HISTOKIMIA

Tofrizal
Tujuan perkuliahan
Mengetahui
Jenis pemeriksaan histokimia
Teory dasar histokimia
Teknik dasar histokimia
Histokimia
Cabang ilmu yang bertujuan untuk meng-dentifikasi,
menetukan distribusi komponen kimiawi suatu zat
didalam jaringan melalui pewarnaan, indikator dan
analisa mikroskopis
Metode visualisasi struktur biologis

3
Kriteria pewarnaan histokimia yang ideal
Dapat mendeteksi / mengidentifikasi keberadaan
molekul biokimiawi dalam jaringan
Dapat mengetahui disribusi molekul biokimiawi
dalam jaringan
Bersifat spesifik
Produk mudah terdeteksi
Produk tidak mudah larut dan stabil

4
Pewarnaan Histokimia

Deteksi ion
Besi Perls’s Reaction/Prussian blue
Calcium Von Kossa
Pewarnaan Lemak; Oil Red O
Pewarnaan Asam Amino Gieson-elastics
Pewarnaan Asam Nucleat
Protein;
Collagens; Sirius red, Masson trichrome, Azan
Amiloid; congo red
Retikulin; impregnasi perak
Pewarnaan karbohidrat, mucin
Mucicarmine
PAS
Perls’s Reaction/Prussian blue
 Deteksi ion besi (ferric ions) Fe 3+. Limpa , hati, pankreas.
 hemochromatosis (penyakit dengan akumulasi ion besi
(ferric ions) pada organ.
 Prinsip
 ion ferric direaksikan dengan ferrocyanide pigment Prussian
blue (ferric ferrocyanide). Biru terang
 Prosedur
 alat ; Microwave oven
 Reagen ; campur sama banyak
 5 % potassium ferrocyanide
 5 % HCl
 Deparaffinisasi dan dehidrasi sediaan parafin section
 Microwave sediaan dalam larutan reagen 30 detik, dinginkan 5
minutes dalam fume hood. Treatmen dengan acid ferrocyanide
(10 and 30 menit).
 Cuci DW
 Rendam dalam 0.5% aqueous neutral red or 0.1% nuclear fast red.
Prussian blue pada pulmonary veno occlusive disease
Untuk mewarnai inti
 Cuci DW
 Dehidrasi
 Clearing, mounting
 Hasil; warna biru ; adanya partikel ion besi.

6
Pewarnaan Von Kossa
 Deteksi Calcium, Calcium phosphate
 Deposit Ca pada kista , ductectasia, papillomatosis
 Penyakit dengan calcinosis
 Prinsip
 Reduksi Ca oleh cahaya dan deposisi oleh perak menggunakan larutan silver nitrat,
deposit perak phosphate tampak sebgaia endapan hitam.

 Reagen
 Fiksatif 10 % formalin
 Lamp 60 watt/ sumber cahaya lain
 5 % silver nitrate
 5 % sodium thiosulfate

 Prosedur
 Deparaffinisasi dan rehidrasi
 Rendam sediaan dalam larutan silver di tempat terang 1 jam sampai terdapat endapan
hitam pada sediaan kontrol positif
 Cuci dalm distilled water
 Rendamdalam 5% sodium thiosulfate 5 mnt
 tap water, distilled water, 5 mnt
 nuclear-fast Red , 5 mnt Von kossa pada kalsifikasi plasenta
 distilled water
 Dehydrasi, clearing, mounting

 Hasil
 Hasil positif bila terdapat endapan hitam.

 .

7
Pewarnaan Lemak
 Contoh
 Sudan VI
 Sudan black
 Oil Red O
 Nile blue
 Berguna untuk memperlihatkan lemak intrasel pada berbagai penyakit.
 Prinsip
 Pewarnaan menggunakan zat yang lebih larut pada lemak dibanding
pelarutnya sendiri sehingga akan menumpuk pada kompartement lemak
dalam jaringan dan lepas dari larutan solvent.

Paling banyak dipakai Oil red O

 Bahan
 ORO (Oil Red O) solution
 Glycerine jelly mounting medium
 Prosedur
 Sediaan frozen section 8-10 micron
 Keringkan di udara terbuka
 Cuci dalam 60 % isopropanol
 Oil Red O solution 15 mnt Oil red O pada perlemakan hati
 Cuci dalam 60 % isopropanol
 Alum hematoxylin 1 menit untuk nuclei
 Cuci dalam distilled water
 Mounting dalam glycerin jelly

 Observasi
 Warna merah bila lipid positif
8
Protein dan Asam Amino
Contoh
 Millon‘s
 Sakaguchi
 Tetrazotized benzidine

Millon's Reaction
 Deteksi asam amino tyrosine.
 Prinsip; mercury dan mercuric nitrate bereaksi dengan
hydroxybenzene radicals pada Tyrosine  Mercuric
fumarate; warna merah
Sakaguchi Test Millon's Reaction
 Deteksi asam amino Arginine
 Prinsip; 1-naphthol dan sodium hypobromite kompleks
senyawa kemerahan bila bereaksi dengan arginin
Tetrazotized Benzidine Reaction
 Deteksi non-collagen proteins yang mengandung
tyrosine, histidine dan tryptophan
 Prinsip; ikatan Tetrazotized benzidine with dan beta
naphthol atau Hyaluronic acid.

9
Asam Nucleat
 DNA inti jumlahnya relatif sama pada tiap

sel.
 RNA; nucleus dan sitoplasma jumlah

sangat bervariasi tergantung fungsi sel

 Pewarnaan asam nukleat Terdiri atas

metode spesifik dan non spesifik.

 Spesifik/Selektif untuk DNA
 Feulgen's Reaction
 Non Spesifik/Non Selektif untuk DNA dan
RNA
 Methyl green pyronin ; menentukan
DNA atau RNA
 Acridine orange;
 Fluorescence kuning kehijauan; DNA

 Fluorescence Merah oranye; RNA

Asam Nucleat
 Selektif untuk DNA
 Feulgen's Reaction
 Mendeteksi aldehyd pada DNA. Basa
purine pada DNA dengan hydrolysis 5N
HCl 40 menit, suhu ruang. Sisa gula
bereaksi jadi aldehyde dan selanjutnya
direaksikan jadi zat berwarna :
 Selektif untuk DNA, RNA tidak
terhydrolisa oleh HCl..

Feulgen’s reaction pada adeno ca colon

 Non Selektif untuk DNA dan RNA

 Methyl green pyronin
 Biru-ungu; DNA
 Merah ; RNA
 Sering dipakai untuk d/ tumor sel plasma
 Acridine orange;
 Fluorescence kuning kehijauan; DNA F Methyl green pyronin reaction pada plasmacytoma
 Fluorescence Merah oranye; RNA

11
Saccharides
/ karbohidrat
 Contoh
 PAS reaction
 Lectins
 Ruthenium red PAS pada colon
 Alcian blue
 Alcian blue - PAS reaction

 PAS reaction (Periodic Acid Schiff)

 Pewarnaan paling populer untuk glikogen, carbohydrat
 Periodic acid (HIO4) mengoksidasi carbohydrat jadi aldehyde
 Aldehid bereaksi denga reagen schiff jadi zat berwarna magenta
terang.
 Prosedur
 Deparaffinisasi and rehidrasi Alcian blue pada colon
 Digesti dengan larutan diastase bila ingin menghilangkan glikogen,
 Tap water 5 menit
 0.5 % periodic acid 5 menit
 distilled water 5 menit
 Schiff reagent 5 menit
 0.55 % potassium metabisulfite
 tap water 5 menit
 Counterstain dengan hematoxylin
 Tap water
 Dehidrasi ,clearing, dan mounting

PAS-Alcian blue pada colon

12
PAS positif substance
Polysaccharida (Glicogen);
tumor dengan glicogen; Clear
Cell Achantoma kulit
PAS pada candida sp
 Glycosaminoglycan,
mucopolysaccharida
(hyaluronic acid, Chondroitin
sulphate); pada tulang rawan,
sendi
Glycoprotein, (thyreoglobulin,
PAS pada Cryptococcus n
Glycogen)
Glycolipids (lipofuchsin)
Material non self;
polisacharida tumbuhan;
infeksi jamur,
PAS pada Clear cell achantoma
13
Enzyme Histochemistry
Menentukan lokasi, distribusi, fungsi enzyme dalam
jaringan
Contoh
Acid phosphatase
Dehydrogenase
Peroksidase
Alkaline Phosphatase
Menggunakan sediaan frozen section, karena fiksasi
menyebabkan enzym inactive
Prinsip; enzyme+substrate  produk
Demonstrasi produk dengan chromogen

14
Contoh
Peroksidase
 Sediaan diinkubasi dengan H2O2 (substrat) dan DAB
(chromogen)
 DAB akan teroksidasi menjadi endapan coklat
 Hasil positif bila kecoklatan
 Misal pada leukemia

15
Terima kasih