METODE KERJA

1.1 ALAT DAN BAHAN

1. ALAT
- Alat degassing
- Alat sanikasi
- Beker glass 250 ml
- Beker glass 500 ml
- Elenmeyer 500 ml
- Gelas ukur
- Labu ukur 250 ml
- pH meter
2. BAHAN
- ACN (Asetonitril ) 280 ml
- Asam fosfat
- Aquadest
- KH2PO4

1.2 CARA KERJA

Eluen = ACN (asetonitril) : Buffer Fosfat pH 2 0,05 M = 60 : 40

A. PREPARASI ELUEN ( FASE GERAK)
1. Perhitungan Bahan
- Estimasi eluen yang digunakan untuk 4 jam ,laju alir HPLC 1ml/menit
1 jam = 60 menit
4 jam = 240 menit eluen (HPLC) = 240 ml /menit

60
Asetonitril = x 400 = 240 ml
100
40
Buffer fosfat Ph 2 0,05 M = x 400 = 160 ml
100
M = gr/mr x 1000/ml
M x Mr x ml 0,05 x 136,086 x 250
= = = 1,7 gr
1000 1000

2. Pembuatan buffer fosfat pH

- Ditimbang 1,7 g KH2PO4
- dimasukkan ke dalam beker glass 500 ml dilarutkan dengan aquadest 200 ml add
larut
- adjust ke pH 2 menggunakan asam fosfat
- di atur pH dengan alat pH meter
- dimasukkan dalam labu ukur 250 ml larutan yang sudah pH2 lalu di add aquadest
hingga tanda batas
3. Pembuatan eluen (Fase gerak) Buffer fosfat dan asetonitril (40:60)
- Ukur bahan buffer fosfat pH 2 sebanyak 160 ml
- Ukur bahan asetonitril sebanyak 240 ml
- Dicampurkan add hingga homogen dalam elenmeyer 500ml , dilakukan degassing
selama 15 menit mengunakan ultra sonic bath

B. PREPARASI LARUTAN SAMPEL

- Kadar flavanoid total dalam ekstrak etanolik sambiloto sebesar 46,322 g/kg
ekstrak atau 4,63 % terhadap kuersetin
- Sampel sebanyak 25 g dimasukkan dalam 250 ml pelarut
Konsentrasi sampel 25 g dalam 250 ml

46,322 g 46,322 g x
= =
1 kg 1000 g 25 g

46,322 g x 25 g
x =
1000 g

x = 1,158 gr x 106

1158050 mikrogram
¿ =4632,2 ppm
250 ml

(sampel terlalu pekat) maka diencerkan 100x

V1 x N1 = V2 x N2

10 ml x 4632,2 ppm = 100 ml x N2

10 x 4632,2
N2 = = 463,22 ppm ………. (1)
100

V1 x N1 = V2 x N2

10 ml x 463,22ppm = 100 ml x N2

10 x 463,22
N2 = = 46,322 ppm ………. (2)
100
C. PREPARASI LARUTAN STANDAR
- Pembuatan Larutan stok
Kuersetin baku ditimbang ± 50 mg dengan seksama. Serbuk kemudian dilarutkan
dengan methanol dalam labu takar 100ml, kemudian ditanda bataskan (diperoleh
konsentrasi Larutan sebanyak 500 ppm)
 Pembuatan deret standar kuersetin (menggunakan metode deret standar),
Dibuat 6 seri Larutan baku kuersetin dengan 5,10,20,30,40,50 ppm degan
cara mengambil Larutan stok kuersetin dengan mikropipet
100,200,400,600,800,1000 mikroliter. Kemudian diencerkan dengan
methanol dalam labu takar 10 ml hingga tanda batas. Larutan kemudian
disaring dengan milipore dan di degassing selama 15 menit dengan
ultrasonikator.
 Pembuatan Kurva baku Kuersetin
Seri Larutan dengan konsentrasi 5,10,20,30,40,50 ppm masing-masing
kemudian di degassing dengan ultrasonikator selama 15 menit dan 20
menit dan 20 mikroliter dari masing-masing Larutan injeksi paada system
KCKT fase terbalik dan fase diam C18 dan fase gerak methanol : air
adalah 60:40 pada kecepatan air 1 ml/mnt, dari kromatografi diperoleh
luas area kuersetin untuk memperoleh regresi liner dengan persamaan
y=bx + a.
 PERHITUNGAN

A. Eluen

60
Asetonitril = x 400 = 240 ml
100

40
Buffer fosfath 2 0,05 M = x 400 = 160 ml
100

Estimasi waktu 4 jam, 1 jam 60 menit

Laju alir 1 ml/menit

4 jam = 240 menit 240 ml/menit ̴ 400 ml/menit (dilebihkan)

B. Standar Kuersetin

50 mg kuersetin dalam 100 ml methanol dengan konsentrasi 500 ppm

Konsentrasi 5, 10, 20, 30, 40, 50 ppm

 Konsentrasi 5
V1 . N1 = V2 . N2
V1 . 500 = 10 . 5
V1 = 0,1 ml
 Konsentrasi 10
V1 . N1 = V2. N2
V1 . 500 = 10 . 10
V1 = 0,2 ml
 Konsentrasi 20
V1 . N1 = V2 . N2
V1. 500 = 10 . 20
V1 = 0,4 ml
 Konsentrasi 30
V1 . N1 = V2 . N2
V1. 500 = 10 . 30
V1 = 0,6 ml
 Konsentrasi 40
V1 . N1 = V2. N2
V1 .500 = 10. 40
V1 = 0,8 ml
 Konsentrasi 30
V1 . N1 = V2. N2
V1.500 = 10 . 50
V1 = 1 ml