NO DOKUMEN FO-UGM-BI-07

BORANG
BERLAKU SEJAK 3 Maret 2008
TEKNIK BIOKIMIA REVISI 00
LABORATORIUM BIOKIMIA HALAMAN 1 dari 15

LAPORAN PRAKTIKUM TEKNIK BIOKIMIA

ACARA VIII
ELEKTROFORESIS

Nama : EFINA
NIM : 19/444678/BI/10356
Gol./Kel. : D/3
Asisten : Ireneus Seno Prasojo

LABORATORIUM BIOKIMIA
FAKULTAS BIOLOGI
UNIVERSITAS GADJAH MADA
YOGYAKARTA
2020
 ACARA VIII

ELEKTROFORESIS

I. Tujuan
Praktikum ini bertujuan untuk memisahkan DNA genus Eimeria menggunakan
elaktroforesis dan melaporakannya secara tertulis
II. Dasar Teori
Elektroforesis merupakan teknik yang digunakan untuk memisahkan senyawa
bermuatan dalam media yang dialiri arus atau medan listrik, di mana senyawa akan
bergerak menuju elektroda yang bermuatan berlawanan. Pada praktikum ini digunakan
sampel DNA yang mana memiliki gugus fosfat yang bermuatan negative. Sehingga pada
percobaan ini, sesuai dengan prinsip kerja elektroforesis, muatan listrik digunakan untuk
menarik molekul DNA dari kutup negative (katoda) ke kutub positif (anoda) (Hikmatyar,
et al., 2015; Langga, et al., 2012). Namun setiap molekul akan bergerak dengan kecepatan
yang berbeda, hal ini disebabkan oleh perbedaan karakteristik fisik molekul dan sistem
eksperimental yang digunakan (Reddy & Raju, 2012).
Elektroforesis ditentukan oleh sampel, larutan sampel dan medan listrik. Sampel
dapat mempengaruhi laju perpindahan molekul dilihat dari bentuk molekul, muatan dan
ukuran. Pemilihan larutan didasarkan pada jenis sampel yang dielektroforesis. Buffer yang
dipilih harus bias mencapai titik isolistrik dan tidak mengakibatkan perubahan kimia atau
perubahan struktur molekul yang diteliti. Medan listrik yang dipilih harus sesuai, jika lebih
besar dari 10 V/cm dapat menyebabkan pemanasan yang dapat merusak sampel, misalnya
pada DNA yang dapat terdenaturasi. Selain itu, media penyangga akan kehilangan air
karena penguapan sehingga hasil fragmen dapar bergeser (Harahap, 2018).
Elektroforesis terdiri dari beberapa komponen utama misalnya larutan elektrolit,
media pemisah dan elektroda. Larutan elektronik berfungsi sebagai pembawa komponen.
Larutan elektrolit yang biasa digunakan berupa larutan buffer dengan pH spesifik senyawa
yang dipisahkan. Media pemisah adalah tempat proses pemisahan terjadi. Elektroda
digunakan sebagai penghubung arus listrik dengan media pemisah dan arus listrik sebagai
sumber energi pada rangkaian alat (Harahap, 2018).
Medium yang digunakan dalam elektroforesis dapat berupa agar-agar, kertas
(selulosa asetat, selulosa nitrat), gel polikrilamid, gel kanji dan busa poliuretan (Harahap,
2018). Gel agarose merupakan medium yang digunakan dalam percobaan ini. Gel agarosa
terbuat dari rumput laut Gelidium dan Gracilaria, terdiri dari subunit agarobiosa. Agorosa
efektif memisahkan fragmen DNA dengan ukuran 100 bp hingga 25 kb1 (Lee, et al., 2012).
Secara umum agarosa memiliki kelebihan media gel tidak beracun, gel cepat dibuat
dan mudah dicetak, baik untuk memisahkan molekul DNA yang besar dan dapat
memulihkan sampel dengan mencairkan gel. Namun kekurangannya biaya agarosa tinggi,
hasil pita tidak jelas dan pemisahan kurang baik jika sampel memiliki berat molekul
rendah. Gel poliakrilamida terbentuk dari ikatan silang secara kimiawi oleh polimerisasi
 akrilamida dengan zat penghubung silang, biasanya N, N'-metilenebisakrilamida.
Reaksinya adalah polimerisasi radikal bebas, biasanya dilakukan dengan amonium
persulfat sebagai inisiator dan N, N, N ', N'-tetramethylethylendiamine (TEMED) sebagai
katalis. Poliakrilamida umumnya lebih sulit disiapkan dan memakan waktu yang lebih
lama dibanding gel agarose.
Keuntungan penggunaan poliakrilamida seperti gel ikatan silang kimiawi yang
stabil. pita tajam dan baik untuk pemisahan fragmen dengan berat molekul rendah.
Kekurangannya monomer beracun, gel sulit disiapkan dan sering kali bocor serta butuh gel
baru untuk setiap percobaan (Patricia & Nates, 2012).
Elektroforesis dimanfaatkan dalam berbagai bidang, misalnya dalam bidang
kesehatan digunakan untuk menentukan penyakit yang tidak dapat dideteksi dengan studi
diagnostik. Selain itu digunakan juga dalam identifikasi banyak penyakit, teknologi gen,
pemisahan asam nukleat dan penentuan urutan protein dan kanker (Coşkun & Öztopuz,
2020).
III. Metode
A. Bahan
Pada praktikum ini digunakan 0,25 gram agarose, 25 ml TBE 1X, SYBR save 3
mikroliter, 2 mikroliter marker (ladder), 9 mikroliter loading dye, 5 mikroliter sampel
A (DNA tembakau), akuades, 5 mikroliter sampel B (DNA nyamuk) dan parafilm.
B. Alat
Alat yang digunakan dalam pecobaan ini yaitu elektroforesis (untuk memisahkan
senyawa/elektroforesis), mikropipet (mengambil larutan), Erlenmeyer
(menghomogenisasi), microwave (memanaskan agarose agar cair dan set alat
elektroforesis yaitu chamber, comb, tray, transilluminator, dan sumber tegangan/listrik.
Chamber yang berfungsi sebagai cetakan gel agarose. Tray berfungsi sebagai tempat
peletakan agarose. Sisiran digunakan sebagai pembuat sumuran, dan sumber
tegangan/listrik untuk running sampel. Parafilm sebagai alat bantu pencampuran
sampel. UV-Transilluminator digunakan sebagai alat visualisasi sampel.
C. Cara kerja
Pertama yang dilakukan yaitu pembuatan gel agarose dan preparasi sampel.
Agarose ditimbang 0,25 gram. Dimasukkan ke erlenmeyer berisi 25 ml TBE 1X dan
dihomogenisasi. Kemudian dimasukkan ke microwave selama 1 menit (tambahan 10
detik jika belum larut). Ditambah SYBR save 3 mikroliter dan dihomogenisasi.
Agarose dituang ke chamber dan ditunggu hingga menjendal (±30 menit). Gel yang
telah menjendal dimasukkan ke dalam elfo beserta chamber kemudian dituang TBE
sampai gel terendam.
Preparasi sampel menggunakan parafilm. Parafilm dibentangkan kemudian diambil
3 mikro liter loading dye dan diteteskan pada parafilm (untuk 6 sumuran). Dibuat tiga
jenis, pertama 2 mikroliter marker (ladder) ditambah 3 mikroliter loading dye. Kedua
5 mikroliter sampel A (DNA tembakau) ditambah 3 mikroliter loa/ding dye. Ketiga 5
mikroliter sampel sampel B (DNA nyamuk) ditambah 3 mikroliter loading dye.
 Kemudian sampel di mix (up down) dimasukkan ke sumuran. Tahap terakhir
visualisasi DNA.
Tahap kedua yaitu running test dan visualisasi UV-transiluminator. Sampel
diinjeksi pada sumuran elfo dengan mikropipet. Elfo kemudian ditutup dan dilakukan
running dengan tegangan 100 V selama 25 menit. Untuk hasil running yang muncul
lalu divisualisasi menggunakan Gel Doc yang terhubung dalam aplikasi Good View
dan gambar diambil dengan cepat karena semakin lama sampel akan terdifusi di dalam
gel.
D. Bagan Alir
1. Pembuatan gel agarose dan preparasi sampel

dimasukkan ke
dimasukkan ke microwave selama 1
erlenmeyer berisi 25 ditambah SYBR
agarose ditimbang menit (tambahan 10 save 3 mikroliter
0,25 gram ml TBE 1X dan
detik jika belum dan dihomogenisasi
dihomogenisasi
larut)

agarose dituan ke
preparasi sampel chamber dan
menggunakan dituang TBE sampai dimasukkan ke elfo ditunggu hingga
parafilm. parafilm gel terendam serta chamber
menjendal (±30
dibentangkan
menit)

diambil 3 mikro 5 mikroliter sampel 5 mikroliter sampel

liter loading dye dan 2 mikrol iter marker A (DNA tembakau) sampel B (DNA
(ladder) ditambah 3
diteteskan pada ditambah 3 nyamuk) ditambah 3
mikroliter loading
parafilm (untuk 6 mikroliter loading mikroliter loading
dye
sumuran) dye dye

sampel di mix (up

visualisasi DNA down) dimasukkan
ke sumuran

2. Running test dan visualisasi UV-transiluminator

Sampel diinjeksi Dilakukan Visualisasi hasil

ke dalam running 100 V running dengan
sumuran selama 25 menit Gel Doc

Penyesuaian
ukuran pita
dengan generuler

IV. Hasil Pembahasan

A. Hasil
Dari percobaan yang sudah dilakukan didapatkan hasil berupa
 Gambar 1. Hasil elektroforesis DNA Eimeria
Keterangan:
M = Marker
1 = Produk PCR Eimeria acervulina
2 = Produk PCR Eimeria brunetti
3 = Produk PCR Eimeria tenella
4 = Produk PCR Eimeria mitis
5 = Produk PCR Eimeria praecox
6 = Produk PCR Eimeria maxima
7 = Produk PCR Eimeria necatrix
8 = kontrol negatif (tanpa template DNA)
B. Pembahasan
Elektroforesis bertujuan untuk memisahkan molekul berdasar muatan dan ukuran
molekul. Ketika elektroforesis yang dialiri arus atau medan listrik, molekul akan
bergerak menuju elektroda yang bermuatan berlawanan. Pada praktikum ini digunakan
sampel DNA yang mana memiliki gugus fosfat yang bermuatan negative. Sehingga
pada percobaan ini, sesuai dengan prinsip kerja elektroforesis, muatan listrik digunakan
untuk menarik molekul DNA dari kutup negative (katoda) ke kutub positif (anoda)
(Hikmatyar et al., 2015; Langga, et al., 2012).
Pada percobaan ini digunakan bahan seperti agarose, TBE, SYBR, loading dye,
marker. Sel agarose digunakan sebagai tempat/media running yang akan diisi oleh
DNA. Dapat digunakan untuk sample dengan range luas (200-50000 bp, bp adalah
satuan yang menunjukkan besarnya molekul yang diuji). Selain agarose ada
poliakrilamid. Kelebihan agarose di banding poliakrilamid yaitu agrose punya range
lebih luas. Sementara poliakrilamid dapat mendeteksi molekul dibawah 500 bp.

Kadar agarose yang dibuat 1%, konsentrasi disesuaikan dengan sampel yang akan
diuji. Semakin tinggi konsentrasi agarose semakin sempit/kecil pori-porinya. Pori-pori
kecil lebih cocok digunakan untuk molekul yang ukurannya lebih rendah. Loading dye
berfungsi sebagai pemberat agar sampel DNA yang dipakai tetap dalam gel agarose
(Lee et al., 2012).
Sampel DNA memiliki massa yang ringan, sehingga mudah keluar dari sumuran.
Oleh karena itu, digunakan loading dye sebagai pemberat agar sampel DNA tetap
berada dalam area agarosa dalam sumuran elektroforesis. Kandungan dalam loading
dye yang membuatnya bisa digunakan sebagai pemberat adalah gliserol untuk
meningkatkan densitas sampel. Selain gliserol, loading dye juga mengandung
bromphenol blue dan xylene cyanol.
Tracking dye berfungsi untuk memonitor pergerakan sampel. Fragmen DNA
dengan ukuran 300 pb dimonitor menggunakan bromphenol blue, sedangkan fragmen
DNA ukuran 4.000 pb dimonitor menggunakan xylene cyanol. Marker digunakan
untuk menandai panjang fragment DNA tertentu.
Dalam percobaan ini digunakan buffer TBE. Buffer digunakan untuk
mempertahankan pH dan menyediakan ion guna konduktivitas arus listrik. Dalam
larutan buffer terdapat ion positif dan negatif. Karena digunakan arus listrik untuk
running, dibutuhkan ion postif dan negatif yang disediakan oleh buffer. Kelebihan
buffer TBE yaitu memiliki konduktivitas yang baik sehingga overheating running
dalam waktu yang lama dapat minimum. Overheating perlu dicegah karena sampel
yang digunakan (DNA) termasuk molekul yang mudah berubah komposisi, bentuk

serta dapat terdenaturasi karena suhu .

SYBR merupakan pewarna fluoresensi agar sehingga agarose bisa diamati dengan
sinar UV dimana ada pita DNA. SYBR bisa berinterkalasi dengan basa DNA/RNA.
Sehingga pergerakan DNA/RNA dapat dilacak. Sinar UV dipakai karena dapat
membentuk fluoresensi pada zat-zat tertentu yang memantulkan sinar UV seperti
SYBR. Sehingga saat diamati dengan gel doc dapat dilihat DNA yang ada. SYBR
memiliki kelebihan toksisitas rendah dibandingkan Ethidium bromida (karsinogenik)
dan sensitifitas baik (Lee et al., 2012).
Pada set alat elektroforesis terdapat beberapa alat yang digunakan misalnya
chamber, comb, tray, parafilm dan gel doc. Chamber sebagai tempat/wadah
elektroforesis; Comb sebagai tempat membuat sumuran; tray sebagai cetakan agarosa.
Parafilm sebagai tempat homogenisasi larutan sampel. Gel Doc terhubung dengan
aplikasi Good View untuk memvisualisasikan hasil elektroforesis.
Pada praktikum ini dilakukan homogenisasi dengan metode up and down
menggunakan kertas parafilm bertujuan untuk menghomogenasi atau pencampuran
loading dye dengan sampel agar tercampur rata sehingga sampel yang akan
dimasukkan kedalam sumuran tidak keluar lagi. Tegangan mempengaruhi pada
kecepatan pergerakan fragmen DNA. Semakin tinggi voltasenya, maka fragmen DNA
yang dipisah akan semakin cepat bergerak. Namun berisiko semakin tinggi overheating
pada agarose. Semakin panjang waktunya maka pita akan semakin lebar, hal ini dapat
menyebabkan hasil kurang akurat/valid. Jika waktu singkat, ada kemungkinan running
belum selesai. Sehingga diperlukan waktu dan voltase yang sesuai. Oleh karena itu
pada praktikum ini digunakan 100 volt dan 25 menit. Sampel langsung dimasukan ke
dalam sumuran, karena sampel sudah dicampur loading dye dan sudah siap dimasukan
ke dalam sumuran.
Saat visualisasi menggunakan sinar UV, gel yang telah melalui running test diambil
dari alat (elbow) dan alat harus dimatikan terlebih dahulu. Setelah gel diambil,
kemudian diletakkan pada alat visualisasi bernama gel doc. Gel elektroforesis
dimasukkan kedalam gel doc, lebih tepatnya pada bagian dibawah meja benda lalu
ditutup dan dilakukan pengamatan menggunakan sinar UV.
Di dalam gel doc, terdapat kamera di bagian dalam dan 1 kamera di bagian luar
berada di bagian depan atas gel doc untuk melihat apa yang terjadi di bagian dalam gel
doc. Gel doc akan dihubungkan dengan komputer dan komputer nantinya akan melihat
gambar yang muncul seperti band-band DNA yang nantinya data tersebut akan
digunakan dan diamati.
Pada gambar hasil dapat dilihat hasil elektroforesis dari berbagai jenis Eimeria.
Pada kiri gambar, terdapat huruf M yang berarti marker. Bp ini merupakan satuan besar
molekul DNA yang diukur. Skala yang dipakai dari gambar ini dari paling atas 1500
dan paling bawah 100. 1500 bp ada di atas karena hal ini menunjukkan bahwa molekul
DNA yang didapat semakin besar, hal tersebut akan mempengaruhi gerakan DNA yang
tidak seleluasa jika ukurannya lebih kecil. Pada percobaan digunakan agarose 1%.
Menurut Patricia & Nates (2012), agarose 1% digunakan untuk elektroforesis molekul
DNA sebesar 500-5000.
Produk PCR Eimeria acervulina (1) memiliki besar molekul 800 db. Produk PCR
Eimeria brunette (2) memiliki besar molekul 600 db. Produk PCR Eimeria tenella (3)
memiliki besar molekul 500 db. Produk PCR Eimeria mitis (4) memiliki besar molekul
400 db. Produk PCR Eimeria praecox (5) memiliki besar molekul 350 db. Produk PCR
Eimeria maxima (6) memiliki besar molekul kira-kira 250 db. Produk PCR Eimeria
necatrix (7) memiliki besar molekul 100 db. Sedangkan kontrol negatif (tanpa template
DNA) tidak menunjukkan pita. Kontrol negative (8) tidak memunculkan pita, karena
air tidak mengandung asam nukleat.
Tabel 1. Sekuens PCR Eimeria
 (Hamidinejat, et al., 2010)
Pada tabel di atas, dapat dilihat bahwa hasil elektroforesis dengan PCR Eimeria
berbeda untuk semua hasil. E. maxima yang paling mendekati dengan 250 db (jurnal
205). Hal ini mungkin diakibatkan kualitas pita band DNA yang dihasilkan. Kualitas
hasil band-band DNA dipengaruhi oleh banyaknya sampel yang dimasukkan. Jika
sampel yang dimasukkan terlalu banyak atau melebihi sumuran, dapat menyebabkan
band hasil elektroforesis yang terbentuk menjadi double (smear, smearing). Pada
percobaan terdapat smear pada produk PCR Eimeria acervulina (1) sampai produk
PCR Eimeria maxima (6).

V. Kesimpulan
Dari percobaan yang dilakukan dapat disimpulkan bahwa Produk PCR Eimeria
acervulina (1) memiliki panjang 800 db. Produk PCR Eimeria brunette (2) memiliki
panjang 600 db. Produk PCR Eimeria tenella (3) memiliki panjang 500 db. Produk
PCR Eimeria mitis (4) memiliki panjang 400 db. Produk PCR Eimeria praecox (5)
memiliki panjang 350 db. Produk PCR Eimeria maxima (6) memiliki panjang kira-kira
250 db. Produk PCR Eimeria necatrix (7) memiliki panjang 100 db. Sedangkan kontrol
negatif (tanpa template DNA) tidak menunjukkan pita.
 VI. Daftar pustaka

Coşkun, Ö., & Öztopuz, Ö. 2020. Electrophoresis applications used in medicine. E-Journal of
New World Sciences Academy, 15(1): 12–25.

Hamidinejat, H., Shapouri Seifiabad, M., Mayahi, M., & Borujeni, M. P. 2010. Characterization
of Eimeria species in commercial broilers by PCR based on ITS1 regions of rDNA. Iranian
Journal of Parasitology, 5(4): 48–54.

Harahap, M. R. 2018. Elektroforesis: analisis elektronika terhadap biokimia genetika. CIRCUIT:

Jurnal Ilmiah Pendidikan Teknik Elektro, 2(1), 21–26.

Hikmatyar, M. F., Royani, J. I., & . D. 2015. Isolasi dan amplifikasi DNA keladi tikus
(Thyponium flagelliform) untuk identifikasi genetik. Jurnal Bioteknologi & Biosains
Indonesia (JBBI), 2(2): 42.

Langga, I.F., Restu, Muh., Kuswinanti, T. 2012. Optimalisasi suhu dan lama inkubasi dalam
ekstraksi DNA tanaman bitti (Vitex cofassus Reinw) serta analisis keragaman genetik
dengan RAPD-PCR. J. Sains & Teknologi, 12(3): 265–276.

Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., & Kim, Y. H. 2012. Agarose gel electrophoresis for the
separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments, (62): 1–5.

Patricia, B., & Nates, S. 2012. Gel Electrophoresis - Principles and Basics. In Gel
Electrophoresis - Principles and Basics (pp. 3–13). Rijeka: InTechOpen

Reddy, P. R., & Raju, N. 2012. Gel-Electrophoresis and its applications. In Gel Electrophoresis
– Principles and Basics (pp. 15–17). Rijeka: InTechOpen.
Lampiran
1. Coskun, et al., 2020

2. Harahap, et al., 2018

3. Hamidinejat, et al., 2010
4. Hikmatyar et al., 2015

5. Langga, et al., 2012

6. Lee, et al., 2012
7. Patricia & Nates, 2012

8. Reddy & Raju, 2012