Dipresentasikan tanggal: Kepada Yth:

PERAN PEMBERIAN VITAMIN D3 TERHADAP PERBAIKAN

MOUSE COLITIS HISTOLOGY INDEX DAN DISEASE ACTIVITY INDEX

PADA MENCIT MODEL KOLITIS

PROPOSAL
Untuk Memenuhi Persyaratan
Memperoleh Gelar Spesialis

Oleh :
Khodimatur Rofiah
168070900111002

Pembimbing :
dr. Satrio Wibowo, Sp.A(K), M.Si.Med

PROGRAM PENDIDIKAN DOKTER SPESIALIS-1

ILMU KESEHATAN ANAK
RUMAH SAKIT UMUM DAERAH DR.SAIFUL ANWAR
FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG
2020

i
 DAFTAR ISI

LEMBAR PENGESAHAN ................................................................................. ii

DAFTAR ISI ...................................................................................................... iii

DAFTAR GAMBAR ........................................................................................... v

DAFTAR TABEL ............................................................................................... vi

DAFTAR SINGKATAN ..................................................................................... vii

BAB 1 PENDAHULUAN ................................................................................... 1

1.1 Latar Belakang.............................................................................................1

1.2 Rumusan Masalah .......................................................................................2

1.2.1. Rumusan Sub-Masalah ...........................................................................2

1.3. Tujuan Penelitian ........................................................................................3

1.3.1. Tujuan Umum ..........................................................................................3

1.3.2. Tujuan Khusus .........................................................................................3

1.4. Manfaat Penelitian ......................................................................................3

1.4.1. Manfaat Teoritis .......................................................................................3

1.4.2. Manfaat Praktis ........................................................................................3

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA.............................................................................4

2.1. Ulcerative Colitis .........................................................................................4

2.1.1. Definisi .....................................................................................................4

2.1.2 Epidemiologi .............................................................................................4

2.1.3. Patofisiologi .............................................................................................5

2.1.4. Etiopatogenesis .......................................................................................6

2.1.5. Manifestasi Klinis .....................................................................................7

2.1.6. Diagnosis .................................................................................................8

2.1.6. Tata Laksana .........................................................................................10

2.1.8. Prognosis ...............................................................................................13

2.2. Vitamin D ..................................................................................................14

ii
2.2.1. Sumber Vitamin D..................................................................................15

2.2.2. Metabolisme Vitamin D ..........................................................................15

2.2.3. Peran Klasik dan Non Klasik Vitamin D .................................................18

2.2.3.1. Peran Klasik Vitamin D .......................................................................18
2.2.3.2. Peran Non Klasik Vitamin D............. ..................................................19
2.3. Peran Intestinal Epithelial Cells pada Patogenesis IBD ...........................25
2.4. Peran Vitamin D pada Inflammatory Bowel Disease......... .......................29

2.3.1. Defisiensi Vitamin D pada Inflammatory Bowel Disease. ......................45

2.4. Peran Interleukin-17 pada Inflammatory Bowel Disease ..........................47

2.5. Dextran Sulphate Sodium .........................................................................30

2.6.Kerangka Konsep ......................................................................................35

BAB 3 KERANGKA KONSEP DAN HIPOTESIS PENELITIAN .......................38

3.1. Kerangka Konsep .....................................................................................38

3.2. Keterangan Kerangka Konsep..................................................................36

3.1. Hipotesis Penelitian ..................................................................................39

BAB 4 METODE PENELITIAN ........................................................................40

4.1. Waktu dan Tempat Penelitian ...................................................................41

4.1.1. Waktu Penelitian ....................................................................................41

4.1.2. Tempat Penelitian ..................................................................................41

4.2. Persetujuan Penelitian ..............................................................................42

4.3. Subjek Penelitian ......................................................................................42

4.3.1. Sampel Penelitian ..................................................................................42

4.3.2. Kriteria Inklusi ........................................................................................42

4.3.3. Kriteria Drop Out ....................................................................................42

4.3.4. Perhitungan Besar Sampel ....................................................................42

4.3.5. Teknik Randomisasi ...............................................................................43

4.4. Variabel Penelitian ....................................................................................43

4.4.1. Variabel Bebas.......................................................................................43

4.4.2. Variabel Tergantung ...............................................................................43

iii
4.5 Definisi Operasional...................................................................................43

4.5.1. Mencit ................................................................................................... 43

4.5.2. Vitamin D3 ............................................................................................. 44

4.5.3. Dextran Sodium Sulfat 5%.................................................................... 44

4.5.4. Kerusakan Mukosa Kolon ..................................................................... 44

4.5.6 Perbaikan Mukosa Kolon ....................................................................... 44

4.6. Metode Pemeriksaan ............................................................................... 44

4.6.1. Prosedur Eksperimen dan Pengamatan ............................................... 44

4.7. Alur Penelitian .......................................................................................... 46

4.8 Analisis Statistik ........................................................................................ 47

4.9 Penyajian Data ......................................................................................... 48

DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................ 49


iv
 DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1 Etiopatogenesis Inflammatory Bowel Disease .................................. 6

Gambar 2.2 Metabolisme Vitamin D ....................................................................16

Gambar 2.3 Mekanisme Keterlibatan Vitamin D terhadap Efek Anti-inflamasi

dalam Memodulasi Sistem imun ..........................................................................24

Gambar 2.4 Skema Kompartemen Kripta pada Usus Kecil dan 4 jalur utama

signaling dari Stem Cell .......................................................................................26

Gambar 2.5 Barier Intestinal paraceluller pada intestinal sehat dan intestinal yang

mengalami inflamasi ............................................................................................28

Gambar 2.6 Peran Vitamin D dalam Menghambat Prolifersi Sel .........................30

Gambar 4.1 Pengelompokan Subyek Penelitian .................................................40

v
 DAFTAR TABEL

Tabel 2.1. Manifestasi Klinis Inflammatory Bowel Disease…………………………7

Tabel 2.2 Manifestasi Klinis Ekstraintestinal Inflammatory Bowel Disease……..18

Tabel 2.3 Evaluasi Laboratorium pada IBD .........................................................10

Tabel 2.4 Skor DAI ...............................................................................................33

Tabel 2.5 Skor MCHI ............................................................................................34

vi
 DAFTAR SINGKATAN

AF-2 : a ligand-dependent transcriptional activation

APC : antigen presenting cell

APCs : antigen presenting cells

ASCA : Anti-Saccharomyces cerevisiae antibody

Bcl-2 : B-cell lymphoma-2

CD : Crohn’s disease

CYPs : cytochrome P450 mixed-function oxidases

Da : Dalton

DBP : vitamin D binding protein

DC : dendritic cell

DCs : Dendritic cells

DSS : dextran sulphate sodium

EEN : exclusive enteral nutrition

ER : endoplasmic reticulum

FGF : fibroblast growth factor

GWAS : Genome-wide association studies

HAT : histone acetyl transferase

HEV : high endothelial venule

H1 : Hipotesis 1

H2 : Hipotesis 2

H3 : Hipotesis 3

IBD : Inflammatory Bowel Disease

IFN-γ : interferon-gamma

IL : interleukin

iDC : imatur dendritic cell

LN : lymph node

mDC : matur dendritic cell

vii
MHC : major histocompatibility complex

MIPA : Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

NF-κB : nuclear factor-kappa B

NK : Sel natural killer

NKT : Natural killer T

NLRs : nucleotide-binding and oligomerization domain like receptors

PAMPs : pathogen-associated molecular pattern

pANCA : perinuclear antineutrophil cytoplasmic

PRRs : pattern recognition receptors

PSC : primary sclerosing cholangitis

PTH : hormon paratiroid

RNA : ribonucleic acid

ROS : reactive oxygen species

RXR-α : retinoid X receptor alpha

TFIIB : basal transcription factors

Th-1 : Sel T helper tipe 1

TLRs : toll-like receptors

TNBS : trinitrobenzene sulfonic acid

TNF-α : tumor necrosis factor-alpha

TREM-1 : triggering receptor expressed on myeloid cells-1

UC : Ulcerative Colitis

VDR : vitamin D receptor

VDRE : vitamin D responsive elemen

5-ASA : 5-aminosalicylic acid

6-MP : 6-mercaptopurine

7-DHC : 7-dehydrocholesterol

viii
 BAB 1

PENDAHULUAN

1. Latar Belakang

Inflammatory Bowel Disease (IBD) dikarateristikkan sebagai peradangan

kronis pada saluran pencernaan. Inflammatory Bowel Disease dibagi menjadi

dua bentuk yaitu Ulcerative Colitis (UC) dan Crohn Disease (CD), ditandai oleh

akumulasi sel inflamasi pada submukosa dan kerusakan lapisan sel epitel

instestinal (intestinal epithelial cells (IEC)). Beberapa penelitian menunjukkan

adanya faktor risiko IBD, termasuk kerentanan genetik, perubahan flora normal

bakteri usus, pemicu lingkungan termasuk makanan, dan gangguan regulasi

respon imun. Insiden tertinggi terdapat di negara North eastern Slovenia dengan

rata-rata diagnosis pertahun sebesar 7,6 per 100.000 untuk IBD, 4,6 per 100.000

untuk CD, dan 2,8 per 100.000 untuk UC (Jin-Soo et al., 2017; Stephanie & Iona,

2017).

Perubahan histologi yang terjadi pada kolitis dikategorikan kedalam

activity dan chronicity. Activity dicirikan sebagai inflamasi aktif yaitu infiltrasi

neutrofil, inflamasi epitel kelenjar/kripta dan epitel permukaan yang

menyebabkan kerusakan destruktif epitel, infiltrasi neutrofilik dan limfoplasmatik

pada lamina propria. Chronicity merupakan perubahan histoarsitektur dan sitologi

kelenjar akibat injuri pada epitel setelah peradangan aktif dan kronis, berupa

perubahan kripta, pembentukan villiform dari epitel permukaan serta metaplasia

sel Paneth dan/atau hiperplasia sel Paneth (Gui et al., 2018).

Mencit yang diinduksi dextran sulphate sodium (DSS) mengalami

kerusakan epitel usus dan meningkatkan permeabilitas mukosa kolon sehingga

terjadi defek integritas barier epitel yang menyebabkan berbagai molekul seperti

bakteri dapat masuk, disertai dengan meningkatnya sitokin pro-inflamasi dan

menurunnya sitokin anti-inflamasi (Kim et al., 2014).

1
 Vitamin D berperan dalam melindungi barrier epitel usus, mengatur

sistem kekebalan tubuh, mempromosikan sitokin anti-inflamasi dan memodulasi

mikrobioma usus. Penderita IBD berisiko mengalami defisiensi vitamin D melalui

intake yang kurang, kekurangan paparan sinar matahari, dan malabsorpsi

vitamin yang larut dalam lemak. Berdasarkan studi meta-analisis menunjukkan

prevalensi defisiensi vitamin D sebesar 38,1% pada CD dan 31,6% pada UC.

Vitamin D3 atau kolekalsiferol merupakan bentuk aktif dari vitamin D. Vitamin D

mengubah proliferasi seluler melalui beberapa mekanisme, yang paling menonjol

adalah mempengaruhi perkembangan siklus sel, apoptosis, dan diferensiasi.

Pemberian vitamin D3 mengubah proliferasi sel dengan meningkatkan atau

menekan transkripsi gen yang mengatur pertumbuhan sel. Aktifasi transkripsi,

diferensiasi dan proliferasi serta maturasi sel tersebut terjadi pada intestinal stem

cells (ISC) (Del Pinto et al., 2015; John & Alan, 2018).

Peran proteksi vitamin D pada saluran pencernaan yang diduga dapat

mengubah proliferasi seluler dengan mengatur pertumbuhan/perbaikan sel, hal

ini yang mendorong peneliti untuk melakukan penelitian ini.

1.2. Rumusan Masalah

Apakah pemberian vitamin D3 berperan terhadap perbaikan mouse colitis

histology index (MCHI) dan disease activity index (DAI) pada mencit model

kolitis?

1.2.1. Rumusan Sub-Masalah

Selanjutnya rumusan masalah tersebut dijabarkan dalam beberapa

rumusan sub-masalah, sebagai berikut:

1. Apakah pemberian vitamin D3 menurunkan skor mouse colitis histology

index (MCHI) pada mencit model kolitis?

2
2. Apakah pemberian vitamin D3 menurunkan skor disease activity index

(DAI) pada mencit model kolitis?

1.3. Tujuan Penelitian

1.3.1. Tujuan Umum

Membuktikan peran vitamin D3 terhadap perbaikan mouse colitis histology

index (MCHI) dan disease activity index (DAI) pada mencit model kolitis.

1.3.2. Tujuan Khusus

1. Membuktikan bahwa pemberian vitamin D3 menurunkan skor mouse

colitis histology index (MCHI) pada mencit model kolitis.

2. Membuktikan bahwa pemberian vitamin D3 menurunkan skor disease

activity index (DAI) pada mencit model kolitis.

1.4. Manfaat Penelitian

1.4.1. Manfaat Teoritis

Mengembangkan pengetahuan tentang pengaruh pemberian

vitamin D3 dalam perbaikan mouse colitis histology index (MCHI) dan

disease activity index (DAI) pada mukosa kolon yang mengalami

peradangan.

1.4.2. Manfaat Praktis

Mengembangkan terapi baru untuk tatalaksana pemberian vitamin

D3 untuk perbaikan mukosa kolon pada kolitis.

3
 BAB 2

TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Ulcerative Colitis

2.1.1. Definisi

Ulcerative colitis (UC) adalah inflammatory bowel disease (IBD), berupa

kelainan idiopatik kronis yang diyakini hasil dari interaksi yang kompleks antara

faktor genetik, lingkungan, kekebalan, dan mikroba. Ulcerative colitis ditandai

dengan inflamasi pada mukosa yang menyebabkan gangguan pada struktur dan

fungsi saluran pencernaan. Kolitis ulseratif merupakan proses inflamasi pada

mukosa dan terbatas pada kolon (Okamoto & Watanabe, 2016).

2.1.2. Epidemiologi

Insidensi Inflammatory bowel disease pada anak tertinggi yaitu di negara

Skotlandia terjadi peningkatan 76% dalam diagnosis IBD sejak pertengahan

tahun 1990. Kolitis ulseratif meningkat 2,7 kali selama periode 10 tahun di

California Utara. Pada anak Asia perkembangan Ulcerative Colitis lebih sering

daripada Crohn Disease. Insiden tertinggi di negara British Columbia, Canada

dengan dengan rata-rata diagnosis pertahun sebesar 15,9 per 100.000 untuk

IBD, 6,41 per 100.000 untuk CD, dan 6,7 per 100.000 untuk UC. Di negara

British Columbia, South Asians memiliki insidensi IBD 3 kali lebih tinggi

dibandingkan non-South Asians. North eastern Slovenia sebesar 7,6 per 100.000

untuk IBD, 4,6 per 100.000 untuk CD, dan 2,8 per 100.000 untuk UC. Pada anak

insidensi CD lebih tinggi daripada UC di negara maju (Pinsk et al., 2007;

Abramson et al., 2010; Jussila et al., 2013).

Data di Indonesia dari Divisi Gastrohepatologi Departemen Ilmu

Kesehatan Anak di Rumah Sakit Cipto Mangunkusumo tahun 2004-2010

melaporkan 10 kasus IBD. Delapan dari 10 kasus tersebut termasuk dalam

4
klasifikasi UC. Hal ini berbeda dengan berbagai laporan dari negara maju yang

menunjukkan bahwa CD sitemukan 2 kali lebih banyak dibandingkan UC (Kadim,

2012).

2.1.3. Patofisiologi

Inflammatory bowel disease adalah penyakit yang dimediasi oleh sistem

imun. Beberapa tahun terakhir, interaksi imunitas bawaan dan adaptif berperan

dalam proses penyakit tersebut menjadi semakin jelas. Studi Genome-wide

association telah mengindetifikasi lebih dari 200 lokus genetik yang terkait

dengan IBD. Faktor genetik mempengaruhi risiko IBD dan menyebabkan

gangguan integritas pertahanan epitel, defisit autofagi dan gangguan diferensiasi

limfosit, terutama pada CD. Mikrobioma dan faktor lingkungan berhungan

dengan risiko kejadian IBD. Pada perokok aktif dan pasif, kondisi stress

psikososial, faktor makanan, kemungkinan berkembang menjadi CD 2 kali lebih

tinggi. Tidak ditemukan mikroorganisme spesifik yang dapat menyebabkan IBD,

namun strain Escherichia coli masih dalam pengamatan (Cholapranee &

Ananthakrishnan, 2016).

Proses inflamasi pada UC terbatas pada lapisan mukosa rektum dan

kolon. Inflamasi terbatas pada mukosa dengan berbagai derajat ulserasi,

perdarahan, edema, dan regenerasi epitel. Selain itu, terjadi krepitasi, abses

kripta, distorsi kripta serta hilangnya sel goblet (Prasetyo, 2015).

Mediator inflamasi telah diidentifikasi dalam IBD dan bukti yang cukup

menunjukkan bahwa mediator ini memainkan peran penting dalam karakteristik

patologis dan klinis gangguan ini. Sitokin yang dilepaskan oleh makrofag sebagai

respon terhadap berbagai rangsangan antigenik, berikatan dengan reseptor yang

berbeda dan menghasilkan efek autokrin, parakrin, dan endokrin. Sitokin

membedakan limfosit menjadi berbagai jenis sel T. Sel T helper tipe 1 (Th-1),

terkait terutama dengan CD, sedangkan sel Th-2 terutama terkait dengan CU.

5
Respons imun mengganggu mukosa usus dan menyebabkan proses inflamasi

kronis (Ramos & Papadakis, 2019).

2.1.4. Etiopatogenesis

Etiopatogenesis UC sampai saat masih belum jelas, namun diduga

penyakit ini disebabkan oleh multifaktor, meliputi genetik, faktor lingkungan,

faktor imunologis dan integritas mukosa. Terdapat 19-41% IBD bersifat familial.

Pada anak dengan riwayat keluarga CD, sering terdiagnosis pada usia kurang

dari 11 tahun. Paparan faktor lingkungan menyebabkan berkembangnya

disbiosis mikroba dengan penurunan short chain fatty acids dan peningkatan

proteobacteria sehingga mekanisme pertahanan usus terhambat. Sel imunitas

pada mukosa usus pasien kolitis memproduksi faktor inflamasi, seperti Tumor

Necrosis Factor-alpha (TNF-α) dan Interferon-gamma (IFN-γ), menginduksi

ekspresi apoptosis sel epitel terkait protein, menurunkan fungsi sel epitel dalam

melawan patogen, dan meningkatkan permeabilitas mukosa usus (McDeermott

et al., 2016).

Gambar 2.1 Etopatogenesis Inflammatory Bowel Disease

Inflamatory Bowel Disease merupakan interaksi antara faktor genetik, lingkungan,
mikrobioma, dan respon imun. Faktor genetik menunjukkan gen NOD2 merupakan
ketertanan gen pada IBD. Faktor lingkungan seperti diit tinggi serat, pajanan susu sapi

6
atau food additive, dan paparan asap rokok. Respon imun melemahkan barrier pada
mukosa usus dan merusak fungsi sel epitel.
Dikutip dari: Stephanie & Iona, 2017

2.1.5. Manifestasi Klinis

Inflammatory bowel disease dapat muncul dengan manifestasi klinis

intraintestianal dan ekstraintestinal. Pada inflammatory bowel disease yang

atipikal terjadi pada 22% anak yang datang dengan kegagalan pertumbuhan,

anemia dan penyakit perinaal. Pada umumnya manifestasi klinis UC berupa

diare, nyeri perut, tenesmus, tinja berdarah dan perdarahan perianal (Tabel 2.1),

atau manifestasi ekstraintestinal pada anak yang sering dijumpai pada UC

seperti artritis sendi besar, lesi kulit pioderma gangrenosum atau eritema

nodusum dan gagal tumbuh (Adamiak et al., 2013; Michael et al., 2015).

Tabel 2.1. Manisfestasi Klinis Inflammatory Bowel Disease pada Anak dan
Remaja

Dikutip dari : Michael et al., 2015

7
 Manifestasi klinis ekstraintestinal yang sering terjadi pada anak-anak dan

remaja dengan IBD, sekitar 25% - 35% pasien (Tabel 2.2). Namun, pada anak

gejala tersebut dapat didahului dengan gejala gastrointestinal selama bertahun-

tahun. Arthritis adalah manifestasi ekstraintestinal yang paling sering terjadi pada

7%-25% anak-anak dengan IBD. Pada 5% anak dengan IBD terjadi nefrolitiasis,

3% terjadi eritema nodosum, dan <1% dengan pioderma granulosum.

Manifestasi ekstraintestinal lainnya termasuk komplikasi okular, komplikasi

hepatobilier seperti sclerosing primer, kolangitis, dan pankreatitis (Diefenbach &

Breuer, 2006; Adamiak et al., 2013).

Tabel 2.2. Manifestasi Klinis Ektraintestinal pada Inflammatory Bowel

Disease
Dermatologic
Erytema nodosum
Pyoderma gangrenosum
Musculoskeletal
Arthritis
Osteopenia
Osteoporosis
Ankylosing spondylitis
Hepatic
Primary sclerosing cholangitis
Autoimmune hepatitis
Ocular
Episcleretis
Uveitis
Iritis
Renal
Nephrolitiasis
Pancreatic
Pancreatitis
Hematologic
Anemia
Venosus thromboembolism

Dikutip dari : Adamiak et al., 2013

2.1.6. Diagnosis

Anamnesis, pemeriksaan fisik dan pemeriksaan fisik merupakan langkah

dalam menentukan diagnosis pasien IBD (Gambar 2.5). Anamnesis didapatkan

8
keluhan diare disertai nyeri abdomen dan berat badan turun yang persisten (>4

minggu) atau berulang (>2 episode dalam 6 bulan), kecurigaan meningkat bila

terdapat riwayat IBD dalam keluarga (Glick & Carvalho, 2011; Long et al., 2011).

Pemeriksaan fisik yang awal adalah pemeriksaan tinggi badan, berat

badan, dan perhitungan persentil masing-masing. Assessment dari kurva

pertumbuhan mempresentasikan adanya acute weight loss atau chronic

flattering. Pemeriksaan abdomen didapatkan nyeri tekan terlokalisir atau dapat

terjadi seluruh lapang perut berdasarkan penyebaran dari penyakit, defense

muskular mengindikasikan perforasi atau abses yang selanjutnya dievaluasi

dengan pemeriksaan radiologi. Pemeriksaan rektal penting untuk mengevaluasi

adanya darah pada tinja, hemorhoid, fisura ani, atau penyakit perianal lainnya

yang sering berhubungan dengan CD (Long et al., 2011; Michael et al., 2015).

Pemeriksaan laboratorium yang umum ditemukan pada anak-anak

dengan IBD adalah anemia, trombositosis, hipoalbumin, dan kadar penanda

inflamasi yang meningkat. Evaluasi laboratorium pada pasien IBD terinci dalam

Tabel 2.3. Hasil evaluasi laboratorium normal tidak menyingkirkan diagnosis IBD

dikarenakan sekitar 10% - 20% anak-anak dengan IBD akan memiliki hasil

laboratorium yang normal. Pemeriksaan feses untuk mengetahuai adanya darah

pada tinja, bakteri patogen (Clostridium difficile), protozoa dan parasit.

Pemeriksaan biomarker yang mempunyai sensitivitas 98% dan spesifitas 68%

menunjukkan inflamasi intestinal berupa peningkatan konsentrasi fecal

calprotectin adalah neutrophil-derived protein. Penanda serologi dan genetik,

tersedia secara komersial, tetapi sejumlah besar anak-anak dengan IBD akan

memiliki hasil tes negatif, yang menghasilkan sensitivitas 65% dan spesifitas

75%. Panel seperti ini lebih bernilai sebagai alat prognostik untuk memprediksi

perjalanan penyakit yang agresif. Penanda biomarker CD64 polimorfonuklear,

inflamasi yang diindukis reseptor Fcγ memiliki sensitivitas dan spesifitas tinggi

untuk CD pada anak-anak dengan IBD (Henderson et al., 2014).

9
Tabel 2.3. Evaluasi Laboratorium pada Inflammatory Bowel Disease

Blood Laboratory Test

Complete blood cell count (CBC) with differential
Inflamatory markers (C-reactive protein level, erytrocyte sedimentation rate)
Liver profile (levels of alanine aminotranferase, aspartate aminotranferase,
alkaline phospahtase, bilirubin, and γ-glutamyl tranferase)
Albumin level
Stool Examination
Salmonella, Shigella, Campylobacter, and Yersinia species, Escherichia coli
O157, and Clostridium difficile
Ova and parasit
Occult blood
Fecal calproctetin or fecal lactofferin

Dikutip dari : Henderson et al., 2014

Standar kriteria untuk diagnosis dan klasifikasi IBD pada anak

menggunakan Esophagogastroduodenoscopy dan ileocolonoscopy dengan

biopsi. Histopatologis sangat penting untuk menentukan derajat keparahan

penyakit dan untuk membedakan antara UC dengan CD. Video capsule

endoscopy dapat digunakan untuk mengevaluasi usus kecil proksimal pada

pasien CD, selanjutnya dikonfirmasi dengan pencitraan konvensional (Malo et

al., 2014).

Pencitraan usus kecil sangat penting untuk menentukan lokasi penyakit

dan mengidentifikasi komplikasi, seperti fistula, abses, dan striktur usus.

Pencitraan dilakukan setelah endoskopi, karena pencitraan tidak sensitive

terhadap penyakit usus kecil dan kolon ringan. Cross-sectional enterography,

yaitu computed tomographic enterography dan magnetic resonance

enterography dapat digunakan untuk menggantikan fluoroskopi usus kecil,

mengevaluasi lumen, dinding usus, dan komplikasi intra-abdominal. Pelvic

magnetic resonance imaging and rectal endoscopic ultrasonography lebih sering

digunakan untuk mengevaluasi abses perianal dan fistula (Malowitz et al., 2016).

10
2.1.7. Tata Laksana

Tujuan pengobatan IBD adalah mengurangi proses inflamasi, mencegah

komplikasi dan mencegah kekambuhan atau perburukan penyakit, memperbaiki

status nutrisi dan kualitas hidup. Tatalaksa IBD terdiri atas farmakoterapi, nutrisi,

pembedahan, dan terapi psikososial (Hegar, 2014).

Kortikosteroid efektif untuk menginduksi remisi klinis CD dan UC pada

anak, tetapi sekitar 50% dari pasien menjadi dependen steroid atau memerlukan

tindakan pembedahan. Kurang dari sepertiga pasien dengan CD dengan

pengobatan kortikosteroid mengalami remisi klinis, didapatkan perbaikan

mukosa. Kortikosteroid tidak dapat digunakan untuk terapi pemeliharaan karena

efek samping penggunaan jangka panjang kortikosteroid (Sandborn et al., 2012).

Terapi exclusive enteral nutrition (EEN), pemberian 100% kebutuhan

kalori dengan formula cair, sama efektifnya dengan terapi kortikosteroid untuk

menginduksi remisi klinis pada anak dengan CD. Durasi terapi EEN biasanya 8

sampai 12 minggu. Exclusive enteral nutrition banyak digunakan sebagai terapi

induksi lini pertama di Eropa dan Amerika Serikat. Keuntungan terapi EEN

dibandingkan kortikosteroid adalah meningkatkan pertumbuhan, menghindari

efek samping kortikosteroid, dan penyembuhan mukosa lebih efektif (Borrelli et

al., 2006). Kerugian terapi EEN adalah diit formula cair yang ketat menggunakan

nasogastric tube setiap malam, peradangan dan gejala muncul kembali dengan

penghentian terapi EEN sehingga EEN sering digunakan dalam kombinasi

dengan terapi medis pemeliharaan (Borrelli et al., 2006; Michael et al., 2015).

Aminosalisilat memberikan efek anti-inflamasi topical pada mukosa usus.

Dapat diberikan secara oral, melepaskan 5-aminosalicylic acid (5-ASA) aktif

dalam ileum dan usus besar, atau secara topical melalui enema atau supositoria.

Tetapi banyak pasien tidak dapat mentolerir efek samping dari sulfa (yaitu: mual,

sakit kepala, demam, dan ruam). Saat ini, dikembangkan obat baru yaitu sulfa-

free 5-ASA (mesalamine, balsalazide disodium, dan osalazine sodium)

11
memberikan konsentrasi tinggi 5-ASA ke mukosa usus dengan efek samping

lebih sedikit. Obat 5-ASA efektif untuk induksi dan pemeliharaan remisi pada

orang dewasa dengan UC ringan sampai sedang, tetapi hanya beberapa uji klinis

dilakukan pada anak-anak. Balsalazide satu-satunya obat 5-ASA yang indikasi

untuk anak, menginduksi respon pada 8 minggu sebesar 45% anak dengan UC

dan remisi sebesar 12%. Efek samping obat 5-ASA yang jarang adalah

eksaserbasi kolitis paradox, nefritis interstitial, pericarditis, dan pneumonitis

(Feagan et al., 2012; Zeisler et al., 2013).

Immunomodulator seperti thiopurine, termasuk azathioprine sodium dan

metabolite mercaptopurine (6-MP) aktif telah digunakan untuk pengobatan IBD

selama lebih dari 30 tahun. Efektif digunakan sebagai terapi pemeliharaan.

Penelitian uji klinis multisenter, randomized melaporkan bahwa pemberian 6-MP

dalam delapan minggu pertama dapat mengurangi paparan kortikosteroid dan

meningkatkan pemeliharaan remisi klinis pada anak dengan CD (Markowitz et

al., 2000), Penelitian observasional mendukung pemberian thiopurine untuk anak

dengan UC refrakter. Efek samping thiopurine, antara lain myelosupresi,

peningkatan kadar transaminase, dan pankreatitis (Hyams et al., 2011).

Methotrexate sodium adalah imunomodulator yang dapat digunakan

untuk mempertahankan remisi klinis pada sepertiga anak dengan CD dan

pemeliharaan remisi pada anak dengan UC (Turner et al., 2007). Efek samping

metotreksat, meliputi hepatotoksisitas, dan penekanan myelosupresi. Sehingga

pasien harus diberi suplemen asam folat setiap hari (Dulai et al., 2011).

Obat anti-TNF dapat diberikan melalui infus (infliximab), injeksi subkutan

(adlimumab, certozumab pegol, dan golimumab). Infliximab, anti-TNF drug

pertama yang diperkenalkan pada tahun 1998, telah di uji coba pada anak

dengan CD dan UC sedang sampai berat. Pada anak dengan CD, 88% respon

terhadap pemberian infliximab dengan 56% remisi dalam 1 tahun. Pada anak

dengan UC, 73% respon dengan 39% remisi dalam 1 tahun. Obat anti-TNF

12
biasanya digunakan pada anak-anak dengan IBD yang sulit disembuhkan

dengan kortikosteroid atau dependen kortikosteroid walaupun telah menjalani

terapi immunomodulator. Kadang-kadang digunakan bersama dengan

imunomodulator. Pada orang dewasa, kombinasi infliximab dan azathioprine

lebih efektif daripada kedua obat tersebut masing masing. Efek samping obat

anti-TNF adalah meningkatkan risiko infeksi, khususnya infeksi jamur, virus, dan

mikobakteri (Hyams et al., 2012).

Obat anti-TNF lebih baik daripada thiopurine karena dapat menginduksi

penyembuhan mukosa usus sempurna (Sands et al., 2004). Inliximab terbukti

meningkatkan pertumbuhan linear pada anak. Oleh karena itu, obat anti-TNF

sebagai terapi lini pertama untuk CD pada anak dengan ulserasi mukosa yang

dalam, fistula perianal, dan/atau kegagalan pertumbuhan yang signifikan. Semua

pasien harus dilakukan skrining infeksi TB sebelum memulai terapi anti-TNF

(Colobel et al., 2010).

Pembedahan adalah pilihan terapi yang penting dalam manajemen

komprehensif UC dan CD pada anak. Kolektomi total dengan anastomosis anal

kantong ileum diindikasikan pada anak dengan UC refrakter terhadap terapi

obat-obatan. Pembedahan diperlukan pada CD dengan komplikasi seperti fistula,

abses intra abdominal, dan striktur usus (Schaefer et al., 2010).

2.1.8. Prognosis

Inflammatory bowel disease ditandai dengan periode eksaserbasi dan

remisi. Sekitar 70% anak dengan UC mengalami remisi dalam 2 tahun. Terjadi

26% kasus kasus derajat berat dilakukan kolektomi dalam 5 tahun setelah

didiagnosis. Pemantauan harus mencakup kepatuhan terhadap terapi jangka

panjang, efek samping obat, kambuh, manifestasi ektraintestinal, dan risiko

kanker. Dalam 8-10 tahun setelah didiagnosis, risiko keganasan kolorektal

meningkat 0,5-1% setiap tahun (Glick & Carvalho, 2011; Hegar, 2014).

13
2.2. Vitamin D

Vitamin D memiliki dalam patogenesis kelainan autoimun pada IBD.

Vitamin D mempunyai fungsi dalam homeostasis kalsium dan metabolisme

tulang dalam perannya mengatur respon imun. Reseptor vitamin D ditemukan

pada berbagai sel imun dan memiliki beragam efek pada sistem kekebalan

tubuh. Vitamin D menurunkan generasi respon Th1 proinflamasi dan

meningktakan kadar sel Th2 anti-inflamasi. Vitamin D meningkatkan toleransi diri

dengan menghambat diferensiasi dan pematangan sel denditrik dan

meningkatkan jumlah dan fungsi sel Treg. Vitamin D juga terlibat dalam

memodulasi kemampuan makrofag untuk membunuh bakteri intraseluler serta

melindungi barrier sel epiter mukosa pada kolitis (Sheng-Long et al., 2015).

Vitamin D receptor (VDR) adalah bagian dari reseptor steroid, yang

memainkan peran penting dalam berbagai respon imun melalui peningkatan

bentuk aktif vitamin D (1,25-(OH)2D). Telah ditemukan bahwa banyak sel imun,

termasuk monosit, makrofag, sel denditrik, dan limfosit T teraktivasi,

mengekpresikan VDR dan enzim metabolisme vitamin D seperti 1α-hidroksilase.

Data Terbaru mengesankan bahwa pensinyalan VDR penting untuk

mempertahankan homeostasis imun usus, dan meningkatkan aktivitas

antibakteri, serta memodulasi aktivitas abnormal mukosa usus dari respon sel T

(Haifa et al., 2013; Mouli & Ananthakrishnan, 2014).

Polimorfisme genetik dalam reseptor vitamin D receptor (VDR)

mempunyai hubungan dengan kerentangan dan keparahan penyakit pada pasien

dengan UC. Pada penelitian eksperimental pada model tikus kolitis yang

mengalami peradangan hebat pada saluran pencernaan dan pemberian bentuk

aktif vitamin D (1,25D3) melemahkan efek defisiensi VDR pada kolitis. Dalam

penelitian pada manusia kadar vitamin D berbanding terbalik dengan keparahan

IBD. pada dua penelitian cross-sectional, defisiensi vitamin D dikaitkan dengan

14
aktifitas penyakit pada UC dan CD. Studi retrospektif menunjukkan hubungan

antara kekurangan vitamin D dan indeks kualitas hidup yang lebih rendah dan

peningkatan aktifitas penyakit pada CD, tetapi tidak pada Pasien dengan UC.

Beberapa penelitian lain pada CD menunjukkan Bahwa status vitamin D yang

lebih tinggi dikaitkan dengan penurunan risiko perkembangan penyakit,

normalisasi kadar vitamin D mengurangi risiko operasi, dan kadar vitamin D

meningkat dan responsif terhadap pengobatan dengan biologik. Sebuah studi

kohort prospektif Pasien dengan CD ringan sampai sedang menunjukkan bahwa

peningkatan kadar vitamin D ketingkat normal dikaitkan dengan penurunan skor

disease activity index (DAI) (Maggie et al., 2014; Mehdi et al., 2015; John et al.,

2016).

2.2.1. Sumber Vitamin D

Vitamin D merupakan hormon sekosteroid yang larut dalam lemak dan

terdiri dari dua bentuk utama yaitu D2 (ergocalciferol) dan D3 (cholecalciferol).

Vitamin D2 dikenal sebagai ergocalciferol, diperoleh dari makanan sumber nabati

dan suplemen oral. Vitamin D3 dikenal sebagai cholecalciferol, terutama

diperoleh dari paparan sinar ultraviolet B (UVB) yang berasal radiasi sinar

matahari serta konsumsi sumber makanan seperti ikan berlemak, makanan yang

telah difortifikasi (susu, jus, margarin, yogurt, sereal, kedelai), dan suplemen oral

(Lee et al., 2013).

2.2.2. Metabolisme Vitamin D3

Vitamin D3 disintesis dari 7-dehydrocholesterol (7-DHC) di dalam kulit

melalui radiasi sinar UV (spectrum 280 – 320 UVB) dari matahari, membentuk

pre-D3 yang diisomerisasi menjadi vitamin D3 dalam proses termosensitif.

Setelah sintesis dikulit, vitamin D dihidroksilasi di hati oleh enzim sitokrom P450

vitamin D 25-hidroksilase menjadi tipe 25-hidroksi vitamin D (25(OH)D). 1α-

hidroksilase mengubah 25(OH)D menjadi bentuk aktif 1,25-dihidroksi vitamin D

15
(1,25(OH)D2) terutama di tubulus ginjal, dan merangsang VDR. Stimulasi dari

vitamin D 1,25-dihidroksi, sel denditrik dan limfosit T menurunkan produksi sitokin

pro-inflamasi dan meningkatkan produksi sitokin anti-inflamasi, IL-10 dan

merubah pertumbuhan TGF- beta (Christakos et al., 2010; Wendy et al., 2017).

Gambar 2.2 Metabolisme Vitamin D

Vitamin D dapat disintesis atau didapatkan dari makanan, dominan disintesis dikulit dari
7-dehydroxycholesterol. Cholecalciferol terikat oleh DBP dan diangkut ke hati. Berbagai
sitokrom Cyp mengubah chalciferol menjadi 25(OH)D3, kemudian diangkut diginjal,
dimana 1α-hydroxylase Cyp27B1 mengubah 25(OH)D3 menjadi 1,25(OH)2D3 (calcitriol)
adalah metabolit vitamin D aktif. Untuk mengontrol konsentrasi calcitriol, terutama
ditentukan oleh keseimbangan antara Cyp27B1 dan Cyp24A1. Dua protein yang penting
untuk fibroblast growth factor 23 (FGF23) dan hormon paratiroid (PTH). hidroksi
25(OH)D3 dan 1,25(OH)2D3. (Red arrows indicate inhibition, and green arrows indicate
induction)
Dikutip dari: Wendy et al., 2017

Berdasarkan rekomendasi Institute of Medicine (IOM), dikatakan

defisiensi vitamin D bila kadar 25(OH)D <20 ng/mL, insufisiensi vitamin D bila

kadar 25(OH)D 21-29 ng/mL, dan sufisiensi vitamin D bila kadar 25(OH)D >30

ng/mL. Asupan vitamin D sekitar 40-100 internasional unit/hari Pada CD,

suplementasi kalsiferol terbukti dapat mengurangi kekambuhan dan mencegah

peningkatan permeabilitas usus lebih lanjut. Kadar serum 25(OH)D diatas 75

16
nmol/L memiliki kadar C-reaktif protein secara signifikan lebih rendah dan

penurunan skor DAI (Wingate et al., 2014; Hlavaty et al., 2015).

Dua langkah utama dalam metabolisme vitamin D, yaitu 25-hydroxylation,

1α-hydroxylation dan 24-hydroxylation yang semuanya terjadi melalui bantuan

cytochrome P450 mixed-function oxidases (CYPs). Enzim ini berada di dalam

retikukum endoplasma (CYP2R1) atau mitokondria (CYP27A1, CYP27B1, dan

CYP24A1). Vitamin D diikat oleh vitamin D binding protein (DBP), lalu

metabolitnya di darah kemudian masuk ke hepar. Proses aktivasi 25-

hydroxylation terjadi di dalam hepar. Proses ini dikatalisis oleh enzim CYP2R1.

Calcidiol (25(OH)D) mengalami aktivasi akhir melalui proses hidroksilasi kedua

menjadi 1,25 (OH)2 vitamin D yang dikatalisis oleh CYP27B1; 1α (OH)ase dan

24,25 (OH)2D3 oleh 24(OH)ase. Enzim CYP27B1 terutama terdapat di ginjal,

namun baru-baru ini juga ditemukan di sel epitel, makrofag, dan keratinosit. 1,25

(OH)2 vitamin D aktif berikatan dengan vitamin D receptor (VDR) dalam sitosol,

diikuti dengan translokasi kompleks reseptor aktif ke inti sel. Kemudian kompleks

VDR dan 1,25 (OH)2 vitamin D membentuk heterodimer dengan retinoid X

receptor alpha (RXR-α). Kompleks ini megikat sekuen DNA spesifik, disebut

sebagai vitamin D responsive elemen (VDRE). Enzim CYP24A1 penting untuk

aktivasi 1,25 (OH)2 vitamin D menjadi vitamin D3 lakton atau calcitroic acid.

Enzim CYP24A1 juga dapat menonaktifkan 25(OH)D sampai 24,25 (OH)2

vitamin D. Waktu paruh 1,25 (OH)2 vitamin D hanya sekitar 4 jam, sedangkan

25(OH)D mempunyai waktu paruh rata-rata adalah sekitar 3 minggu sehingga

lebih stabil dan dapat digunakan sebagai tanda penyimpanan dan status vitamin

D dalam tubuh (Bikle, 2014; Gil et al., 2018).

Regulasi kalsitriol tergantung dari keseimbangan antara aktivitas 1α-

hydroxylase dan 24-hydroxylase. Kedua enzim diatur oleh kadar kalsium serum,

kalsitriol, dan fosfat. Apabila kadar kalsium atau vitamin D serum rendah, hormon

paratiroid (PTH) yang disekresi oleh kelenjar paratiroid akan menstimulasi

17
sintesis 1α-hydroxylase, meningkatkan aktivasi 1,25(OH)2D (Christakos, 2017).

Hormon paratiroid juga menghambat 24-hydroxylase, dan dapat menginduksi

sintesis osteoklas dan osteosit dari fibroblast growth factor (FGF)-23,

menurunkan ekspresi transporter natrium-fosfat ginjal. Fibroblast growth factor

juga dapat mempengaruhi homeostasis vitamin D dengan menekan ekspresi 1α-

hydroxylase dan menginduksi 24-hydroxylase di ginjal sehingga kadar calcitriol

dan kalsium serum menurun (Perwad & Portale, 2011; Gil et al., 2018). Aktivitas

1α-hydroxylase dan 24-hydroxylase dibantu oleh cytochrome P450 mixed-

function oxidases (CYP450). Vitamin D dapat disimpan di jaringan adiposa,

akumulasi ini lebih tinggi pada obesitas dibandingkan dengan berat badan

normal, tetapi vitamin D yang disimpan ini tidak dapat dilepaskan ketika

dibutuhkan (Savastano et al., 2017).

2.2.3. Peran Klasik dan Non-Klasik Vitamin D

2.2.3.1. Peran Klasik Vitamin D

Vitamin D sebagai sistem endokrin adalah komponen penting dalam

interaksi antara ginjal, tulang, hormon paratiroid, dan usus yang hasilnya

menjaga kadar kalsium ekstraseluler selalu dalam batas normal sehingga dapat

berguna dalam proses vital fisiologi dan integritas skeletal. 1,25(OH)2D3

merangsang mekanisme pengambilan dan transpor kalsium secara aktif ditingkat

seluler. Vitamin D pada skeleton mempunyai peranan yang sangat penting untuk

pembangunan dan pemeliharaan mineralisasi skeleton. Pertumbuhan dari tulang

membutuhkan kalsium dan 1,25(OH)2D3 membuat formasi osteoblastik tulang

yang optimal. Selain itu, resorpsi osteoklastik juga sangat membutuhkan

1,25(OH)2D3 dan VDR. Komponen tersebut sangat dibutuhkan sehingga bila

tidak ada satu komponen saja maka proses keseimbangan di skeleton tidak akan

berlangsung dengan baik. Vitamin D pada kelenjar tiroid merupakan suatu sistem

endokrin yang sangat berpotensi sebagai modulator dari fungsi paratiroid,

18
dimana defisiensi vitamin D menyebabkan hiperplasia dari paratiroid yang

berakibat terjadinya peningkatan sintesis dan sekresi PTH (Paratiroid Hormon).

Pemberian 1,25(OH)2D3 akan menghambat sintesis PTH dan pertumbuhan sel

paratiroid. Efek endokrin pada ginjal yang terpenting dari 1,25(OH)2D pada ginjal

adalah kontrol yang ketat dari hemostasisnya sendiri melalui mekanisme supresi

dari 1α-hydroxylase dan menstimulasi 24- hydroxylase dan melalui ekspresi dari

megalin di tubulus proksimal (Miheller et al., 2009; Raman et al., 2011; Bikle,

2014).

2.2.3.2 Peran Non-Klasik Vitamin D

Selain regulasi pada metabolisme tulang, vitamin D mempunyai peran

pada regulasi respon imun. Rendahnya kadar vitamin D di dalam darah ternyata

dihubungkan terhadap komplikasi infeksi yang parah pada penderita gagal ginjal

stadium akhir. Selain itu, rendahnya kadar 25(OH)D juga didapatkan

berhubungan dengan peningkatan risiko infeksi saluran nafas atas, termasuk

influenza, penyakit paru obstruktif kronis dan asma. Penelitian cross sectional

juga didapatkan bahwa penurunan kadar vitamin D ternyata juga didapatkan

pada penderita sepsis yang berat. Keseluruhan hasil tersebut memperkuat teori

bahwa vitamin D berperan penting dalam regulasi sistem imun alamiah,

khususnya dalam meningkatkan pembentukan protein antimikroba dan

meningkatkan kemampuan sel fagosit. Selain memiliki efek langsung dalam

melawan mikroba, monosit dan antigen presenting cell (APC) lainnya, khususnya

sel dendritik atau dendritic cell (DC) merupakan target penting terhadap efek

vitamin D. Antigen presenting cell berperan dalam mengawali aktivasi respon

imun adaptif melalui presentasi antigen kepada sel T maupun sel B. Sel dendritik

juga memiliki peran dalam memodulasi sistem imun adaptif untuk menjadi

imunogenik atau tolerogenik tergantung dari sitokin maupun molekul kostimulator

19
yang diekspresikan oleh sel dendritik (Prietl et al., 2010; (Prietl et al., 2010; Gil et

al., 2018).

Vitamin D terbukti mempunyai kemampuan untuk menginduksi sel

dendritik yang imatur dan tolerogenik. Sel dendritik yang imatur ditandai dengan

penurunan ekspresi dari major histocompatibility complex (MHC) kelas II dan

molekul kostimulator lainnya, seperti cluster of differentiation (CD)40, CD80, dan

CD86. Hal tersebut akan mengakibatkan penurunan presentasi antigen yang

diikuti dengan penurunan sekresi sitokin pro-inflamasi interleukin (IL)-2 dan

peningkatan sekresi sitokin anti-inflamasi IL-10. Hal ini juga ditunjukkan bahwa

sel dendritik imatur merupakan induktor yang kuat dalam terbentuknya sel Treg

yang memiliki peran penting dalam mengkontrol respon imun dan mencegah

terjadinya penyakit autoimun (Penna et al., 2007; Yang et al., 2013).

Vitamin D juga ditemukan memiliki peran dalam memodulasi sistem imun

adaptif. VDR dan enzim yang mengaktivasi vitamin D ternyata juga didapatkan

pada sel T maupun sel B. Ekspresi VDR pada sel-sel tersebut ternyata sangat

rendah pada kondisi istirahat, akan tetapi peningkatan regulasi VDR ternyata

terjadi sangat cepat ketika sel tersebut mengalami aktifasi dan proliferasi (Wei &

Christakos, 2015).

Vitamin D berperan dapat menghambat diferensiasi dan proliferasi,

mempercepat timbulnya apoptosis, dan menurunkan produksi imunoglobulin

pada sel B akan tetapi efek tersebut masih diduga akibat efek secara tidak

langsung dari modulasi vitamin D terhadap sel Th. Efek langsung pemberian

vitamin D terhadap homeostasis sel B, meliputi inhibisi pembentukan sel memori

dan sel plasma, sekaligus mengakibatkan apoptosis dari sel B yang

menghasilkan immunoglobulin (Chen et al., 2007).

Sel lain yang memiliki peran penting dalam sistem imun adaptif adalah sel

T. Sel T tersebut juga merupakan target penting efek imunomodulasi dari vitamin

D. Terdapat tiga mekanisme yang berpotensi sebagai efek vitamin D dalam

20
memodulasi fungsi dari sel T: (1) Efek langsung secara endokrin, melalui vitamin

D sistemik; (2) Efek langsung secara intrakrin, melalui konversi 25(OH)D menjadi

calcitriol di sel limfosit T; (3) Efek langsung secara parakrin, melalui konversi

25(OH)D oleh monosit atau sel dendritik yang disumbangkan kepada sel limfosit

T. Pemberian vitamin D akan mengakibatkan terjadinya perubahan status

imunitas yang proinflamatif menjadi lebih tolerogenik. Calcitriol mampu

menghambat proliferasi, diferensiasi, sekaligus produksi sitokin sel Th. Vitamin D

mampu menurunkan aktifasi dari Th1 dan Th17 baik secara langsung maupun

secara tidak langsung melalui aktivasi sel dendritik yang tolerogenik. Aktivasi sel

dendritik tolerogenik akan mengakibatkan supresi produksi IL-12 (penting untuk

perkembangan Th1) dan supresi produksi IL-23 dan IL-6 (penting untuk

perkembangan dan fungsi Th17). Calcitriol juga menghambat perkembangan

Th1, yang menghasilkan interferon-gamma (IFN-γ) dan IL-2, dan Th17 yang

memproduksi IL-17. Supresi Th17 akan meningkatkan perkembangan Th2, yang

selanjutnya juga akan meningkatkan produksi IL-4, IL-5 dan IL-13, yang

menggeser keseimbangan ke fenotipe sel Th2 (Yang et al., 2013)

Penelitian in vitro menunjukkan bahwa vitamin D menghambat aktifitas

proinflamasi sel CD4+Th1 dan produksi sitokinnya, seperti IL-2, IFN- γ dan tumor

necrosis factor alpha (TNF-α). 1,25(OH)2D mempunyai efek inhibisi pada

proliferasi sel T, ekspresi protein dan mRNA IL-2, IFN- γ, dan TNF-α pada sel T

yang diakibatkan pengikatan heterodimer VDR-RXR pada regio promoter gen

VDRE yang mengkode IL-2 dan IFN- γ. Efek anti inflamasi vitamin D juga

diperkuat oleh respon Th2 melalui peningkatan produksi IL-4, IL-5 dan IL-10

kemudian cenderung mengarahkan sel T dari kondisi Th1 inflamasi ke regulasi

Th2 anti inflamasi. Vitamin D dapat meningkatkan aktifitas sel Treg dan menekan

respon Th17. Vitamin D dibutuhkan tidak hanya dibutuhkan untuk perkembangan

sel NK tetapi juga meningkatkan produksi IL-4 dan IFN-Ϫ oleh sel NK (Hewison,

2010).

21
 Kemampuan 1,25(OH)2D dalam menghambat pertumbuhan dan

merangsang diferensiasi berbagai tipe sel membuka kemungkinan kemampuan

lain vitamin D dalam mencegah kanker, memodulasi sistem imun, dan mengatur

beberapa sistem endokrin, disebutkan bahwa efek vitamin D lebih kuat dalam

meningkatkan imunitas selular daripada imunitas humoral yang merupakan

mekanisme kunci bagaimana vitamin D dapat memberikan efek yang

menguntungkan dalam penyakit autoimun. Regulasi sistem imun melalui vitamin

D dengan metabolit aktifnya 1,25(OH)2D dalam memodulasi respon imun

didasarkan atas (1) Adanya VDR pada makrofag, sel monosit, sel limfosit T dan

B yang teraktivasi (2) Kemampuan makrofag, sel dendritik, sel T dan B teraktivasi

untuk mengekspresikan CYP27B1 (enzim yang memproduksi 1.25(OH)2D) (3)

Kemampuan 1,25(OH)2D3 untuk mengatur proliferasi dan fungsi makrofag, sel

dendritik, serta sel T dan B (Bikle, 2009).

Pustaka terbaru menyatakan bahwa target untuk respon imun adaptif

pada vitamin D adalah untuk apoptosis dan menghambat aktivasi sel T.

Selanjutnya 1,25(OH)2D3 menghambat ekspresi dari sitokin inflamasi monosit,

termasuk IL-1, IL-6, TNF-á, IL-8, dan IL-12. 1,25(OH)2D3 juga memodulasi sel

dendritik mengekspresikan sitokin dan kemokin, dengan menghambat produksi

IL-12 dan IL-23 (dikenal sebagai sitokin yang berperan dalam diferensiasi Th1

dan diferensiasi Th17), dan meningkatkan pelepasan IL-10 dan kemokin CCL22,

suatu kemokin yang berperan dalam perekrutan CCR4 Treg. 1,25-dihidroksi

vitamin D (1,25(OH)D) juga meregulasi peningkatan reseptor ILT3 di sel

dendritik, yang berasosiasi dengan toleransi terhadap induksi dan modulasi dari

produksi chemokine. Kombinasi dari efek sel T tersebut menyebabkan supresi

pada sel T, dengan menekan maturasi sel dendritik dan meningkatkan

ekspresinya pada sitokin khusus seperti IL-10, 1,25(OH)2D dapat meningkatkan

tolerogenesis melalui supresi pada perkembangan sel Th1 dan menginduksi

perkembangan Treg (Ghoreishi et al., 2009; Baeke et al., 2010).

22
 Ekspresi VDR pada sel imun dikontrol oleh sinyal sistem imun. sel T naive

sangat rendah tingkat VDR-nya, reseptor ini berlimpah setelah sel T teraktivasi.

Sebaliknya, diferensiasi monosit, baik menjadi makrofag atau sel dendritik

disertai dengan penurunan ekspresi VDR sehingga membuat sel dendritik kurang

sensitif terhadap 1,25(OH)2D3. Selain itu, aktivasi jalur sinyal VDR juga

menghambat pematangan sel dendritik, sebagaimana dibuktikan oleh adanya

penurunan ekpresi MHC kelas II, molekul kostimulator (CD40, CD80, CD86 dan),

dan menghambat sel dendritik. APC, terutama sel dendritik adalah target utama

dari ligan VDR, baik in vitro dan in vivo (Adorini et al., 2004; Adam dan Hewison,

2008).

Vitamin D dilaporkan memiliki efek menghambat diferensiasi sel monosit

menjadi sel dendritik, kemudian mempertahankan sel dendritik dalam kondisi

imatur. 1,25-dihydroxyvitamin D (1,25(OH)D) menginduksi penurunan ekspresi

dari molekul kostimulator CD40, CD80, CD86, dan IL-12, secara bersama

meningkatkan produksi IL-10, mempromosikan sel dendritik maturasi sel

dendritik penanda permukaan CD83 (Dusso et al., 2005).

1,25(OH)2D3 memainkan peran penting sel dendritik dalam mengikat dan

menangkap antigen asing yang menginisiasi respon imun karena hormon ini

diregulasi oleh ekspresi reseptor manosa, molekul terlibat dalam serapan

antigen, dan ini berkorelasi dengan peningkatan kapasitas endocytotic sel

dendritik imatur (iDC). Sel dendritik merupakan APC yang professional yang

mengawali respon imun innate dan respon imun adaptive, khususnya

mempunyai peranan penting dalam meregulasi aktivasi, proliferasi, dan fungsi

sel T. Sel dendritik memiliki tugas untuk menelan antigen dan mempresentasikan

kembali antigen yang telah disederhanakan ke permukaan sel. Presentasi

antigen yang telah sederhana pada permukaan sel dendritik sangat penting

makna nya karena dengan itu sel-sel limfosit bisa mengenal dan selanjutnya

23
reaksi sistem imun secara bertahap akan dilaksanakan (Ding et al., 2006;

Maddur et al., 2010).

Gambar 2.3 Mekanisme Keterlibatan Vitamin D terhadapp Efek Anti-inflmasi

dalam Memodulasi Sisitem Imun
Efek anti-inflamasi 1,25(OH)2D3 sistem imun. Sel denditrik merupakan target utama untuk
aktivitas imunomodulator vitamin D, secara bersamaan menghambat diferensiasi
prekursor monosit menjadi sel denditrik imatur dan menghambat maturasi sel denditrik.
Vitamin D menekan sitokin sel Th1 dan sel Th17, meng-induksi sel Treg, menginduksi
produksi IL-4 (sel Th2) dan meningkatkan fungsi sel NKT. Diferensiasi dan maturasi sel B
juga terhambat. Th adalah sel T helper CD4 dengan subsetnya (Th1, Th2, Th3, Treg,
Th17) yang berasal dari sel T naive (TH0). Semua sel T yang telah diuji
mengekspresikan VDR, termaksud sel B dan sel NKT. Tanda panah induction
menunjukkan aktivitas sitokin ditingkatkan oleh vitamin D. Sebaliknya, tanda inhibition
menunjukkan aktivitas sitokin dihambat oleh vitamin D. (Titik merah mewakili sitokin
proinflamasi, titik hijau mewakili sitokin anti-inflamasi, panah merah menunjukkkan
penurunan diferensiasi, dan panah hijau menunjukkan peningkatan diferensiasi).
Diambil dari : Wendy et al., 2017

Induksi imunitas adaptive dimulai ketika patogen dicerna oleh sel

dendritik imatur (iDC) pada jaringan yang terinfeksi. Sel dendritik berasal dari

prekursor dalam sumsum tulang bermigrasi menuju jaringan periperal tempat

berhentinya, pada tempat ini sel dendritik berperan untuk menjaga

24
lingkungannya dari serangan patogen. Sel dendritik yang telah memperoleh

antigen akan segera memasuki pembuluh limfa dan masuk lymph node. Pada

lymph node, sel dendritik akan mengenalkan antigen yang dibawa kepada sel T

naive. Sel dendritik matur (mDC) memiliki kemampuan dalam mengaktivasi sel T

naïve dan menginisiasi respons sel T (Abbas and Lichtman, 2006).

2.3. Peran Intestinal Epithelial Cells pada Patogenesis Inflammatory Bowel

Disease

Epitel intestinal dibentuk dari sel epitel kolumner yang terhunbung oleh

tight junctions (Tjs) sebagai barier terhadap patogen. Intestinal Ephitelial Cells

(IEC) seperti sel goblet dan sel paneth adalah bagian penting dari innate immune

system. Sel goblet berfungsi mensekresi berbagai molekul antimikroba seperti

musin. Sekresi musin merupakan lapisan mukus tebal untuk mecegah masuknya

mikroba pada IEC, dan juga berfungsi sebagai pelumas, bersama dengan

gerakan peristaltik usus mendorong isi usus bersama dengan mikroba melewati

usus, dengan demikian melindungi dari patogen invasif. Berkurangnya sekresi

mukus dapat menyebabkan terjadinya inflamasi kronis. Selain itu, sel goblet juga

mensekresi sitokin seperti IL-17, yang berfungsi sebagai imunoregulator. Sel

goblet juga mengekspresikan bestrophin2, yang berfungsi sebagai transport

HCO3- yang berperan dalam pembentukan mukus. Deplesi dari sel globlet

merupakan gambaran patologik yang sering ditemukan pada IBD. Sel penath

memproduksi dan mensekresi defensin dan lisosim untuk mencegah invasi

bakteri kedalam lapisan mukus. Sel Paneth juga berfungsi mengirimkan sinyal

Wnt, TGF, atau Notch ke Intestinal Stem Cells (ISC). Selain itu IEC juga memiliki

reseptor patogen untuk memediasi respon imun bila barier lain gagal

mengeleminsi bakteri (Heather et al., 2015; Zoe et al., 2015; Eva et al., 2017).

Signaling molekul terpenting adalah jalur Wnt, Notch, bone mrphogenic

proteins (BMPs), dan hedgehog (Gambar 2.4). Jalur Wnt diperlukan untuk

penentuan posisi dan maturasi sel penath pada kripta, dan untuk memisahkan

25
sel yang berploriferasi dan berdiferensiasi. Jalur Wnt berperan melalui jalur

kanonik dan non-kanonik. Yang berperan pada jalur kanonik adalah β-catenin,

suatu protein sitoplasma yang stabilitasnya diatur oleh tumor supresor APC.

Kompleks frizzled seven transmembrane molecules dan low-density lipoprotein

receptor related proteins berfungsi sebagai reseptor untuk Wnt. Ketika Wnt tidak

berikatan dengan reseptornya, maka caseine kinase-1 dan GSK3β secara

berurutan memfosforilasi β-catenin menjadi target ubiquitinasi dan degradasi

dalam proteosom. Sebaliknya, bila Wnt berikatan dengan reseptornya, akan

menghambat aktivitas intrinsik kinase pada komples APC dan terjadi akumulasi

β-catenin pada sitoplasma. β-catenin yang tidak terfosforilasi masuk kedalam inti

sel dan berikatan dengan faktor transkripsi T cell factor/ lymphoid enchancing

factor (TCF/LEF) (Tim et al., 2013; Micaela & Vladimir, 2014).

Gambar 2.4 Skema Kompartemen Kripta pada Usus Kecil dan 4 jalur utama
signaling dari Stem Cell
Semua yang berkaitan dengan tipe sel intestinal dan signaling molekul dipresentasikan
dalam grey box. Singkatnya, sel paneth dan sel mesenkimal memproduksi ligan Wnt,
yang secara langsung mengikat reseptor frizzled yang diekspresikan oleh stem sel
intestinal. Kemudian prekursor transit-amplifying cell mensekresi ligan Notch, yang
berikatan dengan reseptor Notch diekspresikan oleh prekursor absoptif. Sinyal Hedgehog
diproduksi oleh sel epitel dan bertindak langsung pada sel mesenkim, untuk
menghasilkan BMP, berikatan dengan reseptornya yang diekspresikan oleh sel epitel
pada jalur Wnt.
Diambil dari : Tim et al., 2013

Jalur Notch adalah jalur yang memiliki peran yang sangat penting dalam

pemeliharaan epitel usus, bekerja sama dengan sinyal Wnt mendorong

26
proliferasi ISC. Secara umum, diaktifkan melalui reseptor Notch yang berikatan

dengan membran, dengan cara kontak sel dengan sel yang berdekatan yang

mengekspresikan ligan Notch (Vanuytsel et al., 2013; Jeon et al., 2013;

Okamoto & Watanabe, 2016).

Jalur Notch berperan penting dalam pemeliharaan, proliferasi, dan

diferensiasi ISC. Mutasi pada komponen jalur Notch, seperti Notch DNA-binding

protein RBP-J atau reseptor Notch, menyebabkan penurunan proliferasi sel epitel

kripta intestin. Aktivasi jalur Notch meningkat pada IEC dari mukosa kolon yang

mengalami inflamasi. Bila aktivasi Notch dihalangi, menyebabkan hilangnya

respon proliferatif pada IEC yang berada di mukosa kolitis, yang menyebabkan

eksaserbasi yang signifikan pada kolitis (Richmond & Breault, 2010; Okamoto &

Watanabe, 2016).

Sinyal Notch didasarkan pada kontak langsung antara sel yang

berdekatan yang mengandung ligan dan reseptor Notch. Ada 4 reseptor Notch

transmembran, Notch-1, Notch-2, Notch-3, dan Notch-4, dan 5 ligan untuk

reseptor, Jagged-1, Jagged-2, Delta-1, Delta-3, dan Delta-4. Langkah awal

kaskade pensinyalan Notch adalah interaksi antara ligan dengan reseptor untuk

memfasilitasi komunikasi antara sel-sel yang berdekatan secara fisik. Interaksi ini

mengaktifkan pembelahan proteolitik reseptor Notch yang dimediasi oleh

presenelin-dependent γ-secretase dan melepaskan Notch intracellular domain

(NICD) dan mengalami translokasi ke dalam nukleus dan berfungsi sebagai

aktivator transkripsi, dan penghambatan aktivitas proteolitik ini menghambat

aktivasi reseptor Notch. Dalam nukleus, NICD membentuk kompleks aktivator

transkripsi dengan CSL (CBF1, Suppressor of hairless, Lag-1). Kompleks ini

kemudian mengaktifkan transkripsi gen target, seperti Hes dan Hey (Hes-related

with YRPW motif). Reseptor Notch 1 dan 2 merupakan reseptor yang

diekspresikan dalam kripta intestin, sedangkan reseptor Notch 3 dan 4 di

27
ekspresikan di mesenkim intestin dan endotelium (Richmond & Breault, 2010;

Vanuytsel et al., 2013; Chen et al., 2013; Dhanesh et al., 2016).

Gambar 2.5 Barier Intestinal Paracelluler pada Intestinal Sehat dan

Intestinal yang mengalami Inflamasi
Barier paraseluler pada jaringan intestinal bagian distal yang sehat ditandai oleh ekpresi
protein TJ tingkat tinggi, yang mengarah pada permeabilitas paraseluler yang rendah.
Pada kondisi peradangan barier TJ terganggu. Chanel pembentuk Claudin diatur dalam
ekpresi (misalnya oleh TNF-a atau IL-13), yang mengarah pada peningkatan
permeabilitas ion dan air (pore pathway). Protein barier TJ terjadi down-regulated dan
dapat bergeser kedalam regio subjunctinal atau kedalam endosom, yang mengganggu
kestabilan barier TJ. Ocludin, selain tricellulin terlibat dalam regulasi permeabilitas
makromolekuler, juga diatur oleh proses inflmasi (misalnya oleh TNF-a atau IFN-gamma),
yang mengarah pada peningkatan permeabilitas paraseluler untuk makromolekul (leak-
pathway).
Diambil dari : Gregory et al., 2016

Pada IBD, perubahan ekpresi menyebabkan perubahan segmen spesifik

pada barier paraseluler dan fungsi channel. Perubahan-perubahan tersebut

umumnya dapat menyebabkan dua efek. Pertama adalah peningkatan

transportasi paraseluler dari zat terlarut dan air, biasanya diperantarai oleh

claudin-2. Sebagai akibatnya, ion dan air berdifusi dari darah ke lumen yang

menyebabkan diare. Kedua adalah peningkatan terhadap permeabilitas

makromolekul termasuk patogen luminal (misalnya, antigen makanan dan bakteri

lipopolisakarida), yang dapat melalui respon imun dan menyebabkan proses

inflmasi (Susanne et al., 2014).

28
2.4. Peran Vitamin D pada Inflammatory Bowel Disease

Vitamin D penting untuk mengatur imunitas mukosa usus, mempengaruhi

integritas epitel usus, fungsi pertahanan imunitas alamiah, dan perkembangan

serta fungsi sel T. Vitamin D mengubah proliferasi sel melalui mekanisme

multiple, secara langsung meningkatkan atau menekan transkripsi gen yang

mengatur pertumbuhan sel, atau secara tidak langsung mempengaruhi siklus sel,

apoptosis, dan/atau diferensiasi, melalui interaksi dengan regulator transkripsi

atau sistem pensinyalan sel yang penting lainnya. Ketika 1,25(OH)2D3 berikatan

dengan VDR membentuk kompleks 1,25(OH)2D3/VDR, akan meningkatkan

ekspresi/aktivitas berbagai enzim brush border, seperti alkali fosfatase dan

maltase, dan mendorong pembentukan mikrovili. Selain itu, 1,25(OH)2D3

meningkatkan ekspresi berbagai komponen adhesi sel seperti occludin, zonula

occludens 1 dan 2, claudin 2 dan 12 pada tight junction, e-cadherin pada

adherent joint dan plektin pada hemidesmosom, yang merupakan struktur yang

penting untuk diferensiasi dan pemeliharaan fenotip epitelial. 1,25-

dihidroksivitamin D3 dapat mengontrol replikasi sel, dengan mengatur gen yang

terlibat dalam siklus sel, mengganggu dan menonaktifkan kompleks siklus

kinase-dependent dalam fase G1, menyebabkan sel tetap berada dalam fase

G1, menurunkan degradasi p27, yang akan menghambat proliferasi dan migrasi

sel dan memodulasi apoptosis (Samuel & Sitrin, 2008; de Almeida & Coimbra,

2017).

29
Gambar 2.6 Peran Vitamin D dalam Menghambat Proliferasi Sel
Aktivasi VDR menekan aktivitas β-catenin, sehingga mengurangi β-catenin dalam inti sel, menekan
faktor transkripsi faktor sel T (TCF), dan menghambat proliferasi sel. Peningkatan level VDR juga
dikaitkan dengan peningkatan claudin2 dan 12, yang mungkin memainkan peran dalam
homeostasis kalsium dan fungsi barier. Protein tight junction lain yang terlibat dalam vitamin D /
VDR termasuk E cadherin, Occludin, dan zonula occludens-1.
Diambil dari : Zang et al., 2013

Perubahan permeabilitas usus, akibat defek pada intercellular junctions,

dapat menjadi predisposisi terjadinya inflamasi. Claudin-2, protein transmembran

pembentuk pori yang membentuk bagian dari tight junctions terlibat dalam

patogenesis IBD. Fosforilasi dan ekspresi claudin-2 dirangsang oleh signal

transducer and activator of transmission (STAT) 1 dan STAT3, yang diinduksi

oleh IFN-γ dan dihambat oleh protein tyrosine phosphatise N2 (PTPN2). Ekspresi

PTPN2 yang diinduksi oleh kompleks 1,25(OH)2D3-VDR, dapat menghambat

pembentukan pori pada barrier epitel dan mengubah permeabilitas usus

(Henderson et al., 2011; Garg et al., 2012; Jeon et al., 2013).

2.5. Dextran Sulphate Sodium

Uji ekperimental IBD dilakukan pada hewan uji tikus, yang menunjukkan

kondisi yang mirip IBD pada manusia. Penelitian menggunakan DSS pada

hewan uji tikus yang digunakan adalah model kolitis yang diinduksi

menggunakan dextran sulphate sodium (DSS) dan trinitrobenzene sulfonic acid

(TNBS). Model kolitis yang diinduksi dengan DSS dianggap sebagai

eksperimental model kolitis yang baik karena mempunyai kesamaan dengan IBD

pada manusia dalam pathogenesis, etiologi, dan respon terhadap terapi. Selain

30
itu DSS murah dan mudah digunakan (Solomon et al., 2010; Perše & Cerar,

2012).

Dekstran adalah komplek polimer glukosa yang disintesis dari sukrosa

oleh bakteri tertentu, paling sering adalah Leuconostoc spp dan Streptococcus

spp. Terbuat dari rantai lurus dan bercabang dengan berat jenis molekul yang

bervariasi, skala antara 5.000 hingga 1.4 juta Dalton (Da). Dekstran sulphate

sodium adalah turunan polianionik dari dekstran, diproduksi oleh esterifikasi

dengan asam klorosufanat. Kandungan sulfur sebesar 17%, setara dengan dua

kelompok sulfat per residu glukosil molekul dekstran. Menjadi bubuk putih pada

suhu ruangan dan bahan tersebut larut dalam air (Solomon, et al., 2010).

Dextran sulphate sodium (DSS) diberikan pada tikus dalam air minum

yang dapat menyebabkan inflamasi pada kolon, ditandai dengan erosi/ulkus,

hilangnya kripte, dan infiltrasi granulosit. Kolitis dapat akut atau kronis,

tergantung dari konsentrasi, durasi, dan frekuensi pemberian DSS. Pada

umumnya, kolitis akut diinduksi menggunakan konsentrasi DSS yang relatif

tinggi, dan diberikan secara terus menerus dalam waktu yang singkat, biasanya

4–14 hari. Beberapa penelitian yang telah dilakukan, misalnya kolitis akut pada

mencit atau BALB/c setelah diinduksi menggunakan DSS 3–10% selama 10 hari

(Okayasu et al., 1990), pada babi diinduksi dengan DSS. 3% selama 4 hari

(Iwanaga et al., 1994), pada tikus Wistar jantan menggunakan DSS 5% selama 6

hari (Breider et al., 1997) dan pada tikus Sprague-Dawley menggunakan DSS

4% selama 14 hari (Mallon et al., 2006). Kolitis kronis dapat diinduksi oleh

pemberian kontinyu DSS konsentrasi rendah misalnya 1% diberikan selama 100

hari pada hamster (Yamada et al., 1992) atau selama 6 bulan pada tikus Wistar

(Chiba, 1993) (Solomon et al., 2010; Perše & Cerar, 2012; Eichele & Kharbanda,

2017).

Pemberian DSS dengan berat molekul 50 kDa, konsentrasi 2 -2.5%

dalam air minum tikus, selama 4 -10 hari dapat meningkatkan sitokin pro-

31
inflamasi seperti TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-1-, dan IL-17. Derajat keparahan kolitis

bisa diatur dengan pemberian DSS. Pemberian DSS 3% selama 7 hari,

kemudian tikus dimatikan pada hari ke-8, menunjukkan adanya kolitis derajat

ringan. Sedangkan pemberian DSS 3% selama 14 hari, hari ke 1 hingga 7, dan

hari ke 22 hingga 28, kemudian dimatikan pada hari ke 29, menunjukkan kolitis

derajat sedang. Pemberian DSS 3% selama 21 hari, hari ke 1 hingga 7, hari ke

22 hingga 28, dan hari ke 43 hingga 49, kemudian dimatikan pada hari ke 50,

menunjukkan kolitis derajat berat (Randhawa et al., 2014).

Mekanisme terjadinya kolitis akibat induksi DSS belum diketahui dengan

pasti, salah satu mekanisme yang mungkin adalah perubahan permeabilitas

usus. Tight junction proteins seperti zona occludens-1 secara langsung

berkurang setelah pemberian DSS pada hari 1, kemudian terjadi peningkatan

permeabilitas pada hari ke 3, menyebabkan terjadinya inflamasi pada kolon.

Mekanisme lain adalah sitotoksisitas DSS secara langsung pada mukosa kolon,

bergantung pada konsentrasi DSS yang diberikan, menyebabkan perubahan

pada sel epitel yang mengganggu interaksinya dengan sel T intraepitel. Sel T

intraepitel diduga berperan dalam perlindungan mukosa (dan penyembuhan)

terhadap berbagai rangsangan termasuk DSS. Meskipun mekanisme yang tepat

dari kolitis di induksi DSS tidak diketahui, tetapi ditemukan hilangnya kripte dan

peningkatan permeabilitas sebelum inflamasi menunjukkan bahwa kerusakan

awal paling mungkin terjadi pada sel epitel, yang kemudian berkembang menjadi

inflamasi (Solomon et al., 2010; Eichele & Kharbanda, 2017).

Manifestasi kolitis yang diinduksi DSS, meliputi diare, darah samar

dalam tinja, penurunan berat badan, nafsu makan menurun, aktivitas menurun,

piloereksi bulu, anemia dan akhirnya kematian. Onset dan keparahan dari gejala

klinis tersebut bervariasi dan tergantung dari spesies hewan, konsentrasi DSS

dan durasi pemberian. Pada kolitis akut, diare dan darah samar dalam tinja

biasanya merupakan gejala paling awal dan dapat terjadi pada hari 2 setelah

32
pemberian DSS, inflamasi bisa terjadi dalam 7-10 hari tetapi gejala klinis

cenderung membaik jika pemberian DSS dihentikan Untuk mengevaluasi tingkat

keparahan kolitis, dapat digunakan skor disease activity index (DAI). Skor DAI

dihitung sebagai jumlah dari skor penurunan berat badan, skor konsistensi feses

dan skor darah pada feses (Solomon et al., 2010; Park et al., 2015; Eichele &

Kharbanda, 2017).

Tabel 2.4 Skor DAI

Skor Penurunan berat badan Konsistensi feses Darah pada feses
0 Tidak ada Normal Tidak ada
1 0-10
2 11-15 Lunak
3 16-20
4 >20 Cair Ada
DAI : (skor penurunan berat badan) + (skor konsistensi feses) + (skor darah pada feses)
Dikutip dari Park et al., 2015

Inflamasi biasanya terbatas pada usus besar, didapatkan gambaran

makroskopis, yaitu edema kolon disertai perdarahan dan ulserasi. Secara

histologis, inflamasi bersifat superfisial, terutama mengenai mukosa tetapi dapat

meluas ke submukosa dan mukosa muskularis. Karakteristik dengan adanya

ulkus superfisial, edema mukosa, hilangnya sel goblet, distorsi kripte dan abses,

adanya infiltrasi sel inflamasi, yaitu neutrofil, makrofag, sel plasma, dan beberapa

limfosit kedalam mukosa dan submukosa. Saat awal, sekitar hari ke 2 atau 3

setelah pemberian DSS, ditemukan gambaran histologis berupa hilangnya kripte

diikuti oleh pemendekan kripte. Gambaran histologis kolitis kronis yang diinduksi

DSS bervariasi, ditandai dengan adanya erosi, regenerasi epitel, fibrosis

mukosa, folikel limfoid yang menonjol, displasia, dan dapat juga terjadi

adenokarsinoma. Adenokarsinoma dapat ditingkatkan dengan pemberian DSS

bersama dengan karsinogen kolon yang dikenal seperti azoksimetana. Sebagian

besar intestinal tidak terpengaruh oleh DSS meskipun mungkin didapatkan

adanya perubahan morfologis kecil yang tidak signifikan pada ileum, seperti

33
peningkatan proliferasi kripte, ketinggian vili dan aktivitas brush border biasanya

dipertahankan. Dextran sulphate sodium resisten terhadap degradasi oleh

mikroflora usus atau efek kondisi pH yang berbeda (4,0-7,5) dan inkubasi

anaerob (Solomon et al., 2010; Perše & Cerar, 2012).

Gambaran histologi kolon dinilai menggunakan Skor MCHI, terdiri dari 8

komponen yaitu infiltrat inflamasi, hilangnya sel goblet, hiperplasia kripte,

densitas kripte, ketebalan otot, infiltrasi submukosa, ulserasi dan abses kripte.

Nilai derajat keparahan gambaran histologi kolon mulai dari 0 sampai 24,

penjumlahan dari 8 komponen/skor tersebut (Koelink et al., 2018).

Tabel 2.5 Skor MCHI

Gambaran Skor

Histologi 0 1 2 3

Peningkatan Infiltrasi pada

Infiltrat inflamasi Tidak ada Transmural
sel inflamasi Submukosa
Kehilangan
Tidak ada < 10% 10 – 50% > 50%
sel goblet
Sedikit Kripta Kripta
Hiperplasia Tidak ada peningkatan pada memanjang memanjang >
kripta panjang kripta 2-3x 3x
Menurun Menurun >
Densitas kripta Normal Menurun < 10% 10-50% 50%
Ketebalan otot Tidak ada Sedikit Sangat tebal Berlebihan
Infiltrasi
Tidak ada Individual cell Infiltrat Large infiltrate
submukosa
Ulserasi Tidak ada Ada
Abses kripta Tidak ada Ada
Dikutip dari Koelink et al., 2018

34
2.6 Kerangka Konsep

Keterangan :

Mempengaruhi

Menghambat

Pada IBD terjadi proses patogenesis yang dipengaruhi oleh faktor

genetika, faktor lingkungan, respons imun dan faktor mikroba usus. Faktor

lingkungan yang dianggap sebagai faktor risiko IBD adalah merokok, obat-

obatan, geografi, stres sosial dan psikologis. Mikroba usus berperan penting

dalam kekebalan bawaan dan adaptif, dengan kolonisasi mikroba usus penting

untuk pengembangan sistem kekebalan tubuh. Peningkatan kejadian IBD salah

satunya adalah efek buruk dari gaya hidup modern pada komposisi dan fungsi

35
mikrobiota usus, termasuk diet lemak jenuh tinggi, tinggi gula dan penggunaan

antibiotik (Bevivino & Monteleone, 2018; Fletcher et al., 2019).

Respons imun bawaan merupakan garis pertahanan pertama melawan

patogen. Respon imun bawaan dimediasi oleh berbagai macam tipe sel yang

berbeda termasuk sel epitel, neutrofil, sel dendritik, monosit, makrofag, dan sel

natural killer. Bentuk kekebalan ini diawali oleh pengenalan antigen mikroba,

yang dimediasi oleh TLR pada permukaan sel dan NOD2 di sitoplasma. Gen

NOD2 mengkode reseptor intraseluler untuk mengenali muramyl dipeptide

(MDP), yang terdapat pada peptidoglikan dari bakteri gram positif dan negatif.

Stimulasi MDP menginduksi autofagi yang mengontrol replikasi bakteri dan

presentasi antigen, dan memodulasi respon imun bawaan dan adaptif. Pada IBD

perilaku sel yang memediasi imunitas bawaan dan ekspresi serta fungsi TLR dan

NOD diubah secara signifikan. Mutasi pada NOD2 menyebabkan pengurangan

aktivasi NF-κB dan mengakibatkan berkurangnya produksi agen antibakteri dan

invasi mikroba patogen. Hilangnya fungsi NOD2 dapat mengakibatkan

kurangnya penghambatan stimulasi TLR2, yang mengarah pada aktivasi jalur

inflamasi dan respon Th1 yang berlebihan. Sel Th1 yang diinduksi oleh IL-12,

menghasilkan IFN-γ, IL-2 dan IL-6, sedangkan sel Th2 melepaskan IL-4, IL-5,

IL-9, IL-13 dan TNF-α. Sel Th17 diinduksi oleh IL-6 dan TGF- β menghasilkan

IL-17A, IL-17F, IL-21 dan IL-22 (Zhang & Li, 2014).

Proses proliferasi ini dilakukan oleh sel punca yang terletak pada area

kripta. Jalur Wnt diperlukan untuk penentuan posisi dan maturasi sel paneth

pada kripta, dan untuk memisahkan sel yang berproliferasi dan berdiferensiasi.

Jalur Notch berperan penting dalam pemeliharaan, proliferasi, dan diferensiasi

sel punca. Aktivasi jalur Notch meningkat pada IEC dari mukosa kolon yang

mengalami inflamasi (Richmond & Breault, 2010; Okamoto & Watanabe, 2016).

Diakui bahwa ketersediaan vitamin D penting dalam mengatur imunitas

mukosa usus, dengan penelitian yang menunjukkan bahwa vitamin D dapat

36
mempengaruhi integritas epitel usus, fungsi barier imunitas bawaan, dan

perkembangan dan fungsi sel T. Vitamin D bekerja melalui beberapa mekanisme

yaitu (1) induksi protein antimikroba seperti angiogenin, katelisidin, defensin atau

NOD2 yang akan menjaga homeostasis mikroba usus, (2) aktivasi sel T ke

bagian peradangan, (3) penekanan Th17 dan Th1 dan induksi Treg dan Th2, (4)

peningkatan ekspresi epithelial membrane junction proteins (Fletcher, et al.,

2019).


37
 BAB 3

KERANGKA KONSEP DAN HIPOTESIS PENELITIAN

3.1. Kerangka Konsep

Keterangan :

Mempengaruhi

Menghambat

Variabel yang diteliti

3.2. Keterangan Kerangka Konsep

Penelitian ini menggunakan hewan coba mencit BALB/c yang mengalami

kolitis yang diinduksi dengan menggunakan DSS 5% dan kemudian dilakukan

pemeriksaan histopatologis untuk mengetahui gambaran kerusakan mukosa

kolon. Pemberian DSS 5% menyebabkan peningkatan permeabilitas pada sel

epitel usus, sehingga terjadi hilangnya zonula occludens-1 dan peningkatan

38
sitokin pro inflamasi seperti TNF-α, IL-1β,IFN-γ, IL-10, dan IL-12. Gambaran

histologis yang ditemukan berupa ulkus superfisial, edema mukosa, kehilangan

sel goblet, distorsi kripta dan abses, adanya infiltrasi sel inflamasi yaitu neutrofil,

makrofag, sel plasma dan beberapa limfosit kedalam mukosa dan submukosa.

Vitamin D berperan dalam mengatur fungsi barier sel epitel usus,

homeostasis mikroba usus dan mengatur respon imun bawaan dan adaptif.

Vitamin D mempertahankan integritas barier sel epitel usus dengan mengatur

ekspresi epithelial membrane junction proteins. Selain itu vitamin D juga

menginduksi protein antimikroba sehingga mempertahankan homeostasis

mikroba usus. Vitamin D menghambat proliferasi dan diferensiasi sel CD4 untuk

menjadi sel Th1 dan Th17 dan meningkatkan produksi sel Th2 dan Treg.

Apabila terjadi kerusakan pada mukosa intestinal, akan diikuti oleh

proliferasi sel epitel kripta intestin, migrasi sel-sel baru dari kripta ke vilus, dan

diferensiasi sel-sel vili selanjutnya untuk membangun kembali struktur epitel yang

tepat Aktivasi jalur Notch meningkat pada IEC dari mukosa kolon yang

mengalami inflamasi. Aktivasi jalur Notch menginduksi protein seperti Hes-1,

yang bekerja pada gen target untuk mengatur proliferasi dan diferensiasi sel.

Berdasarkan mekanisme tersebut, diharapkan pemberian vitamin D3

dapat memperbaiki kerusakan mukosa kolon, menurunkan produksi sitokin-

sitokin proinflamasi, meningkatkan regulasi sitokin anti inflamasi, sehingga

respon inflamasi yang berlebihan dan manifestasi dari kolitis dapat dihentikan.

3.3. Hipotesis Penelitian

1. Hipotesis 1 (H1)

Pemberian vitamin D3 menurunkan skor MCHI pada mencit model kolitis.

2. Hipotesis 2 (H2)

Pemberian vitamin D3 menurunkan skor DAI pada mencit model kolitis.

39
 BAB 4

METODE PENELITIAN

Penelitian dilakukan dengan metode post test only experimental group

design dengan menggunakan hewan coba mencit. Secara random / randomized,

mencit akan dibagi menjadi 5 kelompok, yaitu kelompok 1 merupakan kelompok

mencit yang tidak diberi perlakuan/kontrol; kelompok 2 merupakan kelompok

mencit yang diberi DSS 5% pada hari ke 1 sampai hari ke 7, selanjunya diamati

sampai dengan hari ke 15; kelompok 3 merupakan kelompok mencit yang diberi

DSS 5% pada hari ke 1 sampai hari ke 7 dan diberi vitamin D3 dosis 0,2 mcg/25

gram pada hari ke 8 sampai hari ke 14; kelompok 4 merupakan kelompok mencit

yang diberi DSS 5% pada hari ke 1 sampai hari ke 7 dan diberi vitamin D3 dosis

0,4 mcg/25 gram pada hari ke 8 sampai hari ke 14; kelompok 5 merupakan

kelompok mencit yang diberi DSS 5% pada hari ke 1 sampai hari ke 7 dan diberi

vitamin D3 dosis 0,6 mcg/25 gram pada hari ke 8 sampai hari ke 14; diamati pada

hari ke 8 sampai dengan hari ke 14. Selanjutnya, pada hari ke 15 dilakukan

euthanasia dan pengambilan kolon.

Gambar 4.1. Pengelompokan Subjek Penelitian

40
Keterangan :
: Pemberian vitamin D3
: Pemberian Dekstran 5%
R : Randomisasi
K1 : Kelompok mencit yang tidak diberikan perlakuan, kemudian dilakukan
pengambilan kolon pada hari ke-15.
K2 : Kelompok mencit yang diberikan DSS 5% pada hari 1 sampai hari ke-7,
Kemudian dilakukan pengambilan kolon pada hari ke-15
K3 : Kelompok mencit yang diberikan DSS 5% pada hari 1 sampai hari ke-7, dan
diberikan vitamin D3 0,2 mcg/25 gram pada hari ke-8 sampai hari ke-14.
Kemudian dilakukan pengambilan kolon pada hari ke-15.
K4 : Kelompok mencit yang diberikan DSS 5% pada hari 1 sampai hari ke-7, dan
diberikan vitamin D3 0,4 mcg/25 gram pada hari ke-8 sampai hari ke-14.
Kemudian dilakukan pengambilan kolon pada hari ke-15.
K5 : Kelompok mencit yang diberikan DSS 5% pada hari 1 sampai hari ke-7, dan
diberikan vitamin D3 0,6 mcg/25 gram pada hari ke-8 sampai hari ke-14.
Kemudian dilakukan pengambilan kolon pada hari ke-15.

4.1. Waktu dan Tempat Penelitian

4.1.1. Waktu Penelitian

Penelitian dilakukan bulan Januari - Februari 2020. Fase adaptasi

dilakukan selama 1 minggu, sedangkan fase perlakuan dan pengamatan gejala

selama 14 hari.

4.1.2. Tempat Penelitian

Pemeliharaan hewan coba dilakukan pada Laboratorium Farmakologi

Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya (FKUB), pemrosesan jaringan di

Departemen/Staf Medis Fungsional (SMF) Patalogi Anatomi FKUB Rumah Sakit

Saiful Anwar (RSSA), pemeriksaan imunofluoresen di Laboratorium Biokimia-

Biomolekuler FKUB dan pembacaan mikroskop elektron dilakukan di Unit

Mikroskop Elektron FKUB atau di Laboratorium Sentral Ilmu Hayati Fakultas

Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (MIPA) Universitas Brawijaya Malang.

41
4.2. Persetujuan Penelitian

Penelitian ini telah mendapatkan persetujuan dari Panitian Etik Penelitian

Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya Malang.

4.3. Subjek Penelitian

4.3.1. Sampel Penelitian

Sampel penelitian menggunakan mencit BALB/c, berjenis kelamin jantan,

berumur 8-10 minggu dengan berat badan 20-25 gram yang dibagi menjadi

empat kelompok secara random. Unit analisis yang diperiksa dalam penelitian ini

adalah kolon mencit BALB/c.

4.3.2. Kriteria Inklusi

Subjek yang digunakan berupa mencit BALB/c dengan kriteria sebagai

berikut :

1. Berusia 8-10 minggu

2. Jenis kelamin jantan

3. Berat badan 20-25 gram

4. Kondisi sehat, aktif, dan tidak ada kelainan anatomis

4.3.3. Kriteria Drop Out

Sampel penelitian dieksklusi dari penelitian bila :

1. Dalam pengamatan subjek penelitian mati.

2. Terjadi kerusakan pada organ atau jaringan pada saat pengambilan

sampel untuk pemeriksaan imunofluoresen.

4.3.4. Perhitungan Besar Sampel

Besar sampel dihitung berdasarkan rumus Federer berikut:

(t-1) (r-1) > 15

keterangan :
t = jumlah kelompok perlakuan

42
 r = jumlah sampel perkelompok perlakuan
sehingga ;
(3-1) (r-1) > 15
(r-1) > 15/2
r > 7,5

Jumlah mencit (Mus musculus strain BALB/c) minimal yang dibutuhkan

untuk tiap kelompok adalah minimal 5 (lima) ekor. Menghindari kemungkinan

hewan coba mati, (f) = 10% maka jumlah replikasi dikalikan 1/1-f sehingga: 1/(1-

0,1) x 5 = 5,55 = 6, sehingga jumlah sampel pada penelitian ini adalah 6 ekor per

kelompok dan besar sampel keseluruhan 30 ekor.

4.3.5. Teknik Randomisasi

Pengelompokan sampel kedalam kelompok-kelompok uji dilakukan

dengan randomisasi sederhana menggunakan undian. Tiap kelompok dibedakan

dengan kode warna dan tiap sampel mendapatkan kode penomoran.

4.4. Variabel Penelitian

4.4.1. Variabel Bebas

Pemberian Vitamin D3

4.4.2. Variabel Tergantung

1. Perbaikan mukosa usus yang dibuktikan dengan skor MCHI

2. Perbaikan mukosa usus yang dibuktikan dengan skor DAI

4.5. Definisi Operasional

4.5.1. Mencit

Mencit yang digunakan merupakan mencit BALB/c, berjenis kelamin

jantan yang berumur 8-10 minggu dengan berat badan per ekor antara 20-25

gram. Mencit dikatakan menderita kolitis dilihat dari skor DAI selama diberikan

43
perlakuan (tabel 2.4) dan dari skor MCHI menggunakan histologi jaringan kolon

(tabel 2.5).

4.5.2. Vitamin D3

Vitamin D3 (calcitriol) merupakan bentuk aktif dari vitamin D. Dosis yang

digunakan pada penelitian ini sebesar 0.2 mcg/25 gram, 0,4 mcg/25 gram, 0,6

mcg/25 gram diberikan secara per sonde setiap hari selama 7 hari.

4.5.3. Dextran Sodium Sulfat 5%

Dextran sodium sulfat yang digunakan dibeli dari toko bahan kimia Abcam

dengan berat molekul 40.000 Da. Larutan DSS 5% dibuat dengan menggunakan

garam DSS sebesar 5 gram dilarutkan dengan 1000 ml aquades.

4.5.4. Kerusakan Mukosa Kolon

Kerusakan mukosa kolon ditentukan dengan rusaknya struktur mukosa

kolon setelah pemberian DSS 5% yang dibuktikan dengan pemeriksaan

mikroskop cahaya, menggunakan skoring MCHI (tabel 2.5).

4.5.5. Perbaikan Mukosa Kolon

Perbaikan mukosa usus ditentukan dengan :

1. Pemeriksaan mikroskop cahaya dimana struktur mukosa kolon

kembali baik

2. Variabel molekuler yang menunjang proses perbaikan mukosa

kolon

4.6. Metode Pemeriksaan

4.6.1. Prosedur Eksperimen dan Pengamatan

1. Hewan coba didapatkan dari institusi penyedia yang memiliki kualifikasi

standard reputasi yang terpercaya (Institut Pertanian Bogor), tidak

berpenyakit atau berpotensi menularkan penyakit, serta dijamin belum

44
 pernah dipakai dalam penelitian terdahulu sehingga tidak mempengaruhi

hasil penelitian saat ini.

2. Sebelum digunakan dalam subjek penelitian, hewan coba (mencit)

dilakukan adaptasi terhadap lingkungan barunya, di kandang unit hewan

coba laboratorium farmakologi-FKUB selama 1 minggu, menyesuaikan

dengan suhu, kelembaban, cahaya dan kondisi kandang lainnya.

3. Setiap kandang (berukuran 40 cm x 50 cm x 15 cm) berisi 1 ekor mencit

jantan yang telah diberi tanda sesuai kelompok perlakuannya.

4. Setiap mencit mendapatkan makanannya sesuai standar untuk mencit

dengan komposisi protein 16-18%, lemak 5-12% dan karbohidrat 60-70%

ad libitium.

5. Air minum diberikan secara tetes libitium untuk menghindari kontaminasi

dengan kotoran. Air minum yang digunakan adalah air mineral.

6. Kelompok K1 tidak diberi perlakuan, kelompok K2 diberi DSS 5% dari hari 1

sampai hari ke-7, kelompok K3 diberi DSS 5% pada hari 1 sampai dengan

hari ke-7, serta vitamin D3 0,2 mcg/25 gram per sonde dihari ke-8 sampai

hari ke-14, kelompok K4 diberi DSS 5% pada hari 1 sampai dengan hari

ke-7, serta vitamin D3 0,4 mcg/25 gram per sonde dihari ke-8 sampai hari

ke-14, dan kelompok K5 diberi DSS 5% pada hari 1 sampai dengan hari

ke-7, serta vitamin D3 0,6 mcg/25 gram per sonde dihari ke-8 sampai hari

ke-14.

7. Pemberian vitamin D3 pada masing-masing kelompok perlakuan sebesar

0,2 mcg/25 gram, 0,4 mcg/25 gram, 0,6 mcg/25 gram diberikan secara per

sonde setiap hari selama 7 hari.

8. Setelah pengamatan dan perlakuan, semua subjek dikorbankan pada hari

ke 15. Subjek dikorbankan / dieutanasia dengan diinjeksi ketamin

intravena. Cara ini dipilih agar tidak menimbulkan gejala yang tidak

45
 menyenangkan, aman untuk peneliti, irreversible, dan tidak menimbulkan

perubahan kimiawi dan histopatologi pada jaringan.

9. Hewan coba dilakukan nekropsi dan pengambilan jaringan kolon yang

dibutuhkan untuk penelitian pada hari ke 15.

10. Sisa jaringan coba dikubur sesuai dengan prosedur yang berlaku.

11. Jaringan kolon dibersihkan, dilakukan proses pembuatan preparat histologi

dan dilakukan pemeriksaan histopatologi dengan pengecatan Hematoxylin-

Eosin untuk mengetahui perbaikan mukosa usus.

4.7. Alur Penelitian

Sebanyak 30 ekor mencit yang memenuhi kualifikasi sebagai subjek

penelitian, akan diadaptasi dilingkungan baru (kandang di Laboratorium FKUB)

selama 1 minggu. Adapun mencit, sarana penelitian (kandang, makanan, air

minum), bahan yang akan diujikan (vitamin D3, DSS 5%) dan prosedur penelitian

yang akan diterapkan telah disetujui oleh komite etik FKUB.

Mencit dibagi menjadi 5 kelompok, yaitu : (1) kelompok yang tidak diberi

perlakuan, yang dikorbankan dan dilakukan pengambilan kolon pada hari ke-15;

(2) kelompok yang diberi DSS 5% pada hari 1 sampai hari ke-7, yang

dikorbankan dan dilakukan pengambilan kolon pada hari ke-15 ; (3) kelompok

yang diberi DSS 5% pada hari 1 sampai hari ke-7 dan diberi vitamin D3 0,2 mcg/

25 gram pada hari ke-8 sampai hari ke-14, kemudian dikorbankan dan dilakukan

pengambilan kolon pada hari ke-15; (4) kelompok yang diberi DSS 5% pada hari

1 sampai hari ke-7 dan diberi vitamin D3 0,4 mcg/25 gram pada hari ke-8 sampai

hari ke-14, kemudian dikorbankan dan dilakukan pengambilan kolon pada hari

ke-15; (5) kelompok yang diberi DSS 5% pada hari 1 sampai hari ke-7 dan diberi

vitamin D3 0,6 mcg/25 gram pada hari ke-8 sampai hari ke-14, kemudian

dikorbankan dan dilakukan pengambilan kolon pada hari ke-15 dengan

rancangan alur sebagai berikut :

46
 Perawatan rutin meliputi pemberian makanan dilakukan setiap hari,

pembersihan kandang dan penggantian sekam (sebagai alas kandang) dilakukan

seminggu sekali untuk menjaga kebersihan dan kenyamanan mencit. Pencatatan

harian dilakukan dengan melihat perilaku mencit, apakah terlihat sakit, tidak aktif

bergerak, didapatkan luka-luka dan juga dilakukan pemeriksaan feses. Setiap

hari dilakukan penimbangan ulang berat badan mencit.

Pada hari ke-15 mencit pada masing-masing kelompok dikorbankan dan

dilakukan nekropsi dengan mengambil jaringan kolon. Jaringan kolon dibersihkan

dan sementara disimpan dalam larutan buffer formalin 10% sebelum dilakukan

penyimpanan dan pemrosesan jaringan. Pada pemeriksaan imunofluoresens,

dilakukan pembuatan preparat histologi dan dilakukan pemeriksaan histopatologi

dengan pengecatan Hematoxylin-Eosin untuk mengetahui perbaikan mukosa

usus.

4.8. Analisis Statistik

Hasil penelitian ini akan dilakukan analisis statistik dengan menggunakan

beberapa uji statistik, yaitu:

47
 1. Uji homogenisitas : untuk meyakinkan bahwa sampel berasal dari

populasi yang berat dan umurnya homogen, dilakukan dengan uji

homogenitas dengan Anova.

2. Uji Normalitas : dalam penelitian ini hasil analisis data pada uji

normalitas dilakukan menggunakan uji Saphiro-Wilk. Adapun kriteria

keputusan, yaitu bila nilai Sig atau p-value lebih besar dari α = 0,05, maka

data terdistribusi normal dan sebaliknya bila nilai Sig atau p-value lebih

kecil dari α = 0,05 maka data tidak terdistribusi normal.

3. Uji perbandingan : apabila data homogen dan terdistribusi normal,

proses pengujian hipotesis beda rerata dilakukan dengan one way Anova

untuk membandingkan variabel respon antar kelompok perlakuan

dibandingkan dengan kontrol. Apabila data tidak homogen dan tidak

terdistribusi secara normal, proses pengujian hipotesis beda rerata

dilakukan dengan Kruskal Wallis.

4. Uji post hoc (uji Least Significant Difference) : Uji ini bertujuan untuk

mengetahui kelompok mana yang berbeda secara signifikan dari hasil tes

Anova. Uji post hoc yang digunakan adalah uji LSD dengan tingkat

signifikansi 95% (p≤0,05).

5. Uji Korelasi : untuk menganalisis adanya hubungan antar variabel

pengamatan digunakan Pearson Corellation Test.

4.9. Penyajian Data

Data hasil penelitian disajikan dalam bentuk:

a. Tabulasi

b. Grafik

c. Teks atau tulisan yang menjelaskan tabulasi dan grafik

48
 DAFTAR PUSTAKA
Abramson O, Durant M, Mow W, Allen F, Pratima K, Anthony W, Vanessa T, Erin
M.R.N., Liyan L, James D.L., James E.A., Nicole F, Susan H, Fernando
S.V., Geraldine S.P., Robert C, and Lisa J.H. 2010. Incidence, prevalence,
and time trends of pediatric inflammatory bowel disease in Northern
California, 1996 to 2006. Journal Pediatric;157(1):233-239.

Adamiak T, Walkiewicz J.D., Fish D, Christopher B, Jeanne T, Khalid K, William F,

Roger P, Janice H, Michael Y. 2013. Incidence, clinical characteristics, and
natural history of pediatric IBD in Wisconsin: a population-based
epidemiological study. Inflamm Bowel Disease;19(6):1218-1223.

Borrelli O, Cordischi L, Cirulli M, Massimiliano P, Valeria L, Stefani U, Paolo M.R.,

and Salvatore C. 2006. .Polymeric diet alone versus corticosteroids in the
treatment of active pediatric Crohn’s disease: a randomized controlled
open-label trial. Clin Gastroenterol Hepatol;4(6):744-753.

Cholapranee A, Ananthakrishnan A.N. 2016. Environmental Hygiene and Risk of

Inflammatory Bowel Diseases: A Systematic Review and Meta-analysis.
Inflammamatory Bowel Disease;22:2191-9.

Colombel J.F., Sandborn W.J., Reinisch W, and Gerassimos J.M. 2010. SONIC
Study Group. Infliximab, azathioprine, or combination therapy for Crohn’s
disease. N Engl J Med;362(15):1383-1395.

Del Pinto R., Pietropaoli D., Chandar A.K., Claudio F., and Fabio C. 2015.
Association between inflammatory bowel disease and vitamin D deficiency:
a systematic review and metaanalysis. Inflammatory Bowel Disease;
21:2708-2717.

Dulai P.S., Thompson K.D., Blunt H.B., Dubinsky M.C., and Siegel C.A. 2014.
Risks of serious infection or lymphoma with anti–tumor necrosis factor
therapy for pediatric inflammatory bowel disease: a systematic review. Clin
Gastroenterol Hepatol;12(9):1443-1451.

Edel McDermott E, Ryan EJ, Tosetto M, David G, Joe B, Desine K, Kathryn B,

Eimear C, Gillian S, and Kevi M. 2016. DNA Methylation Profiling in
Inflammatory Bowel Disease Provides New Insights into Disease
Pathogenesis. J Crohns Colitis;10:77-86.

Eva M, Susanne M.K., Britta S, Markus F.N., and Christoph B. 2017. The
Epithelial Barrier and its Relationship With Mucosal Immunity in
Inflammatory Bowel Disease Celluler Moleculer Gastroenterology &
Hepatology;4:33–46

Feagan B.G., Macdonald J.K. 2012. Oral 5-aminosalicylic acid for induction of
remission in ulcerative colitis. Cochrane Database Syst Rev.;10:CD000543.

Glick SR & Carvalho RS. 2011. Inflammatory Bowel Disease. Pediatri Revision.,
32(1), 14-24.

Gregory P. Donaldson, S. Melanie Lee & Sarkis K. Mazmanian. 2016. Gut

biogeography of the bacterial microbiota; 14:20–32.

49
Gui, X., Li, J., Ueno, A., Iacucci, M., Qian, J., & Ghosh, S. 2018. Histopathologic
Features of Inflammatory Bowel Disease are Associated with Different
CD4+ T Cell Subsets in Colonic Mucosal Lamina Propria. Journal of
Crohn’s and Colitis.

Heather A.M and G.G. 2015. Three cheers for the goblet cell: maintaining
homeostasis in mucosal epithelia. Trends Moleculer Medicine;21:492–503.

Hegar B. 2014. Inflammatory Bowel Disease pada Anak. Dalam: Pratical

management in pediatric, pp 86-92. Editor Trihono PP, Djer MM, Citraresmi
E, CA: IDAI Jakarta.

Hiroshi Ohno. Intestinal M cells. 2016. The Journal of Biochemistry;159:151–160.

Hyams J, Damaraju L, Blank M, Jewel J, Cynthia G, Harland S.w., Subra K,

Stanley C, and James M. 2012. T72 Study Group. Induction and
maintenance therapy with infliximab for children with moderate to severe
ulcerative colitis. Clin Gastroenterol Hepatol. 2012; 10(4):391-399.

Hyams J.S., Griffiths A, Markowitz J, Robert N.B., William A.F., Ricard B.C.,
Marla D, and Jaroslaw K. 2012. Safety and efficacy of adalimumab for
moderate to severe Crohn’s disease in children. Gastroenterology; 143(2):
365-374.e2

Hyams J.S., Lerer T, and Mack D. 2011. Pediatric Inflammatory Bowel Disease
Collaborative Research Group Registry. Outcome following thiopurine use
in children with ulcerative colitis: a prospective multicenter registry study.
Am J Gastroenterol;106(5):981-987.

Jin-Soo P., Inseong J., Paul D.R., Choon-Soo J., and Gajin J. 2017. Alactic acid
bacterium isolated from kimchi ameliorates intestinal inflammation in DSS-
induced colitis. Journal of Microbiology; 1225-8873.

John G., and Alan C.Moss. 2018. Vitamin D in inflamatory bowel disease: more
than just a supplement. Current Opinion Gastroenterogy and Hepatology;
34:217-225.

John G, Shuji M.B.S., Talia Z, Laura R, Simon R.M., and Alan C.M. 2016. Low
Serum Vitamin D During Remission Increases Risk of Clinical Relapse in
Patients with Ulcerative Colitis. Clinical Gastroenterology and Hepatology;
05.035.

Jot H.O., Jing C, and Margherita T.C 2012. Vitamin D regulation of immune
function in the gut: why do T cells have vitamin D receptors?. Molecular
aspects of medicine; 33(1):77-82.

Jussila A, Virta LJ, Salomaa V, Mäki J, Jula A, Färkkilä MA. 2013. High and
increasing prevalence of inflammatory bowel disease in Finland with a clear
North-South difference. Journal Crohns Colitis;7:256-62.

Kim, H.Y., Song, J.L., Chang, H.K., Kang, S.A., and Park, K.Y. 2014. Kimchi
protects against azoxymethane/dextran sulfate sodium-induced colorectal
carcinogenesis in mice. Journal Medicine of Food; 17:833-841.

Long M.D., Crandall W.V., Leibowitz I.H., Fernando D.R., Sandra C.K., Mark J.i.,
James B, John G, and Richard B.C. 2011. ImproveCareNow Collaborative

50
 for Pediatric IBD. Prevalence and epidemiology of overweight and obesity
in children with inflammatory bowel disease. Inflamm Bowel Disease;
17(10):2162-2168.

Maggie H, Maria S.L., Longhi, Conor F, Adam C, Simon R, and Alan C.M. 2014.
Vitamin D levels in adults with Crohn’s disease are responsive to disease
activity and treatment. Inflammatory bowel diseases; 20(5): 856.

Malowitz S, Green M, Karpinski A, Rosenberg A, Hyman PE. 2016. Age of onset

of functional constipation. J Pediatr Gastroenterol Nutr; 62: 600-602.

Margherita C.T., Lindsay S, Yang-Ding L, and Linlin Y. 2015. Vitamin D and 1, 25

(OH) 2D regulation of T cells. Nutrients; 7(4): 3011-3021.

Martin K, Trine B.L., Carsten G, and Marina R. 2013. The vitamin d receptor and
T cell function. Frontiers in immunology; 10:3389-48.

Mehdi T, Ali G, Leila M, Manijeh D, Sara K, and Mohammad H.E. 2015. Vitamin D
deficiency associated with disease activity in patients with inflammatory
bowel diseases. Digestive diseases and sciences; 60(7):3085-91.

Mouli, Venigalla P, and Ashwin N. 2014. Ananthakrishnan. Review article: vitamin

D and inflammatory bowel diseases. Alimentary pharmacology &
therapeutics; 39(2):125-136.

Okamoto R & Watanabe M. 2016. Role of epithelial cells in the pathogenesis and
treatment of inflammatory bowel disease. Journal Gastroenterology; 51(1):
11-21.

Pinsk V, Lemberg DA, Grewal K, Barker CC, Schreiber RA, Jacobson K. 2007.
Inflammatory bowel disease in the South Asian pediatric population of
British Columbia. American Journal Gastroenterology;102:1077-83.

Sheng-Long X, Li-Qin Y, Hao C, Ding-Yuan H, Xiao-Xiao S, Mao-Dong G, Li-Jia

J, Xin-Xin L, Xiu-Qing L, and Yi J. 2015. Association of vitamin D receptor
gene polymorphisms with the susceptibility to ulcerative colitis in patients
from Southeast China. Journal of Receptors and Signal Transduction;
35(6):530-535.

Stephanie B.O., and Iona M.M. 2017. Diagnosis and management of inflamatory
bowel disease in children. The British Medical Journal; 357;j2083.

Weicheng L, Yunzi C, Maya A.G., Maria L.A., Jie D, Urzula D, Juan K, Mark M,
Yong H, Joel P, Changqing Z, and Yan C.L. 2013. Intestinal epithelial
vitamin D receptor signaling inhibits experimental colitis. The Journal of
clinical investigation; 123(9): 3983-3996.

Wendy D, Edgar M.C., Jan P.H., and Erik Lubberts. 2017. Vitamin D in
Autoimmunity: Molecular Mechanisms and Therapeutic Potential. Dankers
W, Colin EM, van Hamburg JP and Lubberts E Vitamin D in Autoimmunity:
Molecular Mechanisms and Therapeutic Potential. Front. Immunol; 7:697.

Zeisler B, Lerer T, Markowitz J, Mack D, Griffiths A, Bousvaros A, Keljo D, Rosh

J, Evans J, Kappelman M, Otley A, Kay M, Grossman A, Saeed S, Carvallo
R, and Olivia H.M. 2013. Pediatric Inflammatory Bowel Disease
Collaborative Research Group. Outcome following aminosalicylate therapy

51
in children newly diagnosed as having ulcerative colitis. J Pediatr
Gastroenterol Nutr;56(1):12-18.

52