Kontrol biologis penyakit tanaman bakteri dengan strain Lactobacillus

plantarum dipilih untuk aktivitas spektrum luas mereka

Abstrak
Penggunaan bakteri asam laktat (BAL) untuk mengendalikan beberapa patogen yang
mempengaruhi tanaman berbeda dipelajari, yaitu, Pseudomonas
syringae pv. actinidiae dalam buah Kiwi, Xanthomonas
arboricola pv. Pruni di Prunus dan Xanthomonas fragariae dalam strawberry. Prosedur
skrining berdasarkan in vitro dan dalam uji planta dari tiga patogen bakteri berhasil dalam
memilih strain LAB potensial sebagai agen kontrol biologis. Aktivitas antagonis dari 55
strain pertama kali diuji in vitro dan strain Lactobacillus plantarum CC100, PM411 dan
TC92, dan Leuconostoc mesenteroides CM160 dan CM209 dipilih karena aktivitas spektrum
yang luas. Keampuhan biokontrol dari strain yang dipilih dinilai menggunakan pendekatan
multi-pathosystem dalam kondisi rumah kaca. L. plantarum PM411 dan TC92 mencegah
ketiga patogen dari menginfeksi inang tanaman yang sesuai. Selain itu, kinerja biokontrol
PM411 dan TC92 sebanding dengan produk referensi ( Bacillus
amyloliquefaciens D747, Bacillus subtilis QST713, chitosan, acibenzolar-S-methyl, tembaga
dan kasugamycin) dalam percobaan lapangan dan lapangan. Mekanisme penghambatan in
vitro PM411 dan TC92 didasarkan, setidaknya sebagian, pada efek penurunan pH dan
produksi asam laktat. Selain itu, kedua strain menunjukkan tingkat ketahanan hidup yang
sama pada permukaan daun. PM411 dan TC92 dapat dengan mudah dibedakan karena
pengetikan urutan multilokus yang berbeda dan profil DNA polimorfik acak yang
diamplifikasi.

Kata kunci: penyakit tanaman bakteri, Lactobacillus plantarum , Pseudomonas

syringae pv. actinidiae , Xanthomonas arboricola pv. pruni , Xanthomonas fragariae
1. PERKENALAN

Peningkatan perdagangan global, bersama dengan perubahan iklim dan keterbatasan dalam
produk perlindungan tanaman, telah mendukung munculnya dan pembentukan penyakit
tanaman baru yang, pada gilirannya, menyebabkan kerugian panen yang signifikan
(Lamichhane et al., 2015 ; Yáñez - López et al., 2012 ). Produksi buah, misalnya, terancam
oleh beberapa penyakit tanaman bakteri seperti kanker bakteri buah Kiwi yang disebabkan
oleh Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa), tempat bakteri dari buah-buahan batu yang
disebabkan oleh Xanthomonas arboricola pv. pruni (Xap) dan bintik sudut daun stroberi
yang disebabkan oleh Xanthomonas fragariae (Xf) (Donati et al., 2014 ; Kim et al., 2016 ;
Lamichhane, 2014 ). Organisasi Perlindungan Tanaman Eropa dan Mediterania (EPPO)
mencantumkan Psa, Xap dan Xf sebagai organisme karantina.

Mengelola penyakit ini terutama bergantung pada aplikasi pencegahan bakterisida yang
mengandung senyawa tembaga atau antibiotik (Cameron & Sarojini, 2014 ;
Lamichhane, 2014 ). Namun, pemilihan populasi patogen yang resisten dan fitotoksisitas
adalah kelemahan utama praktik ini (Lalancette & McFarland, 2007 ; McManus, Stockwell,
Sundin, & Jones, 2002 ). Secara keseluruhan, ketergantungan pada pestisida konvensional
perlu dikurangi dan kerangka kerja pengelolaan hama terpadu (PHT) diimplementasikan
(Lamichhane et al., 2015 ). Pemilih tanaman pertahanan acibenzolar ‐ S - metil (ASM) telah
dilaporkan sebagai senyawa alternatif yang potensial untuk mengelola kanker bakteri buah
kiwi (Cellini et al., 2014 ) dan bercak daun sudut strawberry (Braun &
Hildebrand, 2013 ). Demikian juga, kitosan menunjukkan aktivitas antimikroba dan bertindak
sebagai pemilih mekanisme pertahanan tanaman, menjadikannya agen alternatif yang
potensial untuk mengelola kanker bakteri buah kiwi (Cameron & Sarojini, 2014 ). Namun
demikian, fitotoksisitas dan variabilitas yang tinggi dalam respon pada tanaman inang di
lapangan telah dilaporkan, yang menimbulkan pertanyaan tentang kelayakannya dalam
perlindungan tanaman (Reglinski et al., 2013 ). Oleh karena itu, minat dalam memilih
mikroorganisme bermanfaat yang dapat digunakan untuk mengembangkan agen pengendali
hayati (BCA) telah meningkat sebagai akibat biopestisida mikroba menjadi alat yang sangat
diperlukan dan kuat dalam IPM (Matyjaszczyk, 2015 ). Sementara strain bakteri, jamur dan
virus untuk mengelola penyakit tanaman dan hama sekarang tersedia secara komersial
(Matyjaszczyk, 2015 ; Montesinos & Bonaterra, 2017 ), karena pengaruh faktor biotik dan
abiotik, kemanjuran produk biologis dapat bervariasi antara uji coba atau penurunan kondisi
lapangan (Sundin, Werner, Yoder, & Aldwinckle, 2009 ). Keterbatasan seperti itu telah
merangsang pencarian strain mikroorganisme baru yang memiliki spektrum luas aktivitas
antagonis terhadap patogen tanaman. Bakteri asam laktat (LAB) adalah kelompok yang
menarik yang sering ditemukan dalam mikrobioma terkait tanaman (Trias, Bañeras, Badosa,
& Montesinos, 2008 ; Zwielehner et al., 2008 ).

LAB adalah kandidat yang baik untuk mengembangkan biopestisida mikroba, karena mereka
termasuk beberapa strain yang telah dikategorikan oleh Administrasi Makanan dan Obat-
obatan AS yang Secara Umum Dianggap Aman dan oleh Otoritas Keamanan Pangan Eropa
memiliki Asumsi Keamanan Berkualifikasi. Selain itu, banyak strain LAB menunjukkan
aktivitas antimikroba berkat produksi metabolit aktif seperti asam organik, bakteriosin, dan
beberapa senyawa bioaktif penghambat (Reis, Paula, Casarotti, & Penna, 2012 ). LAB telah
banyak dilaporkan sebagai biopreservatif sayuran dan buah-buahan, menghambat
pertumbuhan bakteri patogen bawaan makanan dan jamur pembusuk (Crowley, Mahony, &
Van Sinderen, 2013 ; Trias, Bañeras, Badosa, & Montesinos, 2008 ; Trias, Bañeras,
Montesinos , & Badosa, 2008 ). Selain itu, beberapa strain LAB juga telah dilaporkan sebagai
BCA potensial terhadap beberapa bakteri patogen tanaman (Roselló et al., 2013 ; Tsuda et
al., 2016 ; Visser, Holzapfel, Bezuidenhout, & Kotze, 1986 ).

BCA harus dipilih dengan hati-hati karena tidak semua spesies atau strain memberikan
perlindungan tanaman terhadap patogen. Strategi skrining memungkinkan pemilihan strain
dengan aktivitas penekan patogen termasuk tes antagonisme in vitro dan penilaian
pencegahan infeksi pada organ tanaman yang terpisah dan seluruh tanaman (Haidar et
al., 2016 ; Köhl, Postma, Nicot, Ruocco, & Blum, 2011 ; Roselló et al., 2013 ). Selain itu,
minat komersial yang tajam dalam LAB telah memicu studi untuk menentukan jenis yang
paling menjanjikan, karena identifikasi dan karakterisasi mereka merupakan persyaratan
untuk pendaftaran BCA. Teknik pengetikan didasarkan pada analisis DNA dan dua yang
paling umum digunakan adalah pengetikan urutan multilokus (MLST) (de las Rivas et
al., 2006 ; Tanganurat et al., 2009 ) dan DNA polimorfik acak ‐ PCR (RAPD ‐ PCR) (López,
Torres, & Ruiz - Larrea, 2008 ).

Tujuan dari penelitian ini adalah empat kali lipat: (a) menyaring LAB terkait tanaman
menggunakan tes in vitro dan memilih galur antagonis dengan aktivitas spektrum luas
terhadap Psa, Xap dan Xf, (b) menilai kemanjuran biokontrol dari galur terpilih dalam
mencegah infeksi oleh tiga patogen pada tanaman pot (buah kiwi, Prunus dan stroberi) di
rumah kaca, (c) membandingkan kinerja biokontrol dari strain yang dipilih untuk referensi
produk dalam percobaan semi-lapangan dan lapangan dan (d) mengkarakterisasi strain yang
dipilih dalam hal untuk mekanisme yang terlibat dalam aktivitas antibakteri in vitro terhadap
Psa, Xap dan Xf dan MLST dan profiling RAPD-PCR.

2. BAHAN-BAHAN DAN METODE-METODE

2.1. Strain bakteri dan kondisi kultur

Sebanyak 55 isolat BAL terkait tanaman dari koleksi budaya Institut Teknologi Pangan dan
Pertanian serta Pusat Inovasi dan Pengembangan Kesehatan Tumbuhan (INTEA - CIDSAV)
dipilih untuk penelitian ini (Tabel ( Tabel 1 ). 1 ). Mutan resisten rifampisin spontan tipe
liar Lactobacillus plantarum PM411 dan TC92 (PM411R dan TC92R) digunakan dalam studi
kolonisasi tanaman (Roselló et al., 2013 ).

Tabel 1

Bakteri asam laktat dan strain patogen tanaman bakteri yang digunakan dalam penelitian ini

Asal Media
Jenis Ketegangan kode a Tuan rumah geografis pertumbuhan b

Bakteri asam laktat c

Lactobacillus AC58, AC59, AC73, Terong Spanyol NYONYA

plantarum AC81, AC84

BC24, BC30, BC37, Chard Spanyol NYONYA

BC50, BC66

CC31, CC100, CC121 Timun Spanyol NYONYA

CC70, CC85, CC93 Kubis Spanyol NYONYA

 Asal Media
Jenis Ketegangan kode a Tuan rumah geografis pertumbuhan b

CM450 Courgette Spanyol NYONYA

CM466 Kesemak Spanyol NYONYA

FC248, FC534 Ara Spanyol NYONYA

NC568 Loquat Spanyol NYONYA

PC40, PC49, PC67 kentang Spanyol NYONYA

PM314, PM340, Pir Spanyol NYONYA

PM411, PM411R d

RC526 Blackberry Spanyol NYONYA

TC26, TC28, TC35, Tomat Spanyol NYONYA

TC41, TC43, TC44,
TC46, TC54, TC60,
TC69, TC71, TC92,
TC92R c , TC97,
TC101, TC102, TC110,
TM106
 Asal Media
Jenis Ketegangan kode a Tuan rumah geografis pertumbuhan b

Lactobacillus SE217, SE294, SE304, Kacang kedelai Spanyol NYONYA

pentosus SE307

BM305 Brokoli Spanyol NYONYA

Leuconostoc CM160 ceri Spanyol NYONYA

mesenteroides

CM209 Selada Spanyol NYONYA

PM366 Persik Spanyol NYONYA

Lactococcus SE303 Kacang kedelai Spanyol NYONYA

lactis

Tidak FC560 Ara Spanyol NYONYA

teridentifikasi

Patogen tanaman bakteri

Psa CFBP7286, CFBP7286 Actinidia Italia Luria ‐ Bertani

‐ GFPuv e chinensis

NCPPB3739 Actinidia Jepang Luria ‐ Bertani

deliciosa
 Asal Media
Jenis Ketegangan kode a Tuan rumah geografis pertumbuhan b

IVIA 3700-1 f A. deliciosa Portugal Luria ‐ Bertani

Xap CFBP3894 Prunus salicina Selandia Luria ‐ Bertani

Baru

CFBP5563 Prunus persica Perancis Luria ‐ Bertani

Xf IVIA XF349–9A f Fragaria vesca Spanyol B medium

CECT549 Fragaria Amerika B medium

chiloensis Serikat
var. ananassa

CECT: Colección Española de Cultivos Tipo; CFBP: La Collection Française de Bactéries

Phytopathogènes; INTEA - CIDSAV: Institut Teknologi Pangan dan Pertanian dan Pusat
Inovasi dan Pengembangan Kesehatan Tumbuhan; IVIA: Instituto Valenciano de
Investigaciones Agrarias; BAL: bakteri asam laktat; NCPPB: Koleksi Nasional Bakteri
Patogen Tumbuhan; Psa: Pseudomonas syringae pv. actinidiae ; Xap, Xanthomonas
arboricola pv. pruni ; Xf, Xanthomonas fragariae .

a
 CFBP (Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), Prancis); CECT (Valencia,
Spanyol); IVIA (Valencia, Spanyol); NCPPB (Fera, Inggris).

b
 MRS (de Man, Rogosa dan Sharpe), medium B (Hazel & Civerolo, 1980 ).

c
 Koleksi budaya INTEA - CIDSAV (Roselló et al., 2013 ; Trias, Bañeras, Badosa, &
Montesinos, 2008 ; Trias, Bañeras, Montesinos, & Badosa, 2008 ). Strain BAL diidentifikasi
pada tingkat spesies berdasarkan urutan 16S rDNA. " Plant " L. plantarum dikonfirmasi
menggunakan primer spesifik spesies (PLANT1 / LOWLAC) (Chagnaud, Machinis, Coutte,
Marecat, & Mercenier, 2001 ) dengan amplifikasi PCR. Isolat positif untuk PCR spesifik
spesies kemudian diuji dengan multiplex PCR pada langkah kedua untuk identifikasi L.
plantarum , L. paraplantarum dan L. pentosus dengan primer berbasis gen recA paraF, pentF,
planF dan pREV (Torriani, Felis, & Dellaglio, 2001 ).

d
 Mutan spontan dari strain L. plantarum PM411 dan TC92 yang kebal terhadap rifampisin.

Atas perkenan Dr. F. Spinelli, Departemen Ilmu Pertanian dan Pangan, Universitas Bologna,
Italia (Spinelli, Donati, Vanneste, Costa, & Costa, 2011 ).

Atas perkenan Dra MM Lopez, IVIA, Valencia, Spanyol.

Tiga strain P. syringae pv. actinidiae (Psa) dan dua galur Xap dan Xf digunakan sebagai
target bakteri dalam uji antagonisme in vitro dan uji efikasi biokontrol
(Tabel ( Tabel 1 ). 1 ). Psa CFBP7286-GFPuv, yang resisten terhadap kanamisin, digunakan
untuk studi kolonisasi pada tanaman buah Kiwi (Spinelli et al., 2011 ).

Kultur disiapkan untuk penggunaan rutin dari isolat yang diawetkan pada suhu -80 ° C. LAB
ditanam pada agar de Man, Rogosa dan Sharpe (MRS) (Oxoid, Basingstoke, UK) pada 23 ° C
selama 48 jam. Psa dan Xap ditanam pada agar Luria-Bertani pada suhu 23 ° C selama 24
jam dan Xf ditumbuhkan pada medium B (Hazel & Civerolo, 1980 ) pada suhu 23 ° C selama
24 jam. Suspensi bakteri disiapkan dalam air suling pada 1 - 5 x 10 8 unit pembentukan
koloni (CFU) / mL.

2.2. Bahan tanaman dan kondisi rumah kaca

Tanaman buah Kiwi berusia dua tahun dan planlet buah Kiwi berusia 15 hingga 30 hari
( Actinidia chinensis var. Deliciosa cv. Hayward), Prunus amygdalus × Prunus amica parica
(cf. GF-677) yang berusia 15 hingga 30 hari. , dan tanaman strawberry yang disimpan dingin
( Fragaria × ananassa cv. Darselect) diperoleh dari pembibitan komersial (SolJardí, Jafre,
Spanyol; Vitroplant, Cesena, Italia; Agromillora Iberica, Barcelona, Spanyol; dan Planasa,
Valtierra, Spanyol, masing-masing). Tanaman pot dengan sekitar 8 hingga 10 daun per
tanaman digunakan dan disimpan di rumah kaca pada suhu 26 ± 2 ° C, kelembaban relatif (±)
60 ± 10% dan cahaya 16: 8 jam: fotoperiode gelap. Pemupukan dan irigasi nitrogen-fosfat-
kalium (NPK) standar, serta semprotan insektisida dan mitisida diterapkan. Tanaman yang
diinokulasi dengan Psa, Xap atau Xf dipelihara di rumah kaca kelas II (yaitu, rumah kaca
biosafety karantina tingkat EPPO A2).
2.3. Aktivitas antagonis in vitro

Aktivitas antagonis 55 isolat LAB diuji secara in vitro pada Psa (NCPPB3739 dan IVIA
3700-1), Xap (CFBP3894 dan CFBP5563) dan Xf (IVIA XF349-99 dan
CECT549). Percobaan dilakukan dua kali menggunakan dua prosedur. Satu pengujian
dilakukan dengan uji agar-agar di agar-agar laktosa-bromokresol ungu (LBP) seperti pada
Trias, Bañeras, Badosa, dan Montesinos ( 2008 ), meskipun dengan beberapa
modifikasi. Secara khusus, agar-agar lembut LBP (agar-agar 0,7%) dicampur dengan
suspensi Psa atau Xap, sedangkan agar-agar lunak B sedang dicampur dengan suspensi
Xf. Untuk pengujian lainnya, cakram berdiameter 5 mm memotong dari kultur 24 jam isolat
LAB pada agar MRS diendapkan pada permukaan pelat yang mengandung kultur patogen
target. 0,5 mL dari suspensi patogen target pada 5 × 10 7 CFU / mL dicampur dalam 4,5 mL
Luria-Bertani (Psa dan Xap) atau dengan media B (Xf) agar lembut (agar-agar 0,7%) dan
dilapiskan pada piring yang berisi media yang sama. Pelat diinkubasi pada 23 ° C, dan
diameter zona penghambatan diukur setelah 24 dan 48 jam.

2.4. Uji efikasi biokontrol dalam kondisi rumah kaca

Sebanyak lima isolat BAL ( L. plantarum CC100, PM411, TC92 dan Leuconostoc

mesenteroides CM160 dan CM209) dievaluasi. Tanaman buah Kiwi berumur dua
tahun, Prunus , dan strawberry yang telah disemprot dalam pot untuk disemprotkan dengan
suspensi 10,8 CFU / mL sel LAB menggunakan penyemprot tangan (Herkules, Nuair,
Robassomero, Italia). Tanaman kemudian disimpan dalam kantong plastik di rumah kaca
untuk mencapai kondisi kesehatan reproduksi yang tinggi. Setelah 24 jam, tanaman
diinokulasi dengan suspensi patogen yang sesuai pada 1–5 × 10 8 CFU / mL (IVIA 3700-1
Psa, CFBP5563 Xap atau CECT549 dari Xf). Suspensi patogen dicampur dengan tanah
diatom (1 mg / mL) dan diterapkan untuk limpasan menggunakan penyemprot tangan. Sekali
lagi, tanaman ditutup dengan kantong plastik selama 24 jam dan disimpan di rumah kaca
kelas II. Streptomisin yang dirawat (Sigma, St. Louis, MO) (100 mg / L) dan tanaman yang
diolah air dimasukkan sebagai kontrol. Kejadian penyakit dihitung sebagai persentase daun
yang terinfeksi dan ditentukan dalam setiap ulangan pada 15 hingga 21 hari setelah inokulasi.

2.5. Kelangsungan hidup L. plantarum PM411 dan TC92 pada daun

Tanaman pot disemprotkan ke limpasan dengan suspensi sel 10,8 CFU / mL PM411R (dalam
kasus stroberi dan planlet buah Kiwi berusia 15 hingga 30 hari) atau TC92R ( Prunus ),
kemudian ditutup dengan kantong plastik dan dipelihara dalam rumah kaca seperti dijelaskan
di atas. Pemantauan tingkat populasi PM411R dan TC92R dilakukan seperti yang dijelaskan
Roselló, Francés, Daranas, Montesinos, dan Bonaterra ( 2017 ). Tiga daun diambil dari
masing-masing ulangan pada 0, 1, 2, 5, 8 dan 10 hari pasca inokulasi. Tingkat populasi
PM411R dan TC92R dinyatakan sebagai Log 10 CFU per daun.

2.6. Pengaruh L. plantarum PM411 pada kelangsungan hidup Psa pada tanaman buah Kiwi

Tanaman buah kiwi dalam pot (planlet berumur 15 hingga 30 hari) disemprot dengan
suspensi sel 10,4 CFU / mL PM411, ditutup dengan kantong plastik dan dipelihara di rumah
kaca seperti dijelaskan di atas. Setelah 24 jam, tanaman diinokulasi dengan suspensi Psa pada
1-5 × 10 8 CFU / mL (CFBP7286-GFPuv) untuk limpasan menggunakan hand-sprayer,
ditutup dengan kantong plastik dan dipelihara di rumah kaca. Streptomisin yang dirawat
(Sigma) (100 mg / L) dan tanaman yang diolah air dimasukkan sebagai kontrol. Untuk
memantau populasi Psa epifit dan endofit, tiga daun per ulangan disampel pada 1 dan 4 hari
pasca inokulasi. Daun ditimbang dan dihomogenkan dengan kuat dalam 20 mL 50-mM
buffer fosfat steril dan 0,1% pepton selama 5 menit untuk mengumpulkan populasi
epifit. Daun yang sama juga digunakan untuk menilai populasi endofit yang konsisten dengan
Cellini et al. ( 2018 ). Pengenceran sampel epifit dan endofit yang sesuai diunggulkan ke
lempeng agar Luria-Bertani diubah dengan 100 μg / mL kanamycin (Sigma) untuk memilih
CFBP7286-GFPuv dan 100 μg / mL cycloheximide (Sigma) untuk menghindari pertumbuhan
jamur. Pelat diinkubasi pada suhu 23 ° C selama 48 jam, dan koloni fluoresens hijau dihitung
di bawah sinar UV. Tingkat populasi epifit dan endofit Psa diekspresikan sebagai Log 10 CFU
per daun atau g, masing-masing.

2.7. Uji efikasi biokontrol dalam kondisi semi-lapangan

Kemanjuran L. plantarum PM411 dan TC92 dalam mengendalikan Psa, Xap dan Xf

dipelajari dalam uji semi-lapangan dan dibandingkan dengan produk referensi. Tes semi-
lapangan terdiri dari aplikasi perawatan di lapangan dan menjaga tanaman di sana selama 7
hari sebelum diangkut ke rumah kaca kelas II untuk inokulasi patogen.

Pot tanaman buah Kiwi berusia dua tahun dibawa ke kebun percobaan yang berlokasi di
Zevio (Verona, Italia). Perawatan yang diberikan adalah: (a) suspensi sel PM411 pada
10 8 CFU / mL disiapkan seperti yang dijelaskan di atas, (b) Bacillus amyloliquefaciens D747
(Amylo-X, 25% b / b ai, 5 × 10 10 CFU / g; Biogard, Monza Brianza, Italia) pada 0,375 g ai
L −1 , (c) tembaga oksida (Nordox, 75% b / b ai; Comercial Química Massó, Barcelona,
Spanyol) pada 0,45 g ai L −1 .

Pot Prunus dan tanaman stroberi dibawa ke kebun percobaan yang berlokasi di Stasiun

Percobaan Pertanian Mas Badia (Girona, Spanyol). Perlakuan yang dilakukan adalah: (a)
suspensi sel TC92 atau PM411 pada 10 8 CFU / mL disiapkan seperti dijelaskan di atas,
(b) Bacillus subtilis QST713 (Serenade Max, 15,67% b / b ai; Bayer Crop Science, Monheim
am Rhein, Jerman ) pada 0,55 g ai L −1 , (c) kitosan (Biorend, 2,5% v / v ai; Bioagro,
Santiago, Chili) pada 7,5 g ai L -1 , (d) ASM (Bion, 50% b / b ai ; Syngenta, Basel, Swiss )
pada 0,075 g ai L −1 , (e) tembaga hidroksida (Kocide, 35% b / b ai; Certis, Elche, Spanyol)
pada 1,05 g ai L −1 dan (f) kasugamycin (Kasumin , 8% b / b ai; Lainco, Barcelona, Spanyol)
pada 0,16 g / L. Dalam semua percobaan, tanaman yang diolah air dimasukkan sebagai
kontrol. Semua perawatan, kecuali kasugamycin, diterapkan dua kali, 7 dan 1 hari sebelum
inokulasi, menggunakan hand-sprayer untuk limpasan.

Tanaman diinokulasi dengan semprotan dengan suspensi patogen yang sesuai pada
10 8 CFU / mL (Psa CFBP7286, Xap CFBP5563, Xf CECT549) seperti yang dijelaskan
dalam percobaan rumah kaca. Setelah inokulasi, tanaman ditutup dengan kantong plastik
selama 48 jam dan dirawat di rumah kaca kelas II. Kejadian penyakit ditentukan seperti yang
dijelaskan sebelumnya (lihat percobaan rumah kaca) untuk setiap ulangan pada 15-21 hari
setelah inokulasi.

2.8. Uji efektivitas biokontrol dalam kondisi kebun

Percobaan lapangan dilakukan pada tahun 2017 di kebun komersial ( A.

chinensis var. Deliciosa , cv. Hayward) yang berlokasi di Sarna, dekat dengan Faenza (Emilia
Romagna, Italia). Penyakit ini telah hadir di kebun ini pada tahun-tahun sebelumnya dengan
tekanan sedang. Manajemen budaya standar (yaitu, fertigasi, pemangkasan hijau dan musim
dingin, penipisan dan penyerbukan dibantu) diadopsi. Untuk setiap tanaman (desain
eksperimental dijelaskan di bawah), empat tunas tanpa gejala Psa dipilih dan ditandai pada
awal percobaan. Perlakuan yang dilakukan adalah: (a) suspensi sel PM411 pada 10 8 CFU /
mL disiapkan seperti dijelaskan di atas, (b) B. amyloliquefaciens D747 (Amylo-X 5 ×
10 10 CFU / g) pada 0,375 g ai L -1 , dan (c) tembaga oksida (Nordox) pada 0,45 g ai
L −1 . Instalasi yang diolah air dimasukkan sebagai kontrol. Semua perlakuan diterapkan
setiap 14 hari atau setelah setiap curah hujan (≥4 mm hujan), dalam hal kejadian hujan terjadi
pada 7 hari atau lebih setelah perawatan. Aplikasi tembaga dimulai saat istirahat (fenologis
Biologische Bundesanstalt, Bundessortenamt und CHemische Industrie (BBCH) 03) dan
diulang sampai buah tumbuh 30% dari ukuran akhir (BBCH 73). Aplikasi BCA dilakukan
pada tingkat bunga 10, 50 dan 100% dan diulang sampai BBCH 73 tercapai. Insiden Psa
dinilai dua kali selama musim, dengan penilaian kedua terjadi setelah perkembangan penyakit
dihentikan dan dihitung sebagai persentase daun bergejala pada 20 pucuk per
pengulangan. Gejala psa dikonfirmasi oleh identifikasi molekuler setelah Gallelli, Talocci,
L'aurora, dan Loreti ( 2011 ).

2.9. Karakterisasi strain PM411 dan TC92

Peran berbagai metabolit yang dimainkan pada aktivitas antibakteri dari strain PM411 dan
TC92 terhadap patogen target dipelajari bersama dengan karakterisasi genotipik.

2.9.1. Pembuatan profil metabolik

Tes difusi agar menggunakan supernatan bebas sel (CFS) dilakukan. Strain PM411 dan TC92
ditanam dalam kaldu MRS selama 24 jam pada 30 ° C dengan pengocokan (100 rpm). CFS
diperoleh dengan sentrifugasi (10.000 g selama 10 menit) (5.810 R; Eppendorf, Hamburg,
Jerman) dan disaring (Whatman FP30 / 0.45; Millipore, Bedford, MA). 20 μL CFS
diendapkan pada permukaan lempengan yang mengandung kultur patogen target (Psa IVIA
3700-1, Xap CFBP3894, dan Xf IVIA XF349-99) yang disiapkan seperti dijelaskan di atas
(lihat uji antagonisme in vitro, Luria - Bertani untuk Psa dan media Xap dan B untuk
Xf). Pelat diinkubasi pada 23 ° C, dan diameter zona penghambatan diperiksa pada 24 dan 48
jam. Fraksi CFS terpapar pada perlakuan yang berbeda (CFS dinetralkan, dan CFS
dinetralkan diobati dengan proteinase K, trypsin, α-chymotrypsin atau katalase) seperti yang
dijelaskan oleh Trias, Bañeras, Montesinos, dan Badosa ( 2008 ), dan aktivitas antimikroba
dinilai oleh uji difusi agar (seperti dijelaskan di atas). Tiga ulangan independen untuk setiap
fraksi CFS dilakukan. Asam laktat dikuantifikasi dalam CFS menggunakan kit komersial
Enzytec D‐ / L-Lactic Acid (Boehringer Mannheim / R-Biopharm AG, Darmstadt, Jerman)
mengikuti instruksi pabrik. 1:10 CFS encer dengan air redistilled digunakan untuk
pengukuran. Dua percobaan dilakukan dengan tiga ulangan independen.

2.9.2. Karakterisasi molekuler PM411 dan TC92

1. Ekstraksi DNA. DNA genomik dari suspensi sel pada 10 8 CFU / mL dari 45 L.
plantarum isolat (koleksi kultur INTEA-CIDSAV, Tabel 1 ) 1 ) diekstraksi seperti
yang dijelaskan oleh Llop, Caruso, Cubero, Morente, dan López
 ( 1999 ). Konsentrasi dan kemurnian DNA dinilai menggunakan Spektrofotometer
NanoDrop ND-1000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA).

2. Amplifikasi dan kondisi PCR. Campuran amplifikasi dan kondisi PCR untuk

analisis MLST dan RAPD-PCR diuraikan dalam Tabel2. 2 . Produk amplifikasi
dipisahkan oleh elektroforesis pada gel agarosa 1,5% (b / v) dalam 1 × Tris-asetat
Disodium ethylenediaminetetraacetate dihydrate (EDTA) dan diwarnai dengan
Sybr Safe (Brankas Aman, FBR, Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad,
CA). Gambar gel ditangkap dengan sistem pencitraan (FX ‐ 20M; Vilvert,
Lourmat, Prancis).

Meja 2
Campuran amplifikasi dan kondisi PCR

Pendekatan
PCR Campuran amplifikasi a Kondisi PCR b

MLST 1 × buffer PCR, 2,5 mM 95 ° C selama 10 menit; 30 siklus 95

MgCl 2 , 0,2 mM dNTP, ° C selama 30 detik, 54 ° C ( gdh )
masing-masing 0,2 μM atau 48 ° C ( pgm, ddl, gyrB, purK1,
primer, 1 U Taq dan 20-ng mutS ) selama 60 detik, 72 ° C
DNA (volume reaksi, 25 μL) selama 60 detik; dan perpanjangan 72
° C selama 10 menit.

RAPD ‐ 1 × buffer PCR, 1,5 mM Untuk P3 dan P4: 94 ° C selama 3

PCR MgCl 2 , 0,2 mM dNTP,
masing-masing 0,2 μM
primer, 3,75 U Taq , dan 50-
ng DNA (volume reaksi, 25
μL)
menit; 30 siklus 94 ° C selama 1
menit, 36 ° C selama 2 menit, 72 ° C
selama 2 menit; dan perpanjangan
pada 72 ° C selama 2 menit.
Untuk 512Fb, Inva1 dan P7: 94 ° C
selama 4 menit; 45 siklus 94 ° C
selama 1 menit, 35 ° C selama 1
menit, 72 ° C selama 1 menit; dan
 Pendekatan
PCR Campuran amplifikasi a Kondisi PCR b

perpanjangan pada 72 ° C selama 5

menit.

dNTPs: deoxynucleotides; MLST: mengetik urutan multilokus; RAPD - PCR: DNA

polimorfik acak yang diamplifikasi - PCR.

a
 dNTPs (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA); primer (Sigma Aldrich, Barcelona,
Spanyol); Taq , Taq DNA polimerase (Biotools, Madrid, Spanyol untuk MLST dan
Invitrogen untuk RAPD-PCR).

b
 PCR dilakukan dalam sistem PCR GeneAmp 9,700 (Biosystems Terapan).

3. Analisis MLST. Gen rumah tangga yang mengkode protein berikut dipilih untuk
analisis: phosphoglucomutase ( pgm ), D-alanin-D-alanin ligase ( ddl ), subunit
DNA gyrase ( gyrB ), subunit ATPase dari phosphoribosylaminoimidazole
carboxylase ( purK1 ) ( gdh ) dan protein perbaikan ketidakcocokan DNA
( mutS ). Primer amplifikasi dan sekuensing yang digunakan telah dijelaskan
sebelumnya oleh de las Rivas et al. ( 2006 ), kecuali untuk gen gdh di mana
primer dirancang dalam pekerjaan ini (gdhF 5′-GGTTACACCCATCCGTTAAT ‐
3 ′ dan gdh 5′ TT TTCTTCAAAAGTCCAGTCA ‐ 3 ′, 901 1 bp fragmen). Produk
amplifikasi dimurnikan dengan kit solusi desalting dan pemekatan DNA QIAEX
(QIAGEN GmbH, Hilden, Germany) untuk pengurutan langsung menggunakan
Automatic Sequencer 3730XL (Macrogen, Seoul, Korea Selatan). Penyelarasan
dan perbandingan urutan dilakukan menggunakan BioEdit Sequencing Editor
( http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html ). Untuk setiap gen, urutan yang
diperoleh dalam penelitian ini dari 45 L. plantarum isolat (Tabel ( Tabel1)1 )
dibandingkan satu sama lain dan urutan 26 isolat plantarum sebelumnya
dilaporkan (de las Rivas et al., 2006 ; Tanganurat et al., 2009 ). Nomor alel
ditugaskan mengikuti kode yang dijelaskan sebelumnya (de las Rivas et al., 2006 ;
Tanganurat et al., 2009 ). Sekuens alel baru disimpan dalam database GenBank di
bawah nomor aksesi KT247498 (allele 4 pgm ), KT247499 (allele
 7 ddl ), KT247496 (allele 9 purK1 ), KT247497 (allele
10 purK1 ), KT247501 (alel 11 gdh ) dan KT247500 (allele 9 mutS ). Setiap strain
didefinisikan oleh profil alel atau tipe urutan (ST) seperti yang dijelaskan dalam
de las Rivas et al. ( 2006 ).

4. Analisis RAPD-PCR. Amplifikasi PCR dari isolat 45 L.

plantarum dilakukan. Primer P3 (Tailliez, Tremblay, Dusko Ehrlich, &
Chopin, 1998 ), Inva1 (Rahn et al., 1992 ), 512Fb (Holt & Cote, 1998 ), P4 dan P7
(Di Cagno et al., 2010 ), dengan urutan dipilih secara sewenang-wenang,
digunakan secara tunggal dalam reaksi terpisah. Analisis pola dilakukan dengan
perangkat lunak Image Lab versi 4.1 (Bio - Rad Laboratories, Hercules, CA).

2.10. Desain eksperimental dan analisis data

Tes antagonisme in vitro terdiri dari tiga ulangan independen dari masing-masing BAL dan
dilakukan dua kali. Diameter zona hambatan ditransformasikan menjadi data biner ("1" untuk
keberadaan dan "0" karena tidak adanya zona hambatan) untuk analisis cluster
hirarkis. Koefisien pencocokan kesamaan yang sederhana menggunakan metode pasangan
kelompok tak tertimbang dengan rata-rata aritmatika (UPGMA) sebagai algoritma cluster
digunakan (paket program Sistem Nonomis Taksonomi NTSYSpc, Perangkat Lunak Exeter,
New York City, NY). Untuk setiap strain patogen target, nilai "0" di kedua pengujian
dianggap sebagai tidak ada aktivitas penghambatan, nilai "1" hanya dalam satu pengujian
dianggap sebagai aktivitas penghambatan moderat, sedangkan nilai "1" di kedua pengujian
itu dianggap sebagai aktivitas penghambatan tinggi.

Uji efikasi biokontrol dalam kondisi rumah kaca dan semi-lapangan terdiri dari tiga ulangan
biologis independen per perlakuan dengan lima tanaman per ulangan. Dua percobaan
independen dilakukan di ketiga pathosystems dalam percobaan rumah kaca dan semi-
lapangan kecuali untuk uji semi-lapangan dan pemantauan di Psa yang dilakukan sekali. Uji
efektivitas biokontrol untuk Psa di lapangan terdiri dari empat blok acak dari lima pabrik per
perlakuan. Setiap blok diulangi dalam baris yang terpisah. Insiden penyakit dan tingkat
populasi Psa menjadi sasaran analisis varians, dan nilai rata-rata dibandingkan dengan
menggunakan uji perbedaan paling signifikan pada p <0,05. Analisis dilakukan dengan
prosedur General Linear Model (GLM) dari Sistem Analisis Statistik untuk Komputer Pribadi
(PC-SAS) (Versi 8.2; SAS Institute Inc., Cary, NC).
Pemantauan populasi BAL terdiri dari tiga ulangan biologis independen dengan lima tanaman
per ulangan dan dua percobaan independen.

Profil alelik setiap strain L. plantarum yang diperoleh dengan analisis MLST digunakan
untuk menyelidiki kompleks klon (CC) menggunakan metode pohon spanning minimum
(MST) (Bionumerics v7.5, Matematika Terapan, Sint-Martens-Latem, Belgia). Pita DNA
polimorfik yang diperoleh dengan analisis RAPD ditransformasikan menjadi matriks
binomial (“1” untuk keberadaan dan “0” karena tidak adanya fragmen). Sebuah dendrogram
dengan lima seri profil RAPD-PCR dari 45 L. plantarum isolat dihasilkan menggunakan
koefisien Dice of similarity dan metode UPGMA (NTSYSpc).

3. HASIL

3.1. Aktivitas antagonis terhadap patogen tanaman bakteri

Beberapa isolat BAL sangat menghambat pertumbuhan (diameter zona hambat> 10 mm) dari
Psa (NCPPB3739 dan IVIA 3700-1), Xap (CFBP3894 dan CFBP5563) dan Xf (IVIA XF349-
99 dan CECT549). Namun, perbedaan dalam sensitivitas antara Psa, Xap dan Xf terhadap
LAB diamati (lihat foto Gambar Figur1). 1 ). Analisis kluster menunjukkan tiga kelompok
utama spektrum antagonisme pada tingkat yang sama yaitu 0,55 (Gambar 1 ). Cluster 1
termasuk 17 strain yang umumnya tidak menunjukkan aktivitas melawan Psa, aktivitas
sedang melawan Xap dan aktivitas sedang atau tinggi melawan Xf. Cluster 2 termasuk 33
strain yang umumnya tidak menunjukkan aktivitas atau sedang terhadap Psa, dan aktivitas
sedang atau tinggi terhadap Xap dan Xf. Yang menarik, Cluster 3 mencakup lima strain —
CC100, CM160, CM209, PM411 dan TC92 — yang menampilkan aktivitas luas dan
umumnya tinggi terhadap semua patogen target.
Gambar 1

Dendrogram dari spektrum antagonisme in vitro dari 55 strain bakteri asam laktat
(BAL). Patogen target terdaftar di bagian atas dan sesuai dengan strain NCPPB3739 dan
IVIA 3700-1 dari Psa, strain CFBP3894 dan CFBP5563 dari Xap dan strain CECT549 dan
IVIA XF349-9 dari XF . Dua percobaan independen dilakukan. Gugus regangan ditunjukkan
oleh sebuah titik. Legenda warna menunjukkan aktivitas penghambatan: Abu-abu pucat,
negatif pada kedua percobaan; abu-abu gelap, positif dalam satu eksperimen; hitam, positif
dalam kedua percobaan. Analisis cluster dilakukan dengan menggunakan UPGMA dan
dengan koefisien keserupaan yang sederhana. Foto-foto A, B, dan C menunjukkan aktivitas
antimikroba yang diperoleh dengan tes agar-agar di LBP, dan foto-foto D, E, F dan G
menunjukkan aktivitas antimikroba yang diperoleh dengan tes disk. IVIA, Instituto
Valenciano de Investigaciones Agrarias; Psa: Pseudomonas
syringae pv. actinidiae ; Xap, Xanthomonas arboricola pv. pruni ; UPGMA, metode
kelompok pasangan tak tertimbang dengan rata-rata aritmatika; XF , Xanthomonas fragariae

3.2. Kontrol Psa, Xap dan Xf pada tanaman dalam kondisi rumah kaca

L. mesenteroides CM160 dan CM209 dan L. plantarum CC100, PM411 dan TC92 dipilih

untuk uji efikasi dalam kondisi rumah kaca berkat antagonisme in vitro mereka yang luas dan
tinggi terhadap Psa, Xap dan Xf. Strain PM411 dan TC92 secara konsisten mengurangi
insiden penyakit Psa, Xap dan Xf pada tanaman buah Kiwi, Prunus dan stroberi, masing-
masing, dibandingkan dengan kontrol yang tidak diobati dalam kedua percobaan yang
dilakukan (Gambar ( Gambar 2).2 ). Kemanjuran strain L. plantarum dalam buah kiwi
berkisar antara 84,5 hingga 96,3% untuk TC92 dan dari 70,0 hingga 75,4% untuk PM411,
sementara di Prunus berkisar antara 59,1 hingga 69,3% untuk TC92 dan dari 45,5 hingga
65,5% untuk PM411 dan dalam strawberry dari 35,4 hingga 69,2% untuk TC92 dan dari 45,8
hingga 92,3% untuk PM411. PM411 dan TC92 tidak berbeda secara signifikan dari
streptomisin, kecuali PM411 dalam satu percobaan dengan Xf-strawberry
pathosystem. CC100, CM160 dan CM209, bagaimanapun, tidak mengurangi insiden penyakit
bila dibandingkan dengan tanaman yang tidak dirawat dalam beberapa percobaan.
Gambar 2

Efek dari perawatan dengan strain LAB (batang abu-abu) pada infeksi Psa, Xap dan XF pada
tanaman buah Kiwi, Prunus dan stroberi, masing-masing, dalam kondisi rumah kaca. Efek
strain pada insiden penyakit (%) dibandingkan dengan streptomisin (batangan putih) dan
kontrol yang tidak diobati (batangan hitam). Dua percobaan independen dilakukan (panel kiri
dan kanan). Nilai adalah rata-rata dari tiga ulangan dan bar kesalahan mewakili SE dari rata-
rata. Batangan dengan huruf yang sama pada panel yang sama tidak berbeda secara signifikan
( p <0,05) menurut tes LSD. LSD Psa ‐ Exp.1 = 22,4; LSD Psa ‐ Exp.2 = 28.8; LSD Xap ‐ Exp.1 =
23,4; LSD Xap ‐ Exp.2 = 29.0; LSD Xf - Exp.1 = 32.8; LSD Xf - Exp.2 = 16.8. Foto-foto menunjukkan
gejala yang diamati pada tanaman yang tidak dirawat dan dirawat. BAL, bakteri asam
laktat; LSD, perbedaan paling tidak signifikan; Psa, Pseudomonas
syringae pv. actinidiae ; Xap, Xanthomonas arboricola pv. pruni ; XF , Xanthomonas
fragariae

3.3. Kelangsungan hidup L. plantarum PM411 dan TC92 pada daun

L. plantarum PM411 dan TC92 hidup pada buah kiwi dan stroberi (PM411) dan daun
tanaman Prunus (TC92) dalam kondisi rumah kaca dipantau (Gambar ( Gambar
3).3 ). Setelah inokulasi, tingkat populasi menurun sekitar dua unit log antara hari pertama
dan ke-10. Bahkan, penurunan populasi diamati selama 5 hari pertama dan populasi yang
layak tetap stabil setelahnya di sekitar 10 4 CFU per daun.
Gambar 3

Kelangsungan hidup Lactobacillus plantarum PM411 dalam buah kiwi dan stroberi dan

kelangsungan hidup L. plantarum TC92 di tanaman Prunus dalam kondisi lingkungan yang
terkendali. Kelangsungan hidup ditunjukkan sebagai tingkat populasi (Log 10 CFU
leaf −1 ). Nilai adalah rata-rata dari tiga ulangan, dan bar kesalahan mewakili SE dari rata-
rata. Dua percobaan independen dilakukan (panel atas dan bawah). CFU, unit pembentuk
koloni

3.4. Kontrol Psa, Xap dan Xf di pabrik dalam kondisi semi-lapangan dan lapangan

Kemanjuran TC92 dan PM411 dalam mengendalikan Xap dan Xf, masing-masing,
dibandingkan dengan produk referensi dalam percobaan semi-lapangan
(Gambar ( Gambar 4).4 ). Insiden infeksi yang diperoleh pada tanaman Prunus yang diobati
dengan L. plantarum TC92 secara signifikan lebih rendah daripada kontrol yang tidak diobati
dalam kedua percobaan yang dilakukan. Kemanjuran TC92 dalam mengendalikan Xap
pada Prunus (41,5-55%) tidak berbeda secara signifikan dari B. subtilis QST713, kitosan,
ASM dan kasugamycin dalam percobaan atau dari tembaga hanya dalam satu
percobaan. Dalam kedua percobaan, tanaman stroberi yang diobati dengan L.
plantarum PM411 menunjukkan insiden infeksi yang lebih rendah daripada kontrol yang
tidak diobati. Keberhasilan PM411 (63,6-75%) dalam mengendalikan Xf pada stroberi tidak
berbeda secara signifikan dari B. subtilis QST713, ASM, tembaga dan kasugamycin dalam
percobaan atau dari kitosan hanya dalam satu percobaan.
Gambar 4

Pengaruh pengobatan dengan Lactobacillus plantarum TC92 dan PM411 (batang abu-abu)

pada infeksi Xap pada tanaman Prunus dalam pot dan pada infeksi Xf pada tanaman stroberi
pot, masing-masing, dalam percobaan semi-lapangan. Efek strain pada kejadian penyakit (%)
dibandingkan dengan produk referensi yang berbeda, seperti B. subtilis QST713, kitosan,
ASM, tembaga, dan kasugamycin (batangan putih) dan kontrol yang tidak diobati (batangan
hitam). Dua percobaan independen dilakukan. Nilai adalah rata-rata dari tiga ulangan dan bar
kesalahan mewakili SE dari rata-rata. Batangan dengan huruf yang sama pada panel yang
sama tidak berbeda secara signifikan ( p <0,05) menurut tes LSD. LSD Xap ‐ Exp.1 =
12.7; LSD Xap ‐ Exp.2 = 13.0; LSD Xf - Exp.1 = 12.8; LSD Xf - Exp.2 = 10.6. LSD, perbedaan paling
tidak signifikan; Xap, Xanthomonas arboricola pv. pruni ; Xf , Xanthomonas fragariae

Kemanjuran PM411 dalam mengendalikan Psa dibandingkan dengan produk referensi dalam
percobaan semi-lapangan (Gambar ( Gambar 5).5 ). PM411 mampu mengurangi separuh
insiden penyakit pada tanaman buah Kiwi dibandingkan dengan kontrol yang tidak diobati
dengan perbedaan yang signifikan. Keberhasilan PM411 dalam mengendalikan Psa pada
buah kiwi (54,2%) mirip dengan B. amyloliquefaciens D747 dan tembaga tanpa perbedaan
yang signifikan di antara mereka.

Gambar 5

Pengaruh pengobatan dengan Lactobacillus plantarum PM411 (batang abu-abu) pada infeksi

Psa pada tanaman buah Kiwi dalam percobaan semi-lapangan dan lapangan. Efek PM411
pada kejadian penyakit (%) dibandingkan dengan produk referensi seperti B.
amyloliquefaciens D747 dan tembaga (batang putih), dan kontrol yang tidak diobati (batang
hitam). Nilai adalah rata-rata dari tiga ulangan dan bar kesalahan mewakili SE dari rata-
rata. Batangan dengan huruf yang sama pada panel yang sama tidak berbeda secara signifikan
( p <0,05) menurut tes LSD. LSD Semi-field = 13.5; LSD Field = 11.7. Ba, B.
amyloliquefaciens ; LSD, perbedaan paling tidak signifikan; Psa, Pseudomonas
syringae pv. actinidiae

Dalam percobaan lapangan yang dilakukan di kebun buah kiwi komersial, kejadian Psa alami
pada tanaman yang tidak dirawat adalah 45,3%. PM411 adalah pengobatan yang paling
efektif dalam menurunkan kejadian penyakit, mencapai kemanjuran 50,3% dan tidak ada
perbedaan signifikan yang diamati dibandingkan dengan B. amyloliquefaciens D747 sebagai
produk referensi, yang menunjukkan kemanjuran 22,7% (Gambar ( Gambar 5).5 ). Tembaga
tidak secara signifikan mengurangi insiden penyakit dibandingkan dengan kontrol yang tidak
diobati, menunjukkan kemanjuran 37,1%.

3.5. Penindasan populasi Psa oleh PM411

Populasi epifit dan endofit Psa pada daun tanaman kiwi pot yang diobati dengan PM411
dipantau selama 4 hari pasca inokulasi patogen (dpi) dalam kondisi RH tinggi
(Tabel ( Tabel 3).3 ). Populasi Psa pulih dari daun tanaman yang diobati dengan PM411 lebih
rendah dari pada tanaman yang tidak diobati. Khususnya, untuk populasi epifit, pengurangan
(1 unit log) signifikan pada 1 dpi, sedangkan untuk populasi endofit diamati sebagai 4
dpi. Penurunan populasi Psa dari 1,5 menjadi 2 unit log diamati pada tanaman yang diolah
streptomisin.

Tabel 3

Efek pengobatan Lactobacillus plantarum PM411 pada kelangsungan hidup Psa pada

tanaman buah Kiwi
 Tingkat populasi psa a

Epifit (Log 10 CFU leaf −1 ) Endofit (Log 10 CFU g −1 )

Perawatan b 1 hari 4 hari 1 hari 4 hari

PM411 6.1 b 5.5 ab 3.7 SEBUAH 2.8 b

Streptomisin 5.4 c 5.0 b 2.7 B <2 c c

Tanpa 7.2 Sebuah 6.5 Sebua 4.0 SEBUAH 3.6 Sebuah

perawatan h

LSD 0,48 1,02 0,58 0,23

CFU: unit pembentuk koloni; LSD: perbedaan paling tidak signifikan; Psa: Pseudomonas

syringae pv. actinidiae .

Nilai tingkat populasi Psa adalah rata-rata dari tiga ulangan satu dan 4 hari pasca inokulasi
Psa pada tanaman. Nilai dengan huruf yang berbeda di kolom yang sama berbeda secara
signifikan ( p <0,05) menurut tes LSD.

b
 Perawatan dilakukan 1 hari sebelum inokulasi Psa.

c
 Log 10 CFU g −1 nilai di bawah batas deteksi.

3.6. Metabolit dan karakterisasi genotip PM411 dan TC92

Untuk memahami aktivitas antibakteri PM411 dan TC92, CFS dianalisis. Sementara CFS
tanpa penyesuaian pH (pH 3,8) menunjukkan aktivitas antibakteri terhadap tiga patogen
target (Psa, Xap dan Xf), aktivitas penghambatan benar-benar hilang setelah netralisasi pH
CFS dan perawatan enzimatik (tripin, α-chymotrypsin, proteinase K dan katalase) tidak
berdampak pada efek penghambatan (data tidak ditampilkan). Jumlah yang serupa dari
campuran asam D- dan L-laktat yang diperoleh dari kedua strain dikuantifikasi dalam CFS
(75,75 ± 0,63 mM untuk PM411 dan 74,86 ± 1,02 mM untuk TC92), dengan asam D-laktat
menjadi isomer optik yang dominan dalam campuran.

Sehubungan dengan karakterisasi genotip, analisis MST dari strain L. plantarum berbeda

berdasarkan data MLST (Gambar S1 , Informasi Pendukung) ditunjukkan pada
Gambar Gambar6. 6 . Secara khusus, PM411 dan TC92 dianalisis bersama dengan isolat lain
yang 43 berasal dari koleksi budaya INTEA-CIDSAV dan 26 dari penelitian lain. Enam gen
rumah tangga menghasilkan total 21 ST dan sebagian besar strain (66%) mewakili ST16 ( n =
38) dan ST1-15 ( n = 9). 21 ST dikelompokkan menjadi tiga CC. CC1 terdiri dari lima ST
yang menyumbang 42 strain, termasuk ST5 sebagai pendiri utama yang diduga. CC2 terdiri
dari ST1-15 yang diwakili oleh sembilan strain dan ST17, yang termasuk satu strain. CC3
terdiri dari ST20 dan ST21 dengan empat strain. ST yang tersisa dianggap lajang. Secara
khusus, PM411 dan TC92 ditemukan di dua CC yang berbeda: TC92 di CC1 dan PM411 di
CC3. Strain PM411 berbagi ST21 dengan dua strain dari koleksi INTEA - CIDSAV. Strain
TC92 berbagi ST16 dengan 35 strain lain dari koleksi INTEA-CIDSAV dan dengan dua
strain yang dipelajari oleh Tanganurat et al. ( 2009 ). Perbedaan antara TC92 dan PM411
ditemukan di purK1 dan gdh .
Gambar 6

Pohon rentang minimum 71 isolat Lactobacillus plantarum berdasarkan profil alel

gen pgm , ddl , gyrB , purK1 , gdh dan mutS (A). Setiap lingkaran berhubungan dengan ST,
dan ukuran lingkaran sebanding dengan jumlah isolat dalam setiap ST yang diberikan. Kode
warna isolat: Hijau, koleksi INTEA - CIDSAV; merah, de las Rivas et al. ( 2006 ); dan biru,
Tanganurat et al. ( 2009 ). Jenis garis antara isolat menunjukkan kekuatan hubungan genetik
di antara mereka (hitam, hubungan kuat; abu-abu, hubungan menengah; dan garis putus-
putus, hubungan lemah). Jumlah mutasi antara ST juga ditunjukkan untuk setiap
hubungan. ST yang termasuk dalam CC yang sama ditampilkan sebagai lingkaran yang
dikelompokkan dalam area abu-abu. Panah hitam menunjukkan bahwa strain PM411 dengan
ST21 milik CC3, dan strain TC92 dengan ST16 milik CC1. Dendrogram pola RAPD-PCR
dari 45 L. plantarum strain (koleksi INTEA-CIDSAV) menggunakan primer P3, P4, P7,
512Fb dan Inva1 (B). Titik menunjukkan tiga kelompok utama serta lajang. Analisis cluster
dilakukan dengan menggunakan (UPGMA), dan dengan koefisien kemiripan Dice. Panah
hitam menunjukkan jenis TC92 dan PM411. CC, kompleks klon; INTEA - CIDSAV, Institut
Teknologi Pangan dan Pertanian dan Pusat Inovasi dan Pengembangan Kesehatan
Tumbuhan; RAPD - PCR, DNA polimorfik yang diperkuat secara acak - PCR; ST, jenis
urutan; UPGMA: metode kelompok pasangan tak tertimbang dengan rata-rata aritmatika

PM411 dan TC92, bersama dengan 43 strain L. plantarum , menjadi sasaran analisis RAPD-
PCR (Gambar ( Gambar 6).6 ). Menurut profil band, strain dibagi menjadi tiga kelompok
dengan koefisien kesamaan lebih besar dari 0,6. TC92 berbagi cluster A dengan 22 strain dan
PM411 berbagi cluster B dengan dua strain lainnya.

4. DISKUSI

Meningkatnya minat dalam pengelolaan penyakit tanaman berkelanjutan yang disebabkan

oleh Psa, Xap dan Xf telah merangsang pencarian novel BCA. Sementara beberapa bakteri,
seperti Pseudomonas dan Xanthomonas , telah dipilih untuk penelitian berkat aktivitas
biokontrol mereka terhadap patogen ini, studi tersebut hanya berfokus pada satu patogen
tunggal (Biondi, Dallai, Brunelli, Bazzi, & Stefani, 2009 ; Henry, Gebben, Tech, Yip, &
Leveau, 2016 ; Kawaguchi, Inoue, & Inoue, 2014 ; Wicaksono, Jones, Casonato, Monk, &
Ridgway, 2018 ). Dalam karya ini, pendekatan multi-penyakit diambil untuk memilih bakteri
antagonis dengan aktivitas spektrum luas. Strategi ini sebelumnya telah digunakan untuk
menyaring BCA di pathosystems lain (Haidar et al., 2016 ). Seperti beberapa strain LAB
telah menunjukkan aktivitas antagonis terhadap bakteri dan jamur patogen tanaman (Fhoula
et al., 2013 ; Trias, Bañeras, Montesinos, & Badosa, 2008 ; Visser et al., 1986 ; Wang et
al., 2011 ) dan kemanjuran biokontrol pada tanaman (Roselló et al., 2013 ; Roselló et
al., 2017 ; Shrestha, Kim, & Park, 2014 ; Tsuda et al., 2016 ), LAB terkait tanaman telah
dianggap sebagai kandidat untuk mengembangkan BCA.

Lima dari 55 strain LAB (CC100, CM160, CM209, PM411 dan TC92) dipilih karena mereka
menunjukkan spektrum antagonisme in vitro yang luas terhadap Psa, Xap dan Xf. Laporan
lain juga menunjukkan aktivitas antagonis yang tinggi dari strain LAB tertentu terhadap
bakteri fitopatogenik seperti Xanthomonas campestris , Pectobacterium carotovorum , P.
syringae , Pseudomonas savastanoi dan Ralstonia solanacearum (Fhoula et al., 2013 ;
Shrestha et al., 2014 ; Trias, 2014 ; Bañeras, Montesinos, & Badosa, 2008 ). uji in vitro
umumnya digunakan untuk seleksi awal galur antagonis dari sejumlah besar kandidat,
menguji berbagai fitofat patogen target (Kavroulakis et al., 2010 ; Mora, Cabrefiga, &
Montesinos, 2015 ). Strategi ini terutama difokuskan pada pemilihan antagonis, seperti LAB
(Ben Omar et al., 2008 ), yang modenya adalah sekresi senyawa antimikroba (Köhl et
al., 2011 ). Oleh karena itu, metode ini memungkinkan calon kandidat BCA untuk dipilih
sebelumnya.

Dalam uji planta berdasarkan pendekatan multi-pathosystem, sangat tepat untuk menyoroti

strain dengan kemampuan biokontrol potensial dan aktivitas spektrum luas dari yang
sebelumnya dipilih dalam uji in vitro. Aktivitas biokontrol PM411 dan TC92 terhadap Psa,
Xap dan Xf dikonfirmasi pada tanaman dalam kondisi rumah kaca, karena infeksi patogen
berkurang dengan cara yang sama seperti streptomisin. Dalam studi sebelumnya, kedua strain
juga dipilih dalam prosedur penyaringan karena mereka menunjukkan efek supresi
terhadap Erwinia amylovora dalam uji tanaman (Roselló et al., 2013 ).

Keampuhan biokontrol PM411 dan TC92 terhadap Psa, Xap dan Xf pada tanaman inang yang
sesuai juga diamati dalam eksperimen semi-lapangan dan lapangan, yang menegaskan bahwa
mereka dapat berguna dalam berbagai kondisi. Karena pembatasan karantina regulasi Uni
Eropa untuk patogen, penilaian strategi manajemen penyakit di kebun yang terkena patogen
ini praktis tidak dapat dilaksanakan di zona yang dilindungi seperti Spanyol. Oleh karena itu,
percobaan semi-lapangan telah dilakukan dalam penelitian ini karena mereka sebelumnya
telah dilaporkan sebanding dengan eksperimen lapangan untuk pengujian biokontrol
(Cabrefiga, Francés, Montesinos, & Bonaterra, 2011 ).
Keampuhan biokontrol dari strain LAB yang dipilih sebanding dengan B.
amyloliquefaciens D747, B. subtilis QST713, kitosan, ASM, tembaga dan
kasugamycin. Karena pembatasan penggunaan produk komersial, strain LAB bisa menjadi
alat alternatif yang menjanjikan untuk dimasukkan dalam strategi manajemen
penyakit. Secara khusus, pilihan phytotoxicity dan resistensi patogen, dalam hal senyawa
tembaga dan antibiotik yang digunakan untuk kontrol Psa, Xap dan Xf, telah dilaporkan
(Colombi et al., 2017 ; Lalancette & McFarland, 2007 ; Roberts, Jones, Chandler, &
Stall , 1997 ). Namun, dengan beberapa tanaman, pemilih pertahanan seperti ASM (Reglinski
et al., 2013 ) dan biopestisida mikroba komersial berdasarkan Bacillus spp. terhadap Psa
(Monchiero, Gullino, Pugliese, Spadaro, & Garibaldi, 2015 ), kurangnya konsistensi dalam
kemanjuran telah ditunjukkan dalam beberapa kondisi terbatas.

Karena potensi mereka sebagai agen kontrol biologis, PM411 dan TC92 dicirikan dalam hal
mekanisme yang terlibat dalam aktivitas antimikroba melawan patogen serta secara genetis
ditentukan untuk perkembangan mereka sebagai BCA. CFS yang diperoleh dari kultur kedua
galur juga menunjukkan efek penghambatan, menunjukkan adanya senyawa
antimikroba. Faktanya, produksi asam laktat dikonfirmasi dalam kultur sel PM411 dan
TC92. Sementara itu, sintesis plantaricin oleh kedua strain diharapkan sebagai hasil dari
kehadiran gen biosintetik ( plnEF , plnJK ) dengan tingkat ekspresi yang sama (Daranas,
Badosa, Francés, Montesinos, & Bonaterra, 2018 ; Roselló et al., 2013) ). Karena netralisasi
pH CFS menghilangkan efek antibakteri, pH asam atau keberadaan asam organik dapat
menjelaskan aktivitas antimikroba utama. Studi lain telah melaporkan asam organik sebagai
salah satu mekanisme utama yang melaluinya aktivitas antimikroba LAB diberikan terhadap
spektrum luas bakteri target (Arena et al., 2016 ). Meskipun dalam pekerjaan ini plantaricin
belum terbukti berkontribusi terhadap inhibisi Psa, Xap dan Xf, peran mereka tidak boleh
diabaikan karena pengasaman atau gangguan membran sel yang dimediasi asam mungkin
diperlukan untuk memberikan efek antagonis (Alakomi et al., 2000 ) . Meskipun peran
hidrogen peroksida dalam aktivitas antimikroba tidak dikonfirmasi dalam CFS, produksinya
diharapkan disukai pada permukaan tanaman di mana terdapat kondisi aerobik, dan untuk
berkontribusi pada penekanan patogen seperti yang telah dilaporkan sebelumnya (Pridmore,
Pittet, Praplan, & Cavadini, 2008 ). Dihipotesiskan bahwa ketika L. plantarum menjajah
permukaan tanaman, pH akan menjadi asam karena produksi asam laktat atau asam organik
lainnya yang dihasilkan dari fermentasi. Selain itu, dalam kondisi aerobik, pembentukan
hidrogen peroksida juga dapat berkontribusi terhadap antagonisme. Oleh karena itu, untuk
sepenuhnya memahami mode multifaktorial dari tindakan PM411 dan TC92 yang
bertanggung jawab untuk pencegahan penyakit pada tanaman, diperlukan studi lebih lanjut.

Selain produksi metabolit antimikroba, kolonisasi pre-emptive dari jaringan tanaman yang
rentan terhadap infeksi patogen adalah mekanisme penting yang mendasari efektivitas BCA
(Giddens, Houliston, & Mahanty, 2003 ). Ketika Psa, Xap dan Xf memasuki tanaman inang
melalui lubang alami, seperti stomata daun atau luka, keberadaan sel-sel PM411 dan TC92
pada permukaan daun sebelum kedatangan patogen mungkin menghindari infeksi. Secara
khusus, penyemprotan PM411 secara preventif pada tanaman menghambat populasi Psa
endofit dan epifit, yang menunjukkan efek langsung pada patogen dan sesuai dengan
pengurangan insiden penyakit dalam percobaan tanaman. Efek penghambatan yang dimiliki
PM411 dan TC92 ini, juga diamati untuk E. amylovora pada permukaan tanaman pir (Roselló
et al., 2017 ). Kelangsungan hidup PM411 dan TC92 pada buah kiwi, Prunus dan daun
stroberi dikonfirmasi dalam percobaan rumah kaca. Tingkat populasi yang serupa dicapai
pada tiga tanaman inang yang berbeda dan sesuai dengan kelangsungan hidup mereka yang
sebelumnya dilaporkan untuk tanaman pir (Roselló et al., 2017 ). Meskipun setelah
penyemprotan penurunan populasi diamati sebagai hasil dari kondisi yang keras pada
permukaan tanaman udara, tingkat konstan 10 3 hingga 10 4 daun CFU −1 strain LAB dicapai
dalam 10 hari berikutnya. Penurunan populasi daun juga dilaporkan untuk L. plantarum BCA
lainnya yang, yang menarik, mencapai tingkat populasi yang lebih tinggi di lokasi daun yang
terluka (Tsuda et al., 2016 ). Perubahan ketersediaan air dan suhu, batasan nutrisi atau radiasi
ultraviolet pada daun dapat secara sementara tidak memadai untuk pertumbuhan BCA
(Lindow & Brandl, 2003 ).

Meskipun kinerja PM411 dan TC92 dalam menekan patogen serupa dan kedua strain
diidentifikasi sebagai L. plantarum , mereka jelas dibedakan oleh analisis RAPD-PCR dan
milik CC yang berbeda menurut MLST. Menariknya, galur-galur ini dianalisis bersama
dengan galur L. plantarum terkait tanaman lainnya dan RAPD-PCR dan analisis MLST
menampilkan kelompok yang serupa.

L. plantarum PM411 dan TC92 efektif sebagai perawatan pencegahan untuk mengendalikan

bakteri patogen yang mewakili berbagai genera ( Pseudomonas, Xanthomonas ) dan
mempengaruhi inang yang berbeda (buah Kiwi, Prunus , stroberi). Antagonisme spektrum
luas terhadap patogen bakteri yang mereka tunjukkan terutama didasarkan pada metabolit
antimikroba. Selain itu, mereka menghambat populasi patogen pada permukaan tanaman
dengan menekan infeksi. Namun, pengurangan populasi oleh PM411 dan TC92 dalam
kondisi nonkonduktif dapat membahayakan perlindungan tanaman. Untuk mencapai populasi
BCA yang diperlukan untuk biokontrol, aplikasi semprot berulang mungkin diperlukan. Oleh
karena itu, pemantauan sel yang layak dapat membantu desain jadwal pengiriman aplikasi
yang sesuai (Daranas et al., 2018 ). Demikian juga, peningkatan kebugaran ekologis BCA
dapat diimplementasikan (Daranas, Badosa, et al., 2018 ). Studi lebih lanjut di bawah kondisi
pertanian dan iklim yang berbeda diperlukan untuk mengkonfirmasi kinerja PM411 dan
TC92 di lapangan.

Informasi pendukung
Gambar S1 Dendrogram sesuai dengan pengetikan urutan multilokus (MLST) mengetik 71
strain Lactobacillus plantarum , termasuk 45 strain dari penelitian ini (Roselló et al., 2013 ;
Trias, Bañeras, Badosa, & Montesinos, 2008 ; Trias, Bañeras, Montesinos, & Badosa, 2008 )
dan 26 strain dari penelitian lain. Analisis meliputi profil alel
gen pgm , ddl , gyrB , purK1 , gdh dan mutS . Kode warna strain: hijau, penelitian ini; merah,
de las Rivas, Marcobal, dan Muñoz ( 2006 ); dan biru, Tanganurat, Quinquis,
Leelawatcharamas, dan Bolotin ( 2009 ). Analisis Cluster dilakukan oleh perangkat lunak
MEGA versi 5.1 ( http://www.megasoftware.net ) menggunakan metode pair group
tertimbang dengan rata-rata aritmatika (UPGMA) dan model dua-parameter Kimura (metode
1.000 Bootstrap). Interval kepercayaan bootstrap, asal isolat, tipe urutan (ST) dan profil alel
(dalam kurung) diindikasikan.

UCAPAN TERIMA KASIH

Pendanaan diberikan oleh AGL2015-69876 ‐ C2‐1 ‐ R (Spanyol Ministerio de Economía y

Competitividad dan FEDER dari Uni Eropa), oleh FP7 KB KBBE.2013.1.2–04 613678
DROPSA dari Uni Eropa, dan oleh hibah MPCUdG2016 (Universitas Girona). N. Daranas
adalah penerima hibah penelitian 2015 FI_B00515 (Secretaria d'Universitats i Recerca,
Departemen d'Economia i Coneixement, Generalitat de Catalunya; ES, EU). Grup penelitian
diakreditasi oleh SGR 2014-697 dan TECNIO net dari Department d'Economia i
Coneixement ‐ ACCIÓ Catalonia.
Catatan

Daranas N, Roselló G, Cabrefiga J, et al. Kontrol biologis penyakit tanaman bakteri dengan

strain Lactobacillus plantarum dipilih untuk aktivitas spektrum luas mereka . Ann Appl
Biol . 2019; 174 : 92–105. 10.1111 / aab.12476 [ CrossRef ] [ Google Cendekia ]

Informasi pendanaan Universitat de Girona, Grant / Award Number:

MPCUdG2016; Departemen d'Economia i Coneixement ‐ ACCIÓ Catalonia, Grant / Award
Number: SGR 2014-697; Secretaria d'Universitats i Recerca, Departament d'Economia i
Coneixement, Generalitat de Catalunya, Nomor Hibah / Penghargaan: 2015 FI_B00515; FP7
Uni Eropa Pangan, Pertanian dan Perikanan, Bioteknologi, Nomor Hibah / Penghargaan: FP7
‐ KBBE.2013.1.2–04 613678; Spanyol Ministerio de Economía y Competitividad dan Dana
Eropa untuk Pembangunan Ekonomi dan Regional (FEDER) dari Uni Eropa, Hibah /
Penghargaan Nomor: AGL2015-69876 ‐ C2-1 ‐ R

REFERENSI

 Alakomi H.‐L., Skyttä E., Saarela M., Mattila Sand Sandholm T., Latva K Kala
K., & Helander IM (2000). Asam laktat menyerap bakteri Gram-negatif dengan
mengganggu membran luar . Mikrobiologi Terapan dan Lingkungan , 66 , 2001–
2005. [ Artikel gratis PMC ] [ PubMed ] [ Google Cendekia ]
 Arena MP, Silvain A., Normanno G., Grieco F., Drider D., Spano G., & Fiocco D.
(2016). Penggunaan strain Lactobacillus plantarum sebagai strategi kontrol bio
terhadap mikroorganisme patogen yang ditularkan melalui makanan . Frontiers in
Microbiology , 7 , 464. [ Artikel gratis PMC ] [ PubMed ] [ Google Cendekia ]
 Ben Omar N., Abriouel H., Keleke S., Sánchez Valenzuela A., Martínez Ca
Cañamero M., Lucas López R.,… Gálvez A. (2008). Strain Lactobacillus
yang memproduksi bakteri yang diisolasi dari poto poto, produk jagung
fermentasi Kongo, dan sidik jari genetik operon plantaricin mereka . Jurnal
Internasional Mikrobiologi Makanan , 127 , 18–25. [ PubMed ] [ Google
Cendekia ]
 Biondi E., Dallai D., Brunelli A., Bazzi C., & Stefani E. (2009). Penggunaan
antagonis bakteri untuk kontrol biologis daun bakteri / tempat buah buah-buahan
batu . Buletin IOBC / WPRS , 43 , 277–281. [ Google Cendekia ]
 Braun PG, & Hildebrand PD (2013). Pengaruh gula alkohol, antioksidan dan
aktivator dari resistensi yang diperoleh secara sistemik terhadap keparahan bintik
daun bakteri ( Xanthomonas fragariae) stroberi dalam kondisi lingkungan yang
terkendali . Jurnal Patologi Tumbuhan Kanada , 35 , 20-26. [ Google Cendekia ]
 Cabrefiga J., Francés J., Montesinos E., & Bonaterra A. (2011). Peningkatan
kebugaran dan kemanjuran agen biokontrol hawar api melalui peningkatan nutrisi
dikombinasikan dengan osmoadaptation . Mikrobiologi Terapan dan
Lingkungan , 77 , 3174-3181. [ Artikel gratis PMC ] [ PubMed ] [ Google
Cendekia ]
 Cameron A., & Sarojini V. (2014). Pseudomonas syringae pv. actinidiae :
Kontrol kimia, mekanisme resistensi dan kemungkinan alternatif . Patologi
Tumbuhan , 63 , 1–11. [ Google Cendekia ]
 Cellini A., Buriani G., Rocchi L., Eondelli E., Savioli S., Rodriguez Estrada MT,
… Spinelli F. (2018). Relevansi biologis dari senyawa organik yang mudah
menguap yang dipancarkan selama interaksi patogen antara tanaman apel
dan Erwinia amylovora . Patologi Tumbuhan Molekuler , 19 , 158–168. [ Artikel
gratis PMC ] [ PubMed ] [ Google Cendekia ]
 Cellini A., Fiorentini L., Buriani G., Yu J., Donati I., Cornish DA, ... Spinelli F.
(2014). Elicitor dari jalur asam salisilat mengurangi kejadian kanker bakteri buah
Kiwi yang disebabkan oleh Pseudomonas syringae pv. actinidae . Annals of
Applied Biology , 165 , 441–453. [ Google Cendekia ]
 Chagnaud P., Machinis K., Coutte LA, Marecat A., & Mercenier A.
(2001). Prosedur cepat berbasis PCR untuk mengidentifikasi bakteri asam laktat:
Aplikasi untuk enam spesies Lactobacillus yang umum . Jurnal Metode
Mikrobiologis , 44 , 139–148. [ PubMed ] [ Google Cendekia ]
 Colombi E., Straub C., Künzel S., Templeton MD, McCann HC, & Rainey PB
(2017). Evolusi resistensi tembaga dalam patogen buah Kiwi Pseudomonas
syringae pv. actinidiae melalui akuisisi elemen konjugatif integratif dan
plasmid . Mikrobiologi Lingkungan , 19 , 819–832. [ PubMed ] [ Google
Cendekia ]
 Crowley S., Mahony J., & Van Sinderen D. (2013). Bakteri asam laktat penghasil
spektrum luas dan aplikasinya dalam model buah . Folia Microbiologica , 58 ,
291–299. [ PubMed ] [ Google Cendekia ]
 Daranas N., Badosa E., Francés J., Montesinos E., & Bonaterra A.
(2018). Meningkatkan toleransi terhadap stres air meningkatkan kebugaran pada
strain kontrol biologis Lactobacillus plantarum di lingkungan tanaman . PLoS
One , 13 , e0190931. [ Artikel gratis PMC ] [ PubMed ] [ Google Cendekia ]
 Daranas N., Bonaterra A., Francés J., Cabrefiga J., Montesinos E., & Badosa E.
(2018). Pemantauan sel-sel yang layak dari agen kontrol biologis Lactobacillus
plantarum PM411 di permukaan tanaman udara dengan menggunakan metode
PCR kuantitatif viabilitas spesifik-regangan . Mikrobiologi Terapan dan
Lingkungan , 84 , e00107 – e00118. [ Artikel gratis PMC ] [ PubMed ] [ Google
Cendekia ]
 de las Rivas B., Marcobal A., & Muñoz R. (2006). Pengembangan metode
mengetik urutan multilokus untuk analisis strain Lactobacillus
plantarum . Mikrobiologi , 152 , 85-93. [ PubMed ] [ Google Cendekia ]
 Di Cagno R., Minervini G., Sgarbi E., Lazzi C., Bernini V., Neviani E., &
Gobbetti M. (2010). Perbandingan fenotipik (sistem biologi) dan genotipik (reaksi
berantai DNA-polimerase polimorfik acak, RAPD-PCR, dan metode
polimorfisme panjang fragmen yang diperkuat, AFLP) untuk mengetik
isolat Lactobacillus plantarum dari sayuran mentah dan buah-
buahan . International Journal of Food Microbiology , 143 , 246–
253. [ PubMed ] [ Google Cendekia ]
 Donati I., Buriani G., Cellini A., Mauri S., Costa G., & Spinelli F.
(2014). Wawasan baru pada kanker bakteri buah kiwi ( Pseudomonas
syringae pv. Actinidiae ) . Jurnal Berry Research , 4 , 53-67. [ Google Cendekia ]
 Fhoula I., Najjari A., Turki Y., Jaballah S., Boudabous A., & Ouzari H.
(2013). Keanekaragaman dan sifat antimikroba dari bakteri asam laktat yang
diisolasi dari rizosfer pohon zaitun dan truffle gurun di Tunisia . BioMed
Research International , 2013 , 1–14. [ Artikel gratis PMC ] [ PubMed ] [ Google
Cendekia ]
 Gallelli A., Talocci S., L'Aurora A., & Loreti S. (2011). Deteksi Pseudomonas
syringae pv. actinidiae , agen penyebab kanker bakteri buah kiwi, dari buah dan
ranting yang tidak bergejala, dan dari serbuk sari . Phytopathologia
Mediterranea , 50 , 462-472. [ Google Cendekia ]
 Giddens SR, Houliston GJ, & Mahanty HK (2003). Pengaruh produksi antibiotik
dan kolonisasi pre-emptive pada dinamika populasi aglomerans
Pantoea ( Erwinia herbicola ) Eh1087 dan Erwinia amylovora di
planta . Mikrobiologi Lingkungan , 5 , 1016-1021. [ PubMed ] [ Google
Cendekia ]
 Haidar R., Deschamps A., Roudet J., Calvo-Garrido C., Bruez E., Rey P., &
Fermaud M. (2016). Penyaringan multi-organ agen kontrol bakteri yang efisien
terhadap dua patogen utama selentingan . Kontrol Biologis , 92 , 55-65. [ Google
Cendekia ]
 Hazel W., & Civerolo E. (1980). Prosedur untuk pertumbuhan dan
inokulasi Xanthomonas fragariae , organisme penyebab bintik daun
stroberi . Penyakit Tumbuhan , 64 , 178–181. [ Google Cendekia ]
 Henry PM, Gebben SJ, Tech JJ, Yip JL, & Leveau JHJ
(2016). Penghambatan Xanthomonas fragariae , agen penyebab bintik sudut
stroberi, melalui kekurangan zat besi . Frontiers in Microbiology , 7 ,
1589. [ Artikel gratis PMC ] [ PubMed ] [ Google Cendekia ]
 Holt SM, & Cote GL (1998). Diferensiasi strain Leuconostoc yang memproduksi
dextran dengan protokol DNA polimorfik yang dimodifikasi secara
acak . Mikrobiologi Terapan dan Lingkungan , 64 , 3096–3098. [ Artikel gratis
PMC ] [ PubMed ] [ Google Cendekia ]
 Kavroulakis N., Ntougias S., Besi MI, Katsou P., Damaskinou A., Ehaliotis C., ...
Papadopoulou KK (2010). Bakteri antagonis residu agro-industri kompos
menunjukkan antibiotik terhadap patogen tanaman jamur yang ditularkan melalui
tanah dan perlindungan tanaman tomat dari Fusarium oxysporum f.sp. radicis-
lycopersici . Plant and Soil , 333 , 233–247. [ Google Cendekia ]
 Kawaguchi A., Inoue K., & Inoue Y. (2014). Kontrol biologis tempat bakteri pada
persik oleh strain Xanthomonas campestris nonpathogenic AZ98101 dan
AZ98106 . Jurnal Patologi Tumbuhan Umum , 80 , 158–163. [ Google Cendekia ]
 Kim D.‐R., Gang G.‐H., Jeon C.‐W., Kang NJ, Lee S.‐W., & Kwak Y.‐
S. (2016). Epidemiologi dan pengendalian penyakit bintik-bintik sudut daun
bakteri stroberi yang disebabkan oleh Xanthomonas fragariae . Jurnal Patologi
Tumbuhan , 32 , 290–299. [ Artikel gratis PMC ] [ PubMed ] [ Google Cendekia ]
 Köhl J., Postma J., Nicot P., Ruocco M., & Blum B. (2011). Penapisan bertahap
mikroorganisme untuk penggunaan komersial dalam kontrol biologis jamur dan
bakteri patogen tanaman . Kontrol Biologis , 57 , 1-12. [ Google Cendekia ]
 Lalancette N., & McFarland KA (2007). Fitotoksisitas bakterisida berbasis
tembaga menjadi peach dan nectarine . Plant Disease , 91 , 1122-1130. [ Google
Cendekia ]
 Lamichhane JR (2014). Penyakit Xanthomonas arboricola dari buah batu,
almond, dan pohon kenari: Kemajuan menuju pemahaman dan manajemen . Plant
Disease , 98 , 1600-1610. [ Google Cendekia ]
 Lamichhane JR, Arendse W., Dachbrodt - Saaydeh S., Kudsk P., JC Romawi, van
Bijsterveldt - Gel JE, ... Messéan A. (2015). Tantangan dan peluang untuk
pengelolaan hama terpadu di Eropa: Contoh penggunaan kecil yang
jelas . Perlindungan Tanaman , 74 , 42-47. [ Google Cendekia ]
 Lindow SE, & Brandl MT (2003). Mikrobiologi phyllosphere . Mikrobiologi
Terapan dan Lingkungan , 69 , 1875–1883. [ Artikel gratis
PMC ] [ PubMed ] [ Google Cendekia ]
 Llop P., Caruso P., Cubero J., Morente C., & López MM (1999). Prosedur
ekstraksi sederhana untuk deteksi rutin efisien bakteri patogen dalam bahan
tanaman melalui reaksi berantai polimerase . Jurnal Metode Mikrobiologis , 37 ,
23-31. [ PubMed ] [ Google Cendekia ]
 López I., Torres C., & Ruiz ‐ Larrea F. (2008). Tipifikasi genetik oleh pulsed-
field gel electrophoresis (PFGE) dan DNA polimorfik yang diamplifikasi secara
acak (RAPD) dari Lactobacillus plantarum liar dan galur anggur Oenococcus
oeni . Penelitian dan Teknologi Pangan Eropa , 227 , 547–555. [ Google
Cendekia ]
 Matyjaszczyk E. (2015). Produk yang mengandung mikroorganisme sebagai alat
dalam pengelolaan hama terpadu dan aturan penempatan pasar mereka di Uni
Eropa . Ilmu Manajemen Hama , 71 , 1201-1206. [ PubMed ] [ Google Cendekia ]
 McManus PS, Stockwell VO, Sundin GW, & Jones AL (2002). Penggunaan
antibiotik dalam pertanian tanaman . Tinjauan Tahunan Fitopatologi , 40 , 443–
465. [ PubMed ] [ Google Cendekia ]
 Monchiero M., Gullino ML, Pugliese M., Spadaro D., & Garibaldi A.
(2015). Khasiat berbagai produk kimia dan biologis dalam
 pengendalian Pseudomonas syringae pv. actinidiae pada buah kiwi . Australasia
Plant Pathology , 44 , 13-23. [ Google Cendekia ]
 Montesinos E., & Bonaterra A. (2017). Pestisida, modul Referensi mikroba dalam
ilmu kehidupan . Amsterdam, Belanda: Elsevier; 10.1016 / B978-0-12-809633-
8.13087-0 [ CrossRef ] [ Google Cendekia ]
 Mora I., Cabrefiga J., & Montesinos E. (2015). Gen dan produk biosintesis
lipopeptida siklik, dan aktivitas penghambatan Bacillus terkait tanaman terhadap
bakteri fitopatogenik . PLoS One , 10 , e0127738. [ Artikel gratis
PMC ] [ PubMed ] [ Google Cendekia ]
 Pridmore RD, Pittet A.‐C., Praplan F., & Cavadini C. (2008). Produksi hidrogen
peroksida oleh Lactobacillus johnsonii NCC 533 dan perannya dalam aktivitas
anti- Salmonella . FEMS Microbiology Letters , 283 , 210–
215. [ PubMed ] [ Google Cendekia ]
 Rahn K., De Grandis SA, Clarke RC, McEwen SA, Galán JE, Ginocchio C.,…
Gyles CL (1992). Amplifikasi urutan gen invA Salmonella typhimurium oleh
reaksi berantai polimerase sebagai metode spesifik deteksi Salmonella . Probe
Molekul dan Seluler , 6 , 271-279. [ PubMed ] [ Google Cendekia ]
 Reglinski T., Vanneste JL, Wurms K., Gould E., Spinelli F., & Rikkerink E.
(2013). Menggunakan pengetahuan mendasar resistensi yang diinduksi untuk
mengembangkan strategi kontrol untuk kanker bakteri buah kiwi yang disebabkan
oleh Pseudomonas syringae pv. actinidiae . Perbatasan dalam Ilmu Tanaman , 4 ,
24. [ Artikel gratis PMC ] [ PubMed ] [ Google Cendekia ]
 Reis JA, Paula AT, Casarotti SN, & Penna ALB (2012). Bakteri asam laktat,
senyawa antimikroba: Karakteristik dan aplikasi . Ulasan Food Engineering , 4 ,
124–140. [ Google Cendekia ]
 Roberts PD, Jones JB, Chandler CK, & Stall RE (1997). Kemajuan penyakit,
kehilangan hasil, dan kontrol Xanthomonas fragariae pada tanaman
stroberi . Penyakit Tumbuhan , 81 , 917–921. [ Google Cendekia ]
 Roselló G., Bonaterra A., Francés J., Montesinos L., Badosa E., & Montesinos E.
(2013). Kontrol biologis hawar apel dan pir api dengan Lactobacillus plantarum
yang antagonis . European Journal of Plant Pathology , 137 , 621–633. [ Google
Cendekia ]
 Roselló G., Francés J., Daranas N., Montesinos E., & Bonaterra A.
(2017). Kontrol hawar api pohon pir dengan inokula campuran dua
strain Lactobacillus plantarum dan asam laktat . Jurnal Patologi
Tumbuhan , 99 (Edisi khusus), 111–120. [ Google Cendekia ]
 Shrestha A., Kim BS, & Park DH (2014). Kontrol biologis penyakit tempat
bakteri dan efek mempromosikan pertumbuhan bakteri asam laktat pada
lada . Ilmu dan Teknologi Biocontrol , 24 , 763-779. [ Google Cendekia ]
 Spinelli F., Donati I., Vanneste JL, Costa M., & Costa G. (2011). Pemantauan
waktu nyata dari interaksi antara Pseudomonas
syringae pv. spesies actinidiae dan Actinidia . Acta Horticulturae , 913 , 461-
465. [ Google Cendekia ]
 Sundin GW, Werner NA, Yoder KS, & Aldwinckle HS (2009). Evaluasi lapangan
pengendalian biologis hawar api di Amerika Serikat bagian timur . Penyakit
Tumbuhan , 93 , 386–394. [ Google Cendekia ]
 Tailliez P., Tremblay J., Ehrlich SD, & Chopin A. (1998). Keragaman dan
hubungan molekul dalam Lactococcus lactis , sebagaimana diungkapkan oleh
DNA polimorfik yang diamplifikasi secara acak (RAPD) . Mikrobiologi
Sistematik dan Terapan , 21 , 530–538. [ PubMed ] [ Google Cendekia ]
 Tanganurat W., Quinquis B., Leelawatcharamas V., & Bolotin A.
(2009). Karakterisasi genotipik dan fenotipik dari strain Lactobacillus
plantarum diisolasi dari buah dan sayuran yang difermentasi Thailand . Jurnal
Mikrobiologi Dasar , 49 , 377-385. [ PubMed ] [ Google Cendekia ]
 Torriani S., Felis GE, & Dellaglio F. (2001). Diferensiasi Lactobacillus
plantarum, L. pentosus, dan L. paraplantarum dengan analisis urutan
gen recA dan uji PCR multipleks dengan primer yang diturunkan dari
gen recA . Mikrobiologi Terapan dan Lingkungan , 67 , 3450–3454. [ Artikel
gratis PMC ] [ PubMed ] [ Google Cendekia ]
 Trias R., Bañeras L., Badosa E., & Montesinos E. (2008). Bioproteksi Apel Emas
Lezat dan Selada Gunung Es terhadap patogen bakteri bawaan makanan oleh
bakteri asam laktat . Jurnal Internasional Mikrobiologi Makanan , 123 , 50–
60. [ PubMed ] [ Google Cendekia ]
 Trias R., Bañeras L., Montesinos E., & Badosa E. (2008). Bakteri asam laktat dari
buah dan sayuran segar sebagai agen biokontrol bakteri dan jamur
 fitopatogenik . Mikrobiologi Internasional , 11 , 231–236. [ PubMed ] [ Google
Cendekia ]
 Tsuda K., Tsuji G., Higashiyama M., Ogiyama H., Umemura K., Mitomi M.,…
Kosaka Y. (2016). Kontrol biologis bakteri busuk lunak pada kubis Cina
oleh Lactobacillus plantarum strain BY dalam kondisi lapangan . Kontrol
Biologis , 100 , 63-69. [ Google Cendekia ]
 Visser R., Holzapfel WH, Bezuidenhout JJ, & Kotze JM (1986). Antagonisme
bakteri asam laktat terhadap bakteri fitopatogenik . Mikrobiologi Terapan dan
Lingkungan , 52 , 552-555. [ Artikel gratis PMC ] [ PubMed ] [ Google
Cendekia ]
 Wang H., Yan H., Shin J., Huang L., Zhang H., & Qi W. (2011). Aktivitas
terhadap jamur patogen tanaman Lactobacillus plantarum IMAU10014 diisolasi
dari Xinjiang koumiss di Cina . Annals of Microbiology , 61 , 879–885. [ Google
Cendekia ]
 Wicaksono WA, Jones EE, Casonato S., Monk J., & Ridgway HJ (2018). Kontrol
biologis Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa), agen penyebab kanker
bakteri buah kiwi, menggunakan bakteri endofit yang diambil dari tanaman
obat . Kontrol Biologis , 116 , 103–112. [ Google Cendekia ]
 Yáñez - López R., Torres - Pacheco I., Guevara - González RG, Hernández - Zul
MI, Quijano - Carranza JA, & Rico - García E. (2012). Efek perubahan iklim pada
penyakit tanaman . Jurnal Afrika Bioteknologi , 11 , 2417–2428. [ Google
Cendekia ]
 Zwielehner J., Handschur M., Michaelsen A., Irez S., Demel M., Denner EBM, &
Haslberger AG (2008). DGGE dan analisis PCR real-time dari bakteri asam laktat
di komunitas bakteri di phyllosphere dari selada . Penelitian Nutrisi dan Makanan
Molekuler , 52 , 614-623. [ PubMed ] [ Google Cendekia ]