrium thiosulfate Sodium thiosulfate 5,0 g Air suling 100 ml
(A) 0,21% perak nitrat (stok ) Perak nitrat 2,1 g Air suling 1000 ml
Dinginkan hingga 3 bulan.
(B) Methenamine-sodium borate solution (stok) Methenamine 27 g Sodium borate decahydrate
(borax) 3,8 g Air suling 1000 ml
Dinginkan hingga 3 bulan.
Methenamine-silver sodium borate solution (berfungsi) Bagian yang sama dari larutan A dan B.
Segarkan setiap kali dan saring sebelum digunakan.
0,2% hijau muda (persediaan) Hijau muda 0,2 g Air suling 100 ml Asam asetat glasial 0,2 ml
15 304 Mikroorganisme Hijau muda (berfungsi)
dicerna sebelum inkubasi. Bak air mungkin berwarna hijau muda 10 ml yang
digunakan secara efektif untuk memastikan50 ml air inkubasi yang merata
suhu.
Siapkan solusi kerja yang segar sebelum digunakan.
b. Boraks menjamin pH basa.
Metode
1. Deparaffinisasi dan rehidrasi melaluibertingkat
alkoholmenjadi air suling. 2. Oksidasi dalam asam kromat berair 4% (kromium
trioksida), 30 menit. 3. Cuci sebentar dengan air suling.
Metode PAS McManus untuk glikogen dan dinding sel jamur Fiksasi 10% NBF.
Bagian 3–5-μm bagian parafin.
Solusi
Pereaksi Schiff, juga tersedia secara komersial 0,5% larutan asam periodik
Asam periodik 0,5 g Air suling 100 ml
hijau muda 0,2% (stok) Hijau muda 0,2 g Air suling 100 ml Asam asetat glasial 0,2 ml Ini
adalah larutan stok yang sama yang digunakan dalam RUPS .
Hijau muda (berfungsi) Stok hijau muda 10 ml Air suling 50 ml
Buat segar sebelum digunakan.
Metode 1. Deparaffinize dan hidrat slide ke air suling.
2. Oksidasi dalam larutan asam periodik
selama 5 menit.
3. Bilas dengan air suling
. 4. Tempatkan dalam reagen Schiff selama 15 menit.
5. Cuci dalam air leding yang mengalir selama 10 menit agar
warna pink terbentuk.
6. Counterstain selama beberapa detik dalam mengerjakan
solusi hijau muda.
c. Sodium bisulfit menghilangkan kelebihan asam kromat.
d. Beberapa pekerja
lebih menyukai pemahaman H&E yang ringan. Ini
sangat berguna ketika kasus konsultasi dikirim hanya dengan satu slide, memberikan detail
morfologis untuk ahli patologi.
e. Solusi A dan B perlu dibuat dan disimpan dalam gelas yang bersih secara kimia (20% asam nitrat),
Celupkan sebentar ke dalam 1% natrium bisulfit.
apakah solusi yang bekerja. Ini termasuk lulusan
5. Cuci sumur dalam air suling
dan stoples Coplin. Jangan gunakan forsep logam.
6. Tempatkan dalam bak air panas (56-60 ° C) bekerja
 f. Allow all refrigerated solutions to reach room silver solution for 15–20 minutes. Check control
temperature before using. after 15 minutes. If section is 'paper bag brown' then rinse in distilled
water and check under microscope. If it is not ready, dip again in distilled water and return to silver.
Elastin should not be black. Check every 2 minutes from that point onwards. (See Note a.)
7. Rinse well in distilled water.
8. Tone in 0.1% gold chloride, 5 seconds. Rinse in
distilled water.
9. Place in 5% sodium thiosulfate, 5 seconds.
10. Rinse well in running tap water.
11. Counterstain in working light green solution until a
medium green (usually 5–15 seconds).
12. Dehydrate, clear, and mount.
Results Fungi, pneumocystis, melanin black Hyphae and yeast-form cells sharply delineated in
black of fungi Mucins and glycogen taupe to dark gray/
brown Background pale green
Notes a. Incubation time is variable and depends on the
type and duration of fixation, and organism being demonstrated. Impregnation is controlled
microscopically until fungi are dark brown. Background is colorless at this point. Over- incubation
produces intense staining of elastin and fungi that may obscure fine internal detail of the hyphal
septa. This detail is essential for critical identification, and is best seen on under- impregnated
sections. To avoid excess glycogen impregnation in liver sections, section may be
A selection of the more important fungi and actinomycetes 305
found as a commensal in the mouth and tonsillar crypts. It
can cause a chronic suppurative infection, actinomycosis,
which is characterized by multiple abscesses drained by
7. Dehydrate in 95% alcohol, absolute alcohol, sinus tracts. Actinomycotic abscesses can be found in liver,
and appendix, lung, and neck. The individual organisms are
clear in xylene. 8. Mount in resin- Gram-positive, hematoxyphilic, non-acid-fast, branching
based mountant. filaments 1 μm in diameter. They become coated in 'clubs'
of Splendore-Hoeppli protein when the organism is
Results Fungal cell walls and glycogen magenta to
invasive. These clubs are eosinophilic, acid-fast, 1–15 μm
red Background pale green
wide, and up to 100 μm long, and stain polyclonally for
Quality control/notes A solution of 5% immunoglobulins. This arrange- ment of a clump of
aqueous sodium hypochlorite reduces actinomyces or fungal hyphae, which measures 30–3000
overstaining by Schiff's. μm, surrounded by eosino- philic protein, is called a 'sulfur'
granule and is an important identification marker for certain
fungal groups. These granules may be macroscopically
A selection of the more important fungi and
visible and their yellow color is an important diag- nostic
actinomycetes
aid.
Nocardia asteroides is another actinomycete. It is
Actinomyces israelii is a colonial bacterium which can be
 filamentous and may be visible in an H&E stain, infection
butofisthe ear.
Grocott positive and variably acid-fast using the modifiedZygomycosis is an infrequently seen disease
ZN for leprosy. However, it is difficult to demonstrate
caused even
by a group of hyphated fungi belonging mainly to
with the acid-fast bacillus. Its pathology is similar
the generaofMucor and Rhizopus. They have thin- walled
to that
actinomycosis, but its organisms are generally hyphaemore(infrequently septate) with non- parallel sides,
disseminated than those of actinomycosis. ranging from 3 to 25 μm in diameter, branch irregularly,
Candida albicans is a common fungus, andbut withshow empty bulbous hyphal swelling. Grocott
often
immunosuppression can become systemic. It and infects
PAS the
are the staining methods of choice (Figs 15.4 and
mouth as thrush, the esophagus, the vagina as 15.5).
vaginal moniliasis, the skin and nails, and may be found in
heart-valve vegetations. It is seen as both ovoid budding
yeast-form cells of 3–4 μm, and more commonly as slender
3–5 μm, sparsely septate, non- branching hyphae and
pseudo-hyphae. While diffi- cult to see on H&E, this
organism is strongly Gram positive, and is obvious with the
Grocott and PAS techniques.
Aspergillus fumigatus is a soil saprophyte and a
commensal in the bronchial tree. It may infect old lung
cavities (Fig. 15.3) or become systemic in
immunosuppressed patients. The fungus has broad, 3–6 μm,
Figure 15.3 A strong hematoxylin (Ehrlich's and eosin
parallel-sided, septate hyphae showing dichotomous (45
stain) will show the fine detail of many infectious
degrees) branching. It may be asso- ciated with Splendore-
agents. The hyphal structure identifies this as
Hoeppli protein and some- times forms fungal balls within
Aspergillus which was colonizing an old tuberculosis
tissue. This fungus may be seen in an H&E stain and is
cavity in the lung.
demonstrated well with a PAS or Grocott. When it grows
exposed to air, the conidophoric fruiting body may be seen
as Aspergillus niger, a black species that can cause
Figure 15.5 Immunohistochemistry is being increasingly applied to the demonstration of
microorganisms using labeled specific antibody. This figure demonstrates Zygomycetes,
a fast-growing fungus, with fast red chromogen.
Figure 15.4 Rhizomucor spp. (a cosmopolitan, filamentous fungus) is well demonstrated by this
PAS stain with light green counterstain.
15 306
Microorganisms Figure 15.6 Grocott's methenamine-silver stains a wide variety of infectious agents.

Here seen with light green counterstain is the method of choice for Histoplasma capsulatum, a
dimorphic endemic fungus.
an H&E stain. The PAS and Grocott procedures demonstrate these cells well. Infection is found in the lungs
and in the brain within the parenchyma or in the leptomeninges. Often, these patients are immunosuppressed.
Histoplasma capsulatum is another soil-dwelling yeast that can cause a systemic infection in humans called
histoplasmosis. It is especially common along the southern border of the United States, and where there are
large bird populations. The organism is usually seen within the cytoplasm of macrophages that appear stuffed
 with small, regular, 2–5 μm yeast-form cells that have a thin halo around them in H&E and Giemsa stains.
Langhans' giant cells forming non-caseating granulomas may be present. PAS and Grocott stains
demonstrate this fungus well (Fig. 15.6). Cryptococcus neoformans exists solely in yeast-form
Pneumocystis jiroveci. There is still some debate cells, is variable in diameter (2–20 μm) with ovoid,
over the taxonomy of this organism, although recent elliptical, and crescentic forms frequently seen.
analysis of its ribosomal RNA has placed it nearer There is an extensive mucopolysaccharide coat
to a fungal than a protozoan classification (Edman around the yeasts that is mostly dissolved during
et al. 1988). It came to prominence as a pathogen processing, but, when present, appears as a halo
following immunosuppressive therapies associated around the organism and is visible with special
with renal transplants in the 1960s, and has become stains such as Mayer's or Southgate's mucicarmine
a life-threatening complication of AIDS. It most fre- procedures. Yeasts may be free form or within
quently causes pneumonia, where the lung alveoli the cytoplasm of giant cells, staining faintly with
are progressively filled with amphophilic, foamy

plugs of parasites and cellular debris. It is found rarely in other sites such as intestines and lymph nodes.

The cysts are invisible in an H&E stain, and can barely be seen in a Papanicolaou stain, as they appear

refractile when the microscope condenser is racked down. Specific immunohistology is available to use;

otherwise, Grocott methenamine-silver is recommended.

Only electron microscopy or an H&E stain on a resin-embedded thin section will show their internal
structure. The cysts are 4–6 μm in diameter and contain 5–8 dot-like intracystic bodies. The cysts
rupture and collapse, liberating the trophozoites which can be seen as small hematoxyphilic dots
in a good H&E and Giemsa stain; these attach to the alveolar epithelium by surface philopodia.

The demonstration of rickettsia

Rickettsial organisms, such as those causing Q fever, Rocky Mountain spotted fever, or typhus, rarely need to b
sections. They can sometimes be seen with a Giemsa stain, or by using the Macchiavello technique which also d
inclusion bodies (Fig. 15.7).
 Figure 15.7 Immunohistochemical method demonstrating Rocky Mountain spotted fever in kidney.

It is caused by the bacterium Rickettsia rickettsii, which is carried by ticks.

The detection and identification of viruses 307

Macchiavello's stain for rickettsia and viral inclusions, modified (Culling 1974) Sections Formalin fixed,

Method 1. Deparaffinize and rehydrate through graded

alcohols to distilled water. 2. Stain in 0.25% basic fuchsin, 30 minutes. 3. Differentiate in 0.5% citric a
seconds. 4. Wash in tap water, 2 minutes. 5. Counterstain in 1% methylene blue, 15–30
seconds. 6. Rinse in tap water. 7. Dehydrate, clear, and mount.
Results Rickettsia and some viral inclusions red Background blue

The detection and identification of viruses

While The Cytopathic Effects Of Viruses Can Often Be Seen In A Good H&E Stain, And May Be Characteristic O
Singleviral Group, The Individual Viral Particles Are Too Small To Be Seen With The Light Microscope,
Thus Requiring The Electron Microscope To Reveal Their Structure. This May Allow A Rapid And Accurate
Diagnosis In Viral Infections; An Outline Of The Value Of Electron Microscopy In The Diagnosis Of Viral
Lesions Is Given In Chapter 22. Some Viruses Aggre- Gate Within Cells To Produce Viral Inclusion Bodies,
Which May Be Intranuclear, Intracytoplasmic, Or Both. These Inclusion Bodies May Be Acidophilic And
Usually Intranuclear, Or Can Be Basophilic And Cyto- Plasmic. Most Special Staining Methods Are Modified
Trichromes, Using Contrasting Acid And Basic Dyes To Exploit These Differences In Charges On The
Inclusion Body And The Host Cell. These Methods Include Mann's Methyl Blue-Eosin Stain For The Negri
Bodies Of Rabies, Macchiavello's Method, And More Recently The Elegant Lendrum's Phloxine-Tartrazine
Stain. Unfortunately, The Need For Optical Differentiation In These Methods Increases The Chance Of
Technical Error.
15 308 Microorganisms The introduction of commercially available mono- clonal immunohistology to viruses,
which are either class or species specific, has revolutionized the tissue detection of viruses.
Hepatitis B virus is a
Phloxine-tartrazine technique for viral inclusions (Lendrum 1947) Sections Formalin fixed, paraffin.
Solutions Phloxine Phloxine 0.5 g Calcium chloride 0.5 g Distilled water 100 ml
Tartrazine A saturated solution of tartrazine in 2-ethoxyethanol, or cellosolve.
Method
1. Deparaffinize and rehydrate through graded
alcohols to distilled water.
2. Stain nuclei in alum hematoxylin (Carazzi's or
Harris's), 10 minutes.
3. Wash in running tap water, 5 minutes.
4. Stain in phloxine solution,
20 minutes.
5. Rinse in tap water and blot dry.
6. Controlling with the microscope, stain in tartrazine
until only the viral inclusions remain strongly red, 5–10 minutes on average.
7. Rinse in 95% alcohol
. 8. Dehydrate, clear, and mount.
Results Viral inclusions Red blood cells Nuclei bright red
variably orange-red blue-gray good example of the diagnostic value of this tech-
Background yellow nique where the surface antigen (also known as HBs or Australia antigen) and the core
antigen (HBc) can be specifically detected immunohistochemically,
Notes All tissue is stained red with phloxine, which is then differentiated by displacement
with the counterstain providing clinically important information about
tartrazine. The red color is first removed from muscle, the stage of this disease. More recently,
nucleic acid
then other connective tissues. Paneth cells, Russell hybridization probes have become available and can
bodies, and keratin can be almost as dye retentive as be used to detect genomically inserted viral
nucleic acid in situ, in cells and tissues that are frozen or
viral inclusions, and can occasionally be a source of confusion.
formalin fixed. It should be remembered, however, that the detection of microorganisms using nucleic
acid probes, unlike specific biotinylated antiserum, does not necessarily mean active disease.
Shikata's orcein method for hepatitis B surface antigen
(modified Shikata et al. 1974)
Sections Formalin fixed, paraffin.
Solutions Acid permanganate 0.25% potassium permanganate 95 ml 3% aqueous sulfuric acid 5 ml
Orcein Orcein (synthetic) 1 g 70% alcohol 100 ml Concentrated hydrochloric acid (gives
a pH of 1–2)
1 ml
Saturated tartrazine in cellosolve (2-ethoxyethanol).
Method
1. Deparaffinize and rehydrate through graded
alcohols to distilled water.
 2. Treat with acid permanganate solution, 5 minutes. 3. Bleach until colorless with 1.5% aqueous oxal
acid, 30 seconds. 4. Wash in distilled water, 5 minutes, then in 70%
alcohol. 5. Stain in orcein solution at room temperature, 4
hours, or in a Coplin jar of 37°C preheated orcein, 90 minutes. 6. Rinse in distilled alcohol and examine
microscopically to determine desired staining intensity. 7. Rinse in cellosolve, stain in tartrazine, 2 minu
Rinse in cellosolve, clear, and mount.
Viral infections 309

Results Hepatitis B infected cells, elastic and

some mucins
the target organ and damage varies with the viral strain, ranging from massive acute necrosis to chronic 'piecemeal ne
leading to cirrhosis. An eosinophilic 'ground glass' appearance is seen in the cytoplasm of some hepatocytes, du
endoplasmic reticulum that contains tubular HB surface antigen. It is this component that can be demonstrated using Shik
or by specific immunohistochemistry.
Herpes viruses are usually acquired subclinically during early life and enter a latent phase, to be reac- tiv
immunological stress. These viruses cause blistering or ulceration of the skin and mucous membranes, but can cause
including encephalitis, in immu nosuppressed or malnourished individuals. The cytopathic effects of the herpes virus are
smears of blister fluid, and include the margination of chro- matin along nuclear membranes, Cowdry type A ('owl's ey
and syncytial or 'grape-like' nuclei within giant cells. Cytomegalovirus (CMV) is sometimes seen as a systemic opport
AIDS patients. It is seen in the
black
black

Background yellow

Notes The success of this method largely depends on the particular batch of orcein used, and on freshly
This method relies on permanganate oxidizing of sulfur-containing proteins to sulfonate residues that reac
Results compare well with those obtained using labeled antibodies, but the selectivity is inferior.

Viral infections

Whilst not exhaustive, this brief summary reflects some viruses that are encountered in surgical and post-mortem hist
Viral hepatitis. To date, five hepatitis viruses have been reported, hepatitis viruses (HV) A, B, C, D, and E, t
diversity, and three of which are incompletely characterized.

Table 15.3 Viral infections seen in histopathology

Virus Family Genome Disease
Measles Paramyxo SS RNA Measles Varicella-zoster Herpes DS DNA Chickenpox, shingles Herpes simp
DNA Cold sores, genital herpes Cytomegalovirus (CMV) Herpes DS DNA Cytomegalic inclusion disease
virus Herpes DS DNA Glandular fever, African
Burkitt's lymphoma Human T-cell leukemia
(HTLV-1) Retro SS RNA Adult T-cell leukemia Human immunodeficiency virus (HIV) Retro SS RNA AIDS
papilloma virus (HPV) Papova DS DNA Human wart viruses JC virus Papova DS DNA Progressive multifo
leukoencephalopathy Poliovirus Picorna SS
Poliomyelitis Molluscum virus Pox DS DNA Molluscum contagiosum Lyssavirus Rhabdo SS RNA Rabies

DS = double-stranded; SS = single-stranded.
15 310 Microorganisms endothelial cells, forming prominent intranuclear
from AIDS patients. It produces a distinctive neuro- inclusions that spill into the cytoplasm where they
pathological lesion in AIDS encephalitis consisting form granular hematoxyphilic clusters. The CMV
of microglial nodules, or stars, containing collections virus causes obvious cytomegaly in the cells it
of giant cells, microglia, and astrocytes. Synthetic infects. All herpes viruses have an identical electron
nucleic acid probes have been prepared to HIV microscopic appearance of spherical, 120 nm,
genomes. membrane-coated particles.
Influenza virus (flu) is a contagious respiratory Papilloma viruses are a family of about 50 wart
illness caused by influenza viruses (Fig. 15.8). It can viruses that cause raised verrucous or papilloma-
cause mild to severe illness, and at times can lead to tous skin warts, or flat condylomatous genital warts.
death. According to the Centers for Disease Control Cytologically, evidence of hyperkeratosis may be
(CDC), every year in the United States, on average, present together with koilocytosis (irregular nuclear
5–20% of the population suffers from the flu, more enlargement and cytoplasmic vacuolation forming
than 200,000 people are hospitalized from flu com- perinuclear halos). Skin verrucas are associated with
plications and about 36,000 people die from flu. HPV 1–4 strains, genital condylomas with HPV 6,
More recently, concern about the influenza A H5N1 11, 16, and 18, and cervical cancer with HPV 16 and
strain of bird flu has emerged. Some people, such 18. These uncoated viruses measure 55 nm, are
as older people, young children, and people with mainly intranuclear, and can be detected using elec-
certain health conditions, are at high risk for serious tron microscopy, or immunoperoxidase and gene
flu complications. probes on paraffin sections.
SARS (severe acute respiratory syndrome) is a JC virus is a papovavirus that causes progressive
viral respiratory illness caused by a coronavirus multifocal leukoencephalopathy, a demyelinating
called SARS-associated coronavirus (SARS-CoV) disease, in AIDS and other immunosuppressed
(Fig. 15.9). SARS was first reported in Asia in patients. Intranuclear hematoxyphilic inclusions
February 2003. Over the next few months, the may be seen within swollen oligodendrocytes.
illness spread to more than two dozen countries Molluscum virus produces a contagious wart in
in North America, South America, Europe, and children and young adults called molluscum conta-
Asia before the SARS global outbreak of 2003 giosum. Large eosinophilic, intracytoplasmic inclu-
was contained. sion bodies can be seen in maturing keratinocytes on routine H&E sections, and are seen well wit
 tartrazine. The large 1 μm viral particles have a typical pox virus structure: brick-shaped with a superimposed fig
nucleic acid sequence.
Rabies virus. This neurotrophic rhabdovirus forms intracytoplasmic eosinophilic inclusions best seen in the axo
hippocampal neurons of the brain. Macchiavello, phloxine-tartrazine, Mann's methyl blue-eosin, or PAS stai
mended. Note: given the pathogenicity of these agents, if suspected, the case should be passed to a relevant dia
rather than a routine laboratory.
Human immunodeficiency virus (HIV) consists of at least two retrovirus strains. The virus is best seen in culture
and is rarely seen in tissues
Figure 15.8 Immunohistochemical method demonstrating Flu A virus infected cells in the bronchus.
neuronal death, and astrocytosis in affected brains. The
infectious agent is a prion, a small peptide, free of nucleic
acid and part of a normal transmembrane glycoprotein
which is not, strictly speaking, a virus. Antibodies have
been pre- pared from prion protein that strongly mark accu-
mulated abnormal protein in these diseases (Lantos 1992).
The CJD Surveillance Center in the USA is an
invaluable source for monitoring and testing human prion
disease in the United States. The Center is supported by the
CDC and by the American
Association of Neuropathologists. Visit their website
Figure 15.9 Immunohistochemical method (http://www.cjdsurveillance.com) for details on how to
demonstrating the previously unrecognized submit
SARS-specimens for testing; they perform these tests at no
associated coronavirus which is responsiblecharge
for for laboratories in the USA. In addition, both CDC
severe acute respiratory syndrome (SARS).and the World Health Orga- nization (WHO) also offer
guidelines regarding the handling of suspected and known
cases of prion disease. Visit http://www.cdc.gov and search
Prion disease for CJD for a fact sheet and other relevant information.
WHO offers a manual in pdf form for downloading. It gives
information
To date, more than eight transmissible neurodegen- erative about what to do should you find yourself with
a suspected
diseases have been described affecting the central nervous or known positive case in your lab:
system (CNS). The diseases caused by prions http://who.int/bloodproducts/
include TSE-manual2003.pdf.
Remember
Creutzfeldt-Jakob disease (CJD) and variant CJD (vCJD), that these types of cases should never
Germann-Straussler-Shien- ker disease, fatal knowingly
familialbe handled in a routine histology lab. Contact
insomnia, and kuru in humans, bovine your local health department for additional guidelines.
spongiform
encephalopathy (BSE, also known as 'mad cow disease'),
Thedisease
scrapie (in goats and sheep), and chronic wasting demonstration of protozoa and other
(CWD) (in mule deer and elk). Prions are not microbes
organisms in
the usual sense because they are not alive, but the illness
they cause can be transmitted from one animalTheto another.
identification of protozoa is most often made on
All usually produce a characteristic spongi- form change,
morphological appearance using H&E and, particu- larly,
Giemsa stains. The availability of antisera against Solutions Giemsa stock (commercially available)
or Giemsa stain powder 4 g Glycerol 250 ml
organisms such as entamoeba, toxoplasma, and leishmania
has made diagnosis much easier in difficult casesMethanol
(Fig. 250 ml Dissolve powder in glycerol at
15.10a and b). 60°C with regular shaking. Add methanol, shake
the mixture, and allow to stand for 7 days. Filter
Giemsa stain for parasites Sections Fixative is before use.
not critical, but B5 or Zenker's is preferred; thin (3
Working Giemsa for parasites Giemsa stock 4 ml
μm) paraffin sections. (If Zenker's is not used, post-
Acetate buffered distilled water, pH 6.8 96 ml
mordant in Zenker's in a 60°C oven for 1 hour
before staining.)
The demonstration of protozoa and other organisms 311