LAPORAN PRAKTIKUM HALAL

ISOLASI DNA

Disusun oleh

Kelompok 1C

Rana Aulia F. (11171020000054)

Hasna Dzakiyah M. (11171020000059)

Luna Septie (11171020000066)

Wulan Sari (11171020000069)

Dili Ridho A. (11171020000072)

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS ILMU KESEHATAN

UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

APRIL 2020
 BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Makanan halal menjadi isu yang sangat penting bagi Negara dengan penduduk mayoritas
muslim seperti Indonesia. Namun pada era globalisasi dan perdagangan bebas, sangat banyak
produk import yang masuk ke Indonesia. Salah satu produk yang rawan terhadap kehalalannya
adalah produk daging sapi. Produk daging sapi sering dicampur dengan daging babi. Produk
daging sapi yang mengandung daging babi terjadi di Malang, Bogor, Bandung, Surabaya dan
Bali, bahkan terjadi juga di Saudi Arabia . Karena itu diperlukan analisis cemaran daging babi
pada produk daging sapi yang akurat, sensitive dan spesifik.
Pada daging, DNA daging sapi dapat dideteksi menggunakan Polymerase Chain reaction
(PCR) dan Real Time. Amplifikasi DNA menggunakan PCR mempunyai beberapa keuntungan
yaitu: DNA mempunyai sifat stabil, prosedur ekstraksi sederhana dan mudah, dan meskipun
DNA sudah terfragmentasi oleh pemanasan, tetap dapat dilakukan analisis.
Analisis tahap awal hasil isolasi DNA adalah dengan elektroforesis. Elektroforesis adalah
suatu cara untuk memisahkan fraksi suatu campuran berdasarkkan pergerakan artikel koloid
yang bermuatan dibawah pengaruh medan listrik. Cara elektroforesis telah diigunaakan untuk
analisa virus, asam nnukleat, enzim, dan protein lain, serta molekul-molekul organik dengan
berat molekul rendah seperti asam amino. (Westermeier, 2004)
Salah satu gel yang dapat digunakan pada elektroforesis adalah gel agarosa. Agarosa
digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan memurnikan fragmen-fragmen DNA
dengan ukurang molekul lebih besar dari 100 pb dan dijalankan secara horizontal. Molekul
DNA termasuk senyawa bermuatan negatif. Sifat ini menjadikan molekul DNA yang
ditempatkan pada medan listrik akan bermigrasi menuju kutub positif. (Sambrook et al.1989).

Isolat DNA yang dihasilkan dapat juga dianalisis dengan menggunakan spektrofotometri
DNA (DeNovix).Tujuan analisis ini adalah untuk mengukur konsentrasi dan kemurnian DNA
tersebut. Pengukuran isolat DNA dilakukan pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm,
sedangkan tingkat kemurnian DNA dapat ditentukan dengan cara menghitung rasio antara nilai
A260 dan A280 (Muladno, 2010).Molekul DNA dikatakan murni apabila nilai rasio A260/A280
berkisar antara 1.8 – 2.0. Nilai rasio yang lebih rendah dari 1.8 menunjukkan adanya
kontaminasi protein sedangkan nilai rasio melebihi 2.0 menunjukkan adanya kontaminasi RNA
(Teare et al., 1997).

Analisis tahap lanjutan DNA adalah amplifikasi menggunakan Real Time Polymerase
Chain Reaction (RT PCR). Real Time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) merupakan suatu
teknik modifikasi dari Polymerase Chain Reaction (PCR) dalam ilmu biologi molekular
modern yang digunakan untuk mengidentifikasi DNA atau RNA dalam sampel. Secara prinsip,
Real Time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) maupun Polymerase Chain Reaction (PCR)
merupakan suatu proses amplifikasi DNA template yang dilakukan secara berulang sehingga
menghasilkan jumlah copy DNA sampai jutaan kalinya (Ma et al., 2006).

B. Tujuan
Mahasiswa mampu mengisolasi DNA, melakukan analisis deteksi daging babi pada produk
sapi menggunakan metodeReal Time PCR.
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Deoxyribonucleic acid (DNA)

DNA merupakan asam nukleat yang mengandung materi genetik yang berperan untuk
mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler (Yuwono, 2009).
Deoxyribonucleic acid (DNA) merupakan polimer asam nukleat yang tersusun sistematis dan
membawa informasi genetik yang diturunkan ke keturunannya (Yuwono, 2009). Informasi
genetik disusun dalam bentuk kodon yang berupa tiga pasang basa nukelotida. Keseluruhan
DNA dalam suatu sel akan membentuk genom. Genom meliputi bagian gen yang fungsional
maupun non-fungsional dalam sel organisme. DNA genom meliputi gen dan intergen (Suryo,
2004).

Secara struktural, DNA merupakan polimer nukleotida, di mana setiap nukelotida

tersusun atas gula deoksiribosa, fosfat, dan basa. Polimer tersebut membentuk struktur dua
untai heliks ganda yang disatukan oleh ikatan hydrogen antara basa-basa yang ada. Komponen
satu nukleotida terdiri dari tiga bagian, yaitu gula pentosa (deoksiribosa pada DNA), basa
nitrogen, dan gugus fosfat. Basa nitrogen yang menyusun DNA adalah adenin (A), guanin (G)
yang merupakan purin, dan sitosin (C), timin (T) yang merupakan pirimidin (Yuwono, 2009).
Adenin akan membentuk dua ikatan hidrogen dengan timin, sedangkan guanine membentuk
tiga ikatan hidrogen dengan sitosin. Kombinasi jumlah dan susunan yang terbentuk antara
ikatan-ikatan basa ini memungkinkan setiap indvidu memiliki cetak biru genetik yang spesifik
dibandingkan organisme lain. DNA pada makhluk hidup dapat ditemukan pada inti sel
(nukleus), mitokondria, dan klorofil. Pada manusia, DNA ditemukan pada inti sel dan
mitokondria. Ada perbedaan di antara ketiga lokasi DNA ini, yaitu: DNA nukleus berbentuk
linear dan berhubungan sangat erat dengan protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan
kloroplas berbentuk sirkular dan tidak berhubungan dengan protein histon. DNA memiliki
struktur helix utas ganda. DNA ini tersusun atas 3 komponen utama yaitu gula deoksiribosa,
basa nitrogen dan fosfat yang tergabung membentuk nukleotida (Istanti, 1999).
Sebuah sel memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan bersifat herediter pada
seluruh sistem kehidupan. Genom adalah set lengkap materi genetik (DNA) yang dimiliki suatu
organisme dan terorganisasi menjadi kromosom. DNA dapat diisolasi, baik dari sel hewan,
manusia, maupun pada tumbuhan.

2.2 Isolasi Deoxyribonucleic acid (DNA)

DNA dapat mengalami denaturasi dan renaturasi. Selain itu DNA juga bisa diisolasi.
Pada dasarnya isolasi DNA dapat dilakukan dari berbagai sumber, antara lain organ manusia,
darah, daun, daging buah, serangga, kalus, akar batang, daging dan sisik ikan. Zubaidah (2004)
menyatakan bahwa isolasi DNA dapat dilakukan melauli tahapan-tahapan antara lain: preparasi
esktrak sel, pemurnian DNA dari ekstrak sel dan presipitasi DNA. Menurut (Clark,1997) dalam
Yulianti (2006) Isolasi DNA merupakan teknik yang penting dalam pengembangan ilmu ini.
Derajat kemurnian dan kualitas dalam isolasi DNA sangat mempengaruhi hasil yang akan
diperoleh. Secara umum, prosedur ekstraksi yang baik untuk isolasi DNA mencakup tiga hal
penting, yaitu harus bisa dihasilkan DNA dengan kemurnian yang tinggi, DNAnya harus utuh,
dan jumlahnya mencukupi (konsentrasi tinggi). Prinsip dasar isolasi total DNA dari jaringan
adalah dengan memecah dan mengekstraksi jaringan tersebut, kemudian ekstrak sel
dipurifikasi sampai didapatkan pelet sel yang mengandung DNA total (Faatih, 2009). Isolasi
DNA memiliki beberapa tahap, yaitu isolasi sel, lisis dinding dan membran sel, ekstraksi dalam
larutan, purifikasi, dan presipitasi (Faatih, 2009). Prinsip dalam melakukan isolasi DNA terdiri
dari 2, yaitu sentrifugasi dan presipitasi (Faatih, 2009).
 Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis
molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan
berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas. Teknik sentrifugasi
tersebut dilakukan di dalam sebuah mesin yang bernama mesin sentrifugasi dengan kecepatan
yang bervariasi. Isolasi DNA/RNA merupakan langkah awal yang harus dikerjakan dalam
rekayasa genetika sebelum melangkah ke proses selanjutnya. Prinsip dasar isolasi total
DNA/RNA dari jaringan adalah dengan memecah dan mengekstraksi jaringan tersebut
sehingga akan terbentuk ekstrak sel yang terdiri atas sel-sel jaringan, DNA, dan RNA.
Kemudian ekstrak sel dipurifikasi sehingga dihasilkan pelet sel yang mengandung DNA/RNA
total. Prinsip-prinsip isolasi DNA plasmid hampir sama dengan isolasi total DNA/RNA dari
jaringan.
 BAB III
METODOLOGI PRAKTIKUM

3.1 Alat
- Mortar
- Pipet mikro
- Mikro tip
- Lemari pendingin 4°C
- Inkubator
- Tabung mikrosentrifus 1,5 ml
- Rak tabung
- Mesin sentrifugasi
- Timbangan
- Vortex
- Spatula
- Pisau
- Gelas ukur

3.2 Bahan
- TE (Tris-Cl & EDTA) pH 8.0
- Etanol 70%
- Isopropanol
- Potassium acetate solution
- DNase-free RNase
- Proteinase K
- Sybr safe 1x
- dH2O.

3.3 Isolasi DNA sampel

 Proses isolasi DNA dilakukan dengan menggunakan Wizard® Genomic DNA
Purification Kit (Promega).
1. Preparasi Jaringan Hewan dan Pelisisan Sel
Sebanyak 20 mg daging sapi segar, daging babi segar, dan sampel sosis sapi dihancurkan
sampai halus menggunakan pisau steril, lumpang alu dan blender. Masing-masing daging
dan sampel dimasukkan ke dalam mikrosentrifuge tube 1,5 ml lalu ditambahkan 600 μl
Nuclei Lysis Solution. Masing-masing campuran tersebut dihomogenkan selama 10 detik
kemudian diinkubasi pada suhu 650C selama 30 menit.
2. Degradasi RNA dan Presipitasi Protein
Masing-masing campuran yang sudah diinkubasi ditambahkan 3 μl larutan RNAse lalu
diinkubasi kembali pada suhu 370C selama 30 menit. Selanjutnya ditambahkan 200 μl
Protein Precipitation Solution dan divortex, kemudian didiamkan dalam ice selama 5
menit lalu disentrifugasi dengan kecepatan 16.000 rpm selama 4 menit.
3. Presipitasi dan Pelarutan DNA
Supernatan yang terbentuk ditambahkan 600 μl isopropanol kemudian dihomogenkan
lalu disentrifugasi dengan kecepatan 16.000 rpm selama 1 menit. Endapan yang
terbentuk ditambahkan 600 μl etanol 70% kemudian dihomogenkan lalu disentrifugasi
kembali dengan kecepatan 16.000 rpm selama 1 menit. Endapan yang terbentuk
dipisahkan dengan etanol 70% lalu endapan di keringkan selama 15 menit kemudian
ditambahkan 100 μl DNA Rehydration Solution, selanjutnya didiamkan selama 1 jam
pada suhu 650C dan disimpan pada suhu 40C.
 BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil

No Sample Konsentrasi (ng/µL) Kemurnian

(A260/A280)

1 Genom daging babi 713 1,81

2 Genom daging sapi 746 1,67

B. Pembahasan

Prinsip dalam melakukan isolasi DNA terdiri dari 2, yaitu sentrifugasi dan presipitasi
(Faatih, 2009). Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis
molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan
berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas. Teknik sentrifugasi
tersebut dilakukan di dalam sebuah mesin yang bernama mesin sentrifugasi dengan kecepatan
yang bervariasi. Isolasi DNA/RNA merupakan langkah awal yang harus dikerjakan dalam
rekayasa genetika sebelum melangkah ke proses selanjutnya. Prinsip dasar isolasi total
DNA/RNA dari jaringan adalah dengan memecah dan mengekstraksi jaringan tersebut
sehingga akan terbentuk ekstrak sel yang terdiri atas sel-sel jaringan, DNA, dan RNA.
Kemudian ekstrak sel dipurifikasi sehingga dihasilkan pelet sel yang mengandung DNA/RNA
total. Prinsip-prinsip isolasi DNA plasmid hampir sama dengan isolasi total DNA/RNA dari
jaringan.
Isolasi DNA melalui beberapa tahap diantaranya yaitu preparasi jaringan hewan dan
pelisisan sel, degradasi RNA dan dan presipitasi protein, dan yang terakhir presipitasi dan
pelarutan DNA. Pada tahap preparasi jaringan hewan dan pelisisan sel pada Isolasi DNA sapi
dan babi dimulai dengan penumbukan dan sentrfugasi sampel kemudian ditambahkan nuclei
lysis solution yang terdiri dari SDS (Sodium Dodeycl Sulfate) dan EDTA yang berfungsi untuk
merusak lipid pada membrane sel sehingga leukosit hancur. Kemudian dihomogenkan dan
diinkubasi.

Tahap selanjutnya yaitu degradasi dan presipitas protein. Campuran ditambahkan dengan
larutan RNAase kemudian diinkubasi dan ditambahkan dengan protein precipitation solution.
RNAase merupakan endoribonuclease yang mengkatalisis degradasi untai tunggal RNA
dengan pemotongan rantai 3’, 5’-fosfodiester, di mana basa dari nukleotida pada ikatan di
posisi 3’ yang akan dipotong merupakan pirimidin. Penambahan protein precipitation solution
(senyawa yang mengandung amonium asetat) akan berikatan dengan protein mengakibatkan
terbentuknya senyawa baru yang memiliki kelarutan yang lebih rendah, sehingga
menyebabkan protein mengendap. Kemudian di vortex, diinkubasi dan disentrifugasi dengan
kecepatan 16.000 rpm selama 4 menit sehingga diperoleh supernatant.

Tahap terakhir yaitu presipitasi dan pelarutan DNA. supernatant yang mengandung DNA
dipisahkan dengan cara dipresipitasi menggunakan alkohol yang dapat berupa isopropanol atau
lebih sering etanol. Proses presipitasi dibantu dengan garam yang berfungsi untuk menetralkan
muatan pada gugus fosfat DNA. Garam yang umumnya digunakan adalah natrium asetat.
Dalam larutan, natrium asetat akan terionisasi menjadi Na+ dan CH3COO- dimana Na+ akan
berinteraksi dengan gugus fosfat (PO42-) pada DNA. ikatan Na+ dan fosfat (PO42-) yang
terbentuk akan menyebabkan DNA menjadi kurang hidrofilik. Interaksi ion di dalam larutan
dipengaruhi oleh konstanta dielektrik pelarut. Etanol dalam hal ini berfungsi untuk
menurunkan konstanta dielektrik air yang mempermudah interaksi ion Na+ dan fosfat sehingga
membuat DNA menjadi kurang hidrofil dan mengendap. Kemudian dihomogenkan dan
disentrifugasi kembali. Endapan yang terbentuk dipisahkan dengan etanol 70% untuk
melonggarkan pelet, sehingga etanol dapat berpenetrasi dan membersihkan garam-garam yang
terikat pada DNA. suspense yang terbentuk kemudian disentrifugasi dimana pellet akan
terbentuk kembali. Supernatant dibuang dan pelet dikeringkan dengan menguapkan sisa etanol
dengan desikator. Pelet DNA yang sudah kering dapat dilarutkan dengan air (ddH2O) ataupun
TE buffer.

Konsentrasi genom hasil isolasi diukur dengan menggunakan spektrofotometer Nano Drop
ND-100 dengan panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Konsentrasi genom yang dihasilkan
dari sampel daging sapi dan daging babi masing-masing adalah 746 ng/μl dan 713 ng/μl. Nilai
A260/280 hasil isolasi genom sapi 1,67, sedangkan genom babi adalah 1,81.
 DAFTAR PUSTAKA

Yuwono, T. 2009. Biologi Molekular. Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Pertanian

Universitas Gadjah Mada. 209-215. Jakarta. Erlangga.

Suryo. 2004. Genetika. Gadjah mada university press : Yogyakarta

Istanti, A Prasetyo dan Listyorini D. 1999. Biologi Sel. Malang : IMSTEPJIICA FMIPA
Universitas Negeri Malang.

Yulianti, E. 2006. Pengembangan Teknik Isolasi DNA Tumbuhan menggunakan Detergen

Komersial. Seminar Nasional MIPA UNY.

Faatih, M. 2009. Isolasi dan digesti DNA kromosom. Jurnal Penelitian Sains & Teknologi, 10
(1): 61 - 67.

Vivikananda,Elvira.2014.”Deteksi DNA Babi dan DNA Sapi dengan Menggunakan Metode

Insulated Isothermal Polymerase Chain Reaction (ii-PCR)”.Fakultas Kedokteran dan
Ilmu Kesehatan.UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. Tanggerang Selatan