Uji daya hambat dan daya bunuh

a. Pembuatan Media Uji

Media yang digunakan untuk uji aktivitas anti bakteri adalah Mueller Hinton

Agar (MHA). Komponen medium ditimbang untuk volume yang digunakan sesuai

dengan komposisi MHA (ekstrak daging 150 gr, casamino acid technical 8,75 gr,

amilum 0,75 gr, agar-agar 8,5 gr, air suling 500 ml) timbang 34 gram media,

tambahkan 1 liter air suling panaskan sampai mendidih untuk melarutkan media

dan disterilkan dalama utoklaf selama 15 menit pada suhu 121oC dan tekanan

1atm (Hamdany, 2017).

b. Pembuatan Suspensi Bakteri

Bakteri uji disuspensikan kedalam tabung yang berisi 2 ml larutan NaCl

0,9% hingga diperoleh kekeruhan yang sama dengan standar kekeruhan larutan

Mc. Farland 0,5 (EUCAST, 2017).

c. Pengujian daya hambat ekstrak ethanol biji mengkudu

Uji daya hambat dilakukan dengan metode difusi agar menggunakan metode

difusi kertas cakram. Uji daya hambat ekstrak etanol buah mengkudu (Morinda

citrifolia L.) akan dilakukan pengulangan sebanyak tiga kali. Uji daya hambat

dengan metode difusi kertas cakram yaitu dilakukan dengan menggunakan

piringan yang berisi agen anti mikroba, kemudian diletakkan pada media agar yang

sebelumnya telah ditanami mikroorganisme sehingga agen mikroba dapat berdifusi

pada media agar tersebut. (Nurhasanah, 2016). Langkah-langkah pengujian daya

hambat antibakteri adalah sebagai berikut:

1) Sebanyak ± 25 ml media MHA dituang kedalam cawan petri steril dan

diinkubasi pada suhu ruang selama 15 menit.

 2) Biakan pada suspensi bakteri diambil dengan swab steril dan di goreskan

pada medium agar.

3) Kertas cakram direndam dalam tiap konsentrasi kemudian dikeringkan.

4) Kertas cakram yang telah kering diletakkan secara teratur pada diatas

medium agar yang mengandung bakteri uji dan kemudian diberi label.

5) Dalam waktu yang bersamaan letakkan clindamycin paper disc 30 µl pada

medium agar.

6) Cawan petri yang berisi bakteri uji dan ekstrak senyawa antibakteri

tersebut diinkubasi selama 24 jam pada suhu 370C

7) Daya hambat Ekstrak ditentukan dengan cara mengukur rata-rata diameter

zona hambat melalui 4 sisi yaitu vertikal, horizontal, dan diagonal

kemudian mengurangi dengan diameter kertas cakram dan rata-ratanya

dibagi 4 (gambar 9) (EUCAST, 2017; Rahman, 2016).

Gambar 9. Diagram Pengukuran Zona Hambat

Keterangan:

Lingkaran (abcdefgh) : daerah yang menggandung ekstrak.

Lingkaran (ABCDEFGH) : zona hambat pertumbuhan.

 Rumus pengukuran zona hambat, dihitung dengan (Rahman, 2016) :

(AE – ae) + (BF – bf) + (CG – cg) + (DH – dh)

4

Setelah diperoleh data penghambatan ekstrak biji mengkudu terhadap

pertumbuhan bakteri, maka selanjutnyaa dapat ditentukan kadar hambat minimum

(KHM) dan kadar bunuh minimum (KBM). Penentukan kadar hambat minimum

(KHM) ditentukan berdasarkan konsentrasi terkecil dari sampel yang mampu

menghambat bakteri yang diinokulasi. (Leigue dkk., 2016). Penentuan kadar

bunuh minimum (KBM) ditentukan berdasarkan ada tidaknya bakteri yang dapat

hidup setelah pemberian larutan uji dengan konsentrasi terendah dengan cara

menginkubasi kembali medium yang memiliki zona hambat selama 24 jam

(Julianti dkk., 2017).

 PEREMAJAAN BAKTERI
Peremajaan dan Identifikasi Bakteri

Media yang digunakan untuk peremajaan bakteri uji adalah Nutrient Agar

(NA). Komponen medium ditimbang untuk volume yang digunakan sesuai dengan

komposisi NA (Ekstrak daging10g/l, pepton 10 g/l, NaCl 5 g/l, dan agar-agar

15g/l), timbang 2,0 gram tambahkan air suling 100 ml. Semua bahan dilarutkan di

dalam labu Erlenmeyer dan disterilkan dalam autoklaf selama 15 menit pada suhu

121oC dan tekanan 1 atm (Rahmah dkk., 2010).

Bakteri uji ditumbuhkan pada medium Nutrient Agar (NA) dengan cara

menggoreskan bakteri dari biakan murni menggunakan jarum ose pada permukaan

agar. Bakteri yang sudah digoreskan pada media kemudian di inkubasi pada suhu

370C selama 24 jam (Hamdany, 2017).

Identifikasi bakteri Propionibacterium acnes melalui pewarnaan gram. Tahap

awal yang dilakukan adalah dengan membuat apusan bakteri uji. NaCl fisiologis,

diambil 2 loop dengan menggunakan ose kemudian ditempatkan diatas object

glass. Ose yang telah digunakan di dijarkan pada api bunsen dan didinginkan.

Dengan menggunakan ose yang sama, diambil 1 koloni bakteri dari hasil

peremajaan bakteri dan ditempatkan diatas NaCl fisiologis pada object glass.

Suspensi diratakan dengan membentuk area apusan. Suspensi dikeringkan pada

suhu ruang untuk beberapa menit. Suspensi dilewatkan diatas api bunsen untuk

fiksasi apusan (Saraswati, 2015).

Apusan bakteri yang telah dibuat diteteskan dengan zat warna I (Crystal

Violet) keatas area apusan dan dibiarkan selama 60 detik. Hasil pewarnaan gentian

violet dicuci perlahan menggunakan aquades, kemudian dibiarkan selama 2 detik.

Apusan bakteri kemudian ditetesi dengan pewarna iodine dan didiamkan selama
60 detik. Hasil pewarnaan dengan lugol dicuci menggunakan alkohol hingga

larutan yang mengalir tidak berwarna. Dilakukan pencucian lagi menggunakan

aquades secara perlahan, didiamkan selama 2 detik. Terakhir, apusan bakteri

ditetesi zat warna II (safranin), kemudian didiamkan selama 20 detik. Hasil

pewarnaan safranin dicuci perlahan menggunakan aquades lalu didiamkan selama

2 detik. Dikeringkan disuhu ruang, setelah mengering ditetesi dengan minyak

imersi. Objek diamati di mikroskop dengan pembesaran 100x (Hamdany, 2017;

Saraswati, 2015; Coico, 1997.)