LAPORAN KOASISTENSI DIAGNOSA LABORATORIK

INFEKSI Clostridium perfringens, Clostridium colinum, SERTA INFESTASI

ASCARIASIS, KOKSIDIOSIS DAN TUNGAU PADA AYAM (Gallus gallus
domesticus)

Oleh:
Dominica Alma D.
20/458151/KH/10521

FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN

UNIVERSITAS GADJAHMADA
YOGYAKARTA
2020
 KAJIAN MIKROBIOLOGI
Clostridium perfringens
Etiologi
NE (Nekrotik Enteritis) dapat didefinisikan sebagai penyakit terutama
pada ayam muda, yang disebabkan adanya infeksi dan produksi toksin oleh
Clostridium perfringens tipe A dan, lebih jarang, oleh strain tipe C. Penyakit ini
juga dikenal dengan nama clostridial enteritis, enterotoksemia, dan usus busuk
(Swayne et al., 2020). Nekrotik enteritis paling sering terjadi pada ayam broiler,
ayam broiler muda, dan kalkun muda. Ayam pedaging berusia 2-5 minggu paling
sering terkena. Penyakit ini juga sering ditemukan pada ayam petelur, sebagian
besar pada ayam dara dan burung muda yang bertelur (Pattison et al., 2008).
Clostridium perfringens (Phylum Firmicutes) adalah organisme tanah pembentuk
spora yang sangat umum yang biasanya ditemukan hidup secara komensal di
saluran pencernaan. Spesies ini telah dibagi menjadi lima tipe (A-E) berdasarkan
jenis (atau kombinasi) racun yang mereka hasilkan (Leboffe and Pierce, 2011).
Clostridium perfringens merupakan bakteri non-motil, anaerobik,
memiliki kapsul polisakarida dalam jaringan, berbentuk batang, bakteri Gram
positif yang pendek dan gemuk (0,6-0,8 × 2-4 μm), dan pembentuk endospora.
Meskipun spora diproduksi oleh organisme ini, mereka jarang terlihat pada
preparat perwarnaan. Spora berbentuk oval, subterminal, dan menonjol pada sel
induk. Reaksi karakteristik bakteri adalah zona ganda hemolisis pada Plat Agar
Darah (PAD), stormy clot pada media litmus milk, dan reaksi Nagler (Leboffe and
Pierce, 2011; Markey et al., 2013). Clostridium perfringens memiliki koloni bulat,
lembut, sirkular, berwarna putih keabu-abuan, dan dikelilingi oleh tipikal zona
hemolisis (β-haemolysis) (Miah et al., 2011). Kebanyakan Clostridium
perfringens tumbuh baik pada pH sekitar netral, dan 4,6-7,0 merupakan kondisi
optimum untuk pertumbuhan bakteri. Bakteri Clostridium perfringens merupakan
mikroba mesofil, yaitu mikroba yang dapat hidup secara maksimum pada suhu
yang sedang, mempunyai suhu optimum diantara 20-50oC (Feliatra et al., 2013).
Gambar 1. Morfologi bakteri Clostridium perfringens berbentuk batang dan
berwarna ungu pada pengecatan Gram (bakteri Gram positif) (Leboffe and Pierce,
2011).

Patogenesis
Sumber strain Clostridium perfringens penghasil NE adalah ayam itu
sendiri (Swayne et al., 2020). Nekrotik enteritik tidak menular secara langsung
dari ayam ke ayam, tetapi penyakit tersebut dapat ditularkan secara tidak langsung
melalui pakan, alat, perlengkapan peternakan, atau bahan yang tercemar
Clostridium perfringens. Infeksi terbanyak ditemukan pada kelompok ayam
dengan kepadatan tinggi, penyakit dapat menyebar dengan cepat karena adanya
jumlah bakteri yang tinggi di dalam feses ayam yang terinfeksi (Tabbu, 2002). NE
kadangkala diperburuk oleh koinfeksi dengan coccidia. Kerusakan mukosa oleh
sporozoit dan merozoit, penurunan pH usus, obstruksi usus, dan peningkatan
waktu transit memungkinkan pembentukan dan proliferasi Clostridium
perfringens. Kematian pada unggas yang terinfeksi secara bersamaan dengan
spesies Eimeria adalah 25% lebih tinggi daripada mereka yang terkena enteritis
nekrotik saja (Swayne et al., 2020). Clostridium perfringens tipe A sampai E
menghasilkan sejumlah eksotoksin yang kuat dan berbeda secara imunologis yang
menyebabkan efek lokal dan sistemik yang ditemui pada enterotoksemia. Ada
empat racun utama yang diproduksi, yaitu alfa, beta, epsilon, dan iota; pola
produksinya bervariasi dalam setiap jenis Clostridium perfringens dan
menentukan sindrom klinis yang diamati. Berbagai racun minor, beberapa
diantaranya dapat meningkatkan virulensi, juga dikenali. Ini termasuk hemolisin,
kolagenase, perfringolysin O, toksin B2, dan hyaluronidase. Selain itu,
enterotoksin, yang memiliki sifat sitotoksik, diproduksi oleh semua strain dan
penting dalam penyakit usus yang disebabkan oleh Clostridium perfringens pada
hewan (Quinn et al., 2002). Berikut adalah empat racun utama pada bakteri ini:
 Toksin alfa ini adalah lesitinase (fosfolipase) yang menyerang membran
sel yang menyebabkan kematian dan kerusakan sel. Toksin alfa
diproduksi oleh semua jenis dan memberikan zona hemolisis parsial pada
agar darah. (Markey et al., 2013).
 Toksin beta, toksin pembentuk pori, bersifat mematikan dan
menyebabkan nekrosis. Ini mengikat sel endotel vaskular yang
menyebabkan degenerasi, trombosis, dan nekrosis berikutnya (Markey et
al., 2013).
 Toksin epsilon disekresikan sebagai protoxin (prototoxin) dan diaktifkan
di usus oleh protease seperti tripsin. Kerjanya dengan mengganggu jalur
penghasil energi sel, mengakibatkan penipisan ATP dan nekrosis sel
terprogram. Permeabilitas usus meningkat, memastikan penyerapan
toksin ke dalam aliran darah. Ini merusak endotel vaskular (termasuk
pembuluh darah di otak) yang menyebabkan kehilangan cairan dan
edema. Toksin epsilon dapat dianggap sebagai enterotoksin dan
neurotoksin (Markey et al., 2013).
 Toksin iota adalah toksin biner dengan enzim dan komponen pengikat.
ADP-ribosylates aktin seluler dari toksin ini yang menghalangi
polimerisasi dan akhirnya menyebabkan kematian sel (Markey et al.,
2013).
Toksin baru pembentuk pori, NetB, telah diidentifikasi dalam strain
Clostridium perfringens unggas yang ganas ini. Sebuah penelitian menggunakan
mutan knockout gen, telah menunjukkan bahwa NetB merupakan faktor virulensi
kritis dalam patogenesis enteritis nekrotik pada ayam pedaging. Parasit Eimeria
menyebabkan kebocoran protein plasma dengan membunuh sel epitel sebagai
konsekuensi dari tahapan intraseluler dari siklus hidupnya. Infeksi coccidial
meningkatkan produksi lendir di usus. Kedua efek tersebut memberikan
peningkatan nutrisi yang tersedia dan menciptakan lingkungan yang mendukung
perkembangbiakan bakteri. Clostridium perfringens mampu memanfaatkan lendir
sebagai substrat. Secara keseluruhan, infeksi Eimeria merupakan faktor
predisposisi penting karena dapat mengakibatkan perkembangbiakan Clostridium
perfringens secara masif di usus. Clostridium perfringens tidak hanya
menghasilkan racun tetapi juga bakteriosin. Proporsi yang signifikan lebih tinggi
dari strain Clostridium perfringens mematikan menghasilkan bakteriosin
dibandingkan dengan mikrobiota Clostridium perfringens strain normal, maka
dengan menghambat strain Clostridium perfringens lainnya, strain virulen
tersebut dapat memperoleh manfaat yang maksimal berupa peningkatan
ketersediaan nutrien akibat infeksi Eimeria. Strain virulen dengan demikian
mampu berkembang biak secara masif dan mengeluarkan faktor virulensi yang
berperan dalam induksi lesi nekrotik (Timbermont et al., 2011).
Keberadaan Clostridium perfringens saja di usus tidak cukup untuk
menyebabkan enteritis nekrotik. Dua persyaratan berikut untuk induksi enteritis
nekrotik telah diusulkan: (1) adanya beberapa faktor yang menyebabkan
kerusakan pada mukosa usus, dan (2) adanya organisme Clostridium perfringens
intesinal yang lebih tinggi dari jumlah normal. Jika kedua persyaratan ini
terpenuhi, lesi dapat berkembang, seringkali dimulai dari ujung vili. Sel bakteri
menempel pada epitel yang rusak dan lamina propria yang gundul di mana mereka
berkembang biak dan menyebabkan nekrosis koagulatif. Tarik dan lisis granulosit
heterofil serta nekrosis jaringan lebih lanjut dan proliferasi bakteri berlangsung
dengan cepat. toksin alfa, toksin nekrotikans yang diproduksi oleh semua jenis
toksin, dianggap sebagai faktor virulensi penting yang terlibat dalam proses ini.
Toksin ini menghancurkan membran sel dengan mengenali dan menghidrolisis
fosfolipid membran. Racun juga bisa masuk ke aliran darah, menyebabkan efek
sistemik dan kematian. Telah diusulkan bahwa Clostridium perfringens atau
toksinnya dapat mencapai hati melalui portal darah atau melalui empedu (Pattison
et al., 2008).
Gejala Klinis
Ada dua bentuk Necrotic Enteritis (NE), bentuk klinis akut dan bentuk
subklinis. Meskipun dapat dilihat pada semua usia, bentuk klinis akut terutama
penyakit pada ayam muda, menunjukkan depresi berat, keengganan untuk
bergerak, diare, anoreksia, dehidrasi, bulu kusut, dan kematian mendadak serta
peningkatan mortalitas. Bentuk subklinis tidak menghasilkan tanda-tanda luar,
tetapi berdampak besar pada kinerja (penurunan berat badan, penurunan berat
badan dan gangguan Food Conversion Rate (FCR)) (Swayne et al., 2020).

Gambar 2. Ayam muda yang menderita NE dengan gejala klinis enggan

bergerak, bulu acak-acakan, dan diare (Swayne et al., 2020).

Diagnosa
Ayam dengan tanda klinis yang sesuai dan lesi kasar pada nekropsi harus
diperiksa lebih lanjut untuk lesi mikroskopis dan untuk temuan bakteriologis yang
sesuai. Spesimen harus diambil dari hewan yang baru mati seperti bakteri
Clostridium perfringens, Clostridium septicum dan enterik fakultatif anaerob
adalah penyerang postmortem yang cepat. Pada beberapa penyakit clostridial,
seperti enterotoksemia, pemeriksaan toksin diperlukan untuk diagnosis. Isi usus
kecil diambil dari hewan yang baru mati dan dikirim ke laboratorium secepat
mungkin karena toksinnya labil (Markey et al., 2013). Clostridium perfringens
secara genetik beragam, tetapi isolat dari ayam dalam wabah NE biasanya identik
secara genetik pada tingkat diskriminatif Pulsed-Field Gel Electrophoresis
(PFGE). Ketika diperiksa oleh PFGE, isolat ini cenderung identik. Tes PCR untuk
toksin NetB kemungkinan besar akan positif (Swayne et al., 2020).
Pengambilan Sampel
Isolasi bakteri menggunakan koleksi sampel organ jejunum yang
mengalamai lesi pada ayam menderita diare serta menunjukkan lesi enteritis
tipikal pascamortem (Thomas et al., 2014). Menurut Swayne et al. (2020), sampel
dapat berasal dari isi usus, kerokan mukosa usus, dan swab lesi. Sampel jejunum
diambil dari intestinum ayam dan dimasukkan ke dalam tabung konikel steril.
Sampel disimpan di dalam freezer (-20oC).
Isolasi dan Identifikasi
Isolasi bakteri dapat menggunakan media Kaldu Hati Tarozzi (KHT) yang
merupakan enrichment media untuk memperbanyak jumlah bakteri yang akan
diisolasi khususnya Clostridia patogen. Clostridia tertentu bersifat proteolitik,
sedangkan yang lainnya bersifat sakarolitik. KHT merupakan media yang kaya
nutrisi dengan hati sapi, pepton, dan dekstrosa yang bertindak sebagai sumber
karbon dan nitrogen. Inkubasi KHT dilakukan pada suhu 37 OC selama 48 jam.
Partikel daging yang menghitam dan hancur menunjukkan pertumbuhan
proteolitik. Produksi asam (tidak diindikasikan secara langsung) dan gas
menunjukkan pertumbuhan sakarolitik (Leboffe dan Pierce, 2011).

Gambar 3. Pertumbuhan bakteri pada media KHT menunjukkan adanya

kekeruhan (Leboffe and Pierce, 2011).

Bakteri diisolasi pada media Reinforced Clostridial Agar (RCA) dilakukan

dengan inkubasi anaerobik suhu 37OC selama 48 jam. Pertumbuhan pada RCA
menunjukan adanya koloni spesifik. Medium RCA diketahui adalah medium
enrichment untuk mikroorganisme anaerob seperti Clostridia. Pepton, ekstrak daging
sapi, ekstrak ragi, pati, dan L-sistein menyediakan nutrisi dan faktor pendamping yang
dibutuhkan untuk pertumbuhan clostridia yang baik. Dekstrosa termasuk dalam media sebagai
sumber energi. Menghitamnya media merupakan bukti dugaan adanya Clostridia pereduksi
sulfit (Zimbro et al., 2009). Morfologi koloni diamati setelah diinkubasi selama
24 jam. Selanjutnya dilakukan isolasi dengan mengkultur sampel intestinum pada
Plat Agar Darah (PAD) yang diinkubasi secara anaerob. PAD digunakan untuk
membedakan bakteri berdasarkan karakteristik hemolitiknya. Beberapa spesies
kokus Gram positif menghasilkan eksotoksin yang disebut hemolisin, yang
mampu menghancurkan sel darah merah dan hemoglobin (Leboffe dan Pierce,
2011). Inkubasi PAD pada suhu 37° C selama 48 jam didalam kondisi anaerob,
koloni Clostridium perfrigens akan menunjukkan zona hemolisis ganda (Osman
et al., 2012).

Gambar 4. Koloni Clostridium perfringens tumbuh pada media RCA dengan

koloni sirkular, diameter 2-4 mm, permukaan halus, berkilau, dan memiliki tepi
ireguler atau entire (Osman et al., 2012).

Gambar 5. Koloni Clostridium perfringens pada media PAD menunjukkan zona

hemolisis ganda (Markey et al., 2013).

Koloni yang diduga Clostridium perfringens kemudian dilakukan

pengecatan Gram untuk melihat morfologi selnya. Pengecatan Gram dilakukan
untuk isolat bakteri yang ditemukan. Pengecatan Gram adalah pewarnaan
diferensial dimana terjadi langkah penghilangan warna diantara penerapan dua
pewarnaan dasar. Pengecatan Gram memiliki banyak variasi, tetapi semuanya
bekerja dengan cara yang pada dasarnya sama. Primary stain yang digunakan
adalah kristal violet. Iodin ditambahkan sebagai mordan untuk meningkatkan
pewarnaan kristal violet dengan membentuk kompleks kristal violet-iodine. Lalu
diikuti dengan dekolorasi dan merupakan langkah paling penting dalam prosedur
ini. Sel Gram negatif dihilangkan warnanya oleh larutan (dengan komposisi
variabel umumnya alkohol atau asonon) sedangkan sel Gram positif tidak. Sel
Gram negatif dengan demikian dapat diwarnai dengan counter stain, safranin.
Setelah pewarnaan Gram berhasil, sel Gram positif tampak ungu dan sel Gram
negatif tampak merah muda kemerahan (Leboffe and Pierce, 2011). Clostridium
perfringens terlihat berwarna ungu, besar, dan berbentuk batang (Miah et al.,
2011).

Gambar 6. Koloni Clostridium perfringens dalam pengecatan Gram berbentuk

batang dan berwarna ungu (Gram positif). Sporanya jarang terlihat, tetapi
biasanya subterminal, besar, oval, dan sel induk membengkak (Markey et al.,
2013).

Uji Biokemis
Identifikasi bakteri dengan dilakukan pengujian biokemis meliputi uji
katalase, uji urease, uji indol, uji Methyl Red (MR)-Voges Proskauer (VP), uji
Triple Sugar Iron Agar (TSIA), uji motilitas, uji litmus milk, uji fermentasi
karbohidrat (glukosa, sukrosa, manitol, maltosa, dan laktosa), dan uji lesitinase
dan lipase pada media Egg Yolk Agar (Miah et al., 2011).
 Uji katalase dilakukan dengan 3 ml larutan hidrogen peroksida 3%
dituangkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 2 ml kaldu kultur. Organisme uji
yang tumbuh secara bersamaan dicelupkan ke dalam larutan dengan
mencampurkannya dengan batang kaca steril. Hasil pada Clostridium perfringens
adalah negatif dan tidak terbentuk gelembung (Miah et al., 2011). Ketika hidrogen
peroksida ditambahkan ke kultur katalase positif, gelembung gas oksigen segera
terbentuk. Jika tidak ada gelembung yang muncul, organisme tersebut negatif
katalase (Leboffe and Pierce, 2011).

Gambar 7. Uji katalase dimana jika terbentuk gelembung menandakan bakteri

yang diuji adalah katalase positif (Leboffe and Pierce, 2011).

Uji urease dilakukan untuk mendeteksi bakteri yang mampu

menghidrolisis urea dengan enzim urease. Bakteri yang mampu menghidrolisis
urea dengan enzim urease akan mengubah warna media menjadi merah muda,
sedangkan bakteri yang tidak mampu menghidrolisis urea dengan enzim urease
akan menyebabkan media tetap berwarna kuning (Leboffe dan Pierce, 2011).
Hasil pada Clostridium perfringens adalah negatif sehingga media tetap berwarna
kuning (Miah et al., 2011).

Gambar 8. Bakteri positif urease akan mengubah warna media menjadi warna
merah muda (Leboffe and Pierce, 2011).
 Uji indol digunakan untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam
menghasilkan molekul indol akibat adanya enzim tryptophanase. Reagen Kovacs
yang berisi dimethylaminobenzaldehide (DMABA), HCl, dan amil alkhohol
selanjutnya akan berikatan dengan molekul indole dan menghasilkan rose indole
berbentuk cincin merah. Hasil positif ditandai dengan adanya cincin berwarna
merah di permukaan media (Leboffe dan Pierce, 2011). Media tidak membentuk
cincin merah setelah penambahan reagen karena tidak memiliki enzim
tryptophanase, maka Clostridium perfringens memberi hasil negatif pada uji indol
(Miah et al., 2011).

Gambar 9. Hasil positif pada uji indol akan menunjukkan terbentuknya cincin
merah (Leboffe and Pierce, 2011).

Methyl Red (MR) merupakan uji yang digunakan untuk mendeteksi

bakteri yang mampu melakukan fermentasi asam campuran. Asam campuran
tersebut bersifat stabil. Indikator methyl red akan berubah menjadi warna merah
pada pH 4,4 dan menjadi kuning pada pH 6,2. Hasil positif akan mengubah
warna menjadi merah setelah diinkubasi dan ditetesi dengan reagen MR,
sedangkan hasil negatif akan mengubah warna media menjadi kuning (Leboffe
dan Pierce, 2011). Hasil pada Clostridium perfringens adalah negatif sehingga
media tetap berwarna kuning (Miah et al., 2011).
Gambar 10. Uji Methyl Red dengan hasil positif media akan berwarna merah
(Leboffe and Pierce, 2011)
 Uji Voges-Proskauer (VP) bertujuan mengetahui kemampuan bakteri
memfermentasi glukosa, tetapi dengan cepat mengubah produk asamnya menjadi
asetoin dan 2,3-butanediol. Menambahkan reagen VP (KOH dan α-naphthol) ke
media setelah inkubasi mengoksidasi asetoin (jika ada) menjadi diasetil, yang
pada gilirannya bereaksi dengan inti guanidin dari pepton untuk menghasilkan
warna merah Reaksi positif akan menunjukkan warna merah, sedangkan reaksi
negatif tidak menunjukkan adanya perubahan warna (Leboffe dan Pierce, 2011).
Hasil pada Clostridium perfringens adalah negatif sehingga media tidak berubah
warna (Miah et al., 2011).

Gambar 11. Tidak adanya perubahan warna pada uji Voges-Proskauer

menandakan hasil negatif (Leboffe and Pierce, 2011).

Uji Triple Sugar Iron Agar (TSIA) adalah media kaya yang dirancang
untuk membedakan bakteri berdasarkan fermentasi glukosa, fermentasi laktosa,
fermentasi sukrosa, dan reduksi sulfur. Phenol red adalah indikator pH dan iron
dalam ferrous sulphate adalah indikator hidrogen sulfida. Masa inkubasi selama
18-24 jam untuk fermentasi karbohidrat dan 48 jam untuk reaksi hidrogen sulfida.
Banyak reaksi dalam berbagai kombinasi dimungkinkan (Leboffe dan Pierce,
2011). Clostridium perfringens mampu memfermentasi ketiga gula yang tersedia
pada media dan mereduksi sulfur ditandai dengan media berwarna kuning pada
bagian atas dan bawah serta adanya presipitat hitam (Miah et al., 2011).
Gambar 12. Uji TSIA dengan berbagai macam hasil dan interpretasi (Leboffe
and Pierce, 2011).

Uji motilitas bertujuan untuk mengetahui kemampuan motilitas bakteri.

Pada uji motilitas menggunakan agar semisolid. Bakteri motil akan tumbuh
menyebar dari tusukan, sedangkan bakteri non motil tumbuh hanya pada bekas
tusukan (Leboffe and Pierce, 2011). Clostridium perfringens merupakan bakteri
non motil sehingga menunjukkan pertumbuhan bakteri hanya pada bekas tusukan.
(Miah et al., 2011).

Gambar 13. Clostridium perfringens adalah bakteri non motil sehingga dalam uji
motilitas pertumbuhannya hanya diarea bekas tusukan (Markey et al., 2013).
 Litmus milk merupakan media yang terdiri dari susu skim dan indikator
pH azolitmin. Susu skim memberikan nutrisi untuk pertumbuhan, laktosa untuk
fermentasi, dan protein dalam bentuk kasein. Azolitmin (lakmus) berwarna merah
muda pada pH 4,5 dan biru pada pH 8,3. Di antara kedua ekstrem ini berwarna
ungu. Empat reaksi dasar terjadi dalam media ini, yaitu fermentasi laktosa,
reduksi lakmus, koagulasi kasein, dan hidrolisis kasein. Kombinasi reaksi ini
menghasilkan berbagai hasil, yang masing-masing dapat digunakan untuk
membedakan bakteri. Fermentasi laktosa mengasamkan media dan mengubah
lakmus menjadi merah muda. Akumulasi asam dapat menyebabkan kasein
mengendap dan membentuk acid clot. Acid clot memadatkan media dan dapat
tampak merah muda atau putih dengan pita merah muda di bagian atas tergantung
pada status oksidasi-reduksi lakmus. Litmus yang direduksi berwarna putih dan
litmus teroksidasi berwarna ungu. Celah atau retakan pada bekuan adalah bukti
produksi gas. Produksi gas berat yang memecah clot disebut stormy fermentation
(Leboffe dan Pierce, 2011). Clostridium perfringens pada uji litmus milk
menunjukkan hasil media berubah warna menjadi merah muda, litmus berwarna putih, dan
terbentuk clot yang merusak sebagian media (stormy-clot) (Markey et al., 2013).

Gambar 14. Hasil uji litmus milk untuk Clostridium perfringens adalah media
berwarna pink, litmus putih, dan terbentuk stormy-clot (Markey et al., 2013).
 Uji biokemis yang terakhir adalah uji gula-gula atau uji fermentasi
karbohidrat. Uji ini bertujuan untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam
memfermentasikan suatu jenis karbohidrat atau gula spesifik. Uji fermentasi
karbohidrat menggunakan satu jenis karbohidrat dalam media cair dengan
indikator warna phenol red. Produksi asam dari fermentasi gula akan menurunkan
pH dibawah netral sehingga media berubah warna menjadi kuning dan akan
berubah warna menjadi merah akibat hidrolisis pepton (Leboffe dan Pierce, 2011).
Hasil pemeriksaan Clostridium perfringens mampu memfermentasi glukosa,
laktosa, sukrosa, dan maltosa sehingga pada media tersebut warna berubah
menjadi kuning (Miah et al., 2011).

Gambar 15. Uji fermentasi karbohidrat menggunakan berbagai macam jenis

karbohidrat (Leboffe and Pierce, 2011).

Egg Yolk Agar bertujuan untuk mendeteksi produksi lesitinase, aktivitas

lipase, dan proteolitik. Lesitinase mendegradasi lesitin yang ada di kuning telur,
menghasilkan presipitat putih yang tidak larut dalam media pertumbuhan di
sekitarnya. Lipase memecah lemak bebas yang ada dalam kuning telur,
menyebabkan terbentuknya kemilau “minyak di atas air” yang berwarna-warni di
permukaan koloni. Reaksi lipase mungkin tertunda, maka plat harus disimpan
hingga 7 hari sebelum dianggap negatif untuk produksi lipase. Proteolisis
diindikasikan oleh zona bening di media sekitar pertumbuhan (Zimbro et al.,
2009). Koloni Clostridium perfringens yang tumbuh pada media disekitarnya
menunjukkan presipitasi putih yang membesar yang distimulasi oleh produksi
enzim lesitinase, namun tidak memproduksi enzim lipase (Markey et al., 2013).
Gsmbar 16. Morfologi pertumbuhan Clostridium perfringens pada media Egg
Yolk Agar (Zimbro et al., 2009).

Tabel 1. Hasil isolasi dan uji biokemis bakteri Clostridium perfringens (Leboffe
dan Pierce, 2011; Miah et al., 2011; Markey et al., 2013).
Uji Hasil Interpretasi
Kht + Pertumbuhan bakteri ditunjukkan dengan
adanya kekeruhan media, gelembung gas,
dan menghancurkan partikel hati.
Rca + Bakteri tumbuh dan media menghitam.
Pad + Bakteri tumbuh dan terbentuk zona
hemolisis ganda.
Pengecatan + Bakteri tumbuh berwarna ungu dan
Gram berbentuk batang.
Uji Katalase - Bakteri tidak menghasilkan enzim katalase.
Uji Urease - Bakteri tidak mampu menghidrolisis urea
dengan enzim urease.
Uji Indol - Bakteri tidak memiliki enzim
tryptophanase.
Uji MR - Bakteri tidak mampu melakukan
fermentasi asam campuran.
Uji VP - Bakteri tidak mampu memproduksi asetoin
dari degradasi glukosa selama fermentasi
α-2,3-butanediol.
Uji TSIA + Bakteri memfermentasi glukosa, laktosa,
dan atau sukrosa, serta mereduksi sulfur.
Uji Motilitas + Bakteri tumbuh hanya pada bekas tusukan
menandakan bakteri non motil.
Uji Litmus + Bakteri memfermentasi laktosa, mereduksi
Milk litmus, dan memproduksi gas.
Uji Fermentasi + Bakteri mampu memfermentasikan
Karbohidrat glukosa, laktosa, sukrosa, dan maltosa.
Egg Yolk Agar + Bakteri memproduksi enzim lesitinase,
namun tidak memproduksi enzim lipase.

Polymerase Chain Reaction (PCR)

Peneguhan diagnosa laboratoris yang lebih sensitif dan spesifik dapat
dilakukan dengan uji Polymerase Chain Reaction (PCR). Multipleks PCR
digunakan untuk mendeteksi keberadaan gen yang mengkode alfa-toksin (cpa),
beta-toksin (cpb), epsilon-toksin (etx), iotatoxin (iap) dan CPE (cpe). Setiap PCR
memiliki total volume 25 μl, yang mengandung 5 μl DNA sebagai template 10
picomole (pmol) dari masing-masing primer dan campuran master 1 × PCR,
dibuat hingga 25 μl dengan air bebas DNAse-RNAse. Kondisi amplifikasi adalah:
denaturasi awal pada 94°C selama 5 menit, diikuti oleh 35 siklus 94° C selama 1
menit, 55°C untuk 1 menit dan 72°C selama 1 menit. Perpanjangan akhir langkah
pada 72°C selama 10 menit diikuti. Produk amplifikasi adalah dielektroforesis
dalam gel agarosa 1,5% yang mengandung 0,5 x TBE (Trisborat 35
etylenediamine tetraacetic acid) pada 70 V selama 60 menit dan divisualisasikan
di bawah sinar ultraviolet (Ghoneim and Hamza, 2017). Secara singkat, PCR
dilakukan dalam campuran reaksi 25 μL yang mengandung 10x Dream Taq buffer
PCR (MBI Fermentas), 0,2 mM dNTP, 1,25 unit Dream Taq DNA Polymerase
(MBI Fermentas), 10 pmol dari masing-masing primer universal. Elektroforesis
gel agarosa dilakukan untuk melihat hasil dan ekstraksi gel menggunakan kit
ekstraksi Gel cepat QIA dilakukan dengan menggunakan instruksi pabrik
(Thomas et al., 2014).
Multipleks PCR telah banyak dikembangkan untuk mendeteksi gen yang
mengkode empat racun utama yang diproduksi oleh Clostridium perfringens tipe
A hingga E. Selain itu, deteksi gen yang mengkode enterotoksin (cpe) dan beta2-
toksin (cpb2) memungkinkan subtipe bakteri (Osman et al., 2012). Penyelidikan
hibridisasi fluoresensi berlabel ganda (TaqMan®) berdasarkan uji PCR multipleks
real-time dikembangkan untuk mendeteksi gen toksin alfa (cpa), beta (cpb), iota
(ia), epsilon (etx), beta2 (cpb2) dan enterotoksin (cpe) langsung dari kotoran
ternak. NetB pembentuk pori-pori telah dilaporkan sebagai faktor virulensi pada
strain yang dapat menyebabkan enteritis nekrotik (Keyburn et al., 2008). Gen
NetB dapat diidentifikasi oleh PCR. Polimorfisme panjang fragmen teramplifikasi
(AFLP) dan elektroforesis gel lapangan berdenyut (PFGE) ditemukan sama-sama
cocok untuk subtipe isolat Clostridium perfringens yang berasal dari unggas.
Multiple-locus variable-number tandem repeat analysis (MLVA) juga telah
dideskripsikan sebagai alat yang efisien untuk mengetik strain Clostridium
perfringens dan dapat digunakan dalam studi epidemiologi (Osman et al., 2012).

Gambar 17. PCR menunjukkan hasil CPE. Kehadiran band 2,1 kb

menggambarkan kehadiran gen cpe kromosomal sementara kehadiran dari pita 3,3
kb akan mengindikasikan plasmid-borne gen cpe pada Clostridium perfringens
(Loh et al., 2008).

Gambar 18. Gel hasil elektroforesis dari pengetikan toksin Clostridium

perfringens oleh Multipleks PCR: Jalur 1 = 50 bp tangga (BR biochem life
sciences), 2 dan 5 = kontrol negatif (replikasi), 3 dan 4 = sampel positif
(replikasi), 6 = kontrol positif (Thomas et al., 2014).
Diferensial Diagnosa
Nekrotik enteritis (NE) yang disebabkan oleh Clostridium perfringens
adalah salah satu penyakit enterik yang paling umum pada ayam dan kalkun.
Namun, beberapa agen bakteri, parasit dan virus lainnya dapat menyebabkan
tanda-tanda klinis, lesi kasar, dan mikroskopis pada unggas yang sangat mirip
dengan NE. Diagnosis banding utama untuk Clostridium perfringens meliputi
bakteri (Clostridium colinum, Clostridium sordellii, Clostridium difficile,
Pasteurella multocida, Brachyspira spp.), parasit (Eimeria spp., Histomonas
meleagridis), dan virus (Duck Herpesvirus tipe 1, Avian Paramyxovirus tipe 1).
Konfirmasi diagnosis penyakit ini membutuhkan identifikasi agen etiologi dengan
metode morfologi, kultural, dan atau molekuler (Uzal et al., 2016).

Clostridium colinum
Etiologi
Ulseratif enteritis (UE) adalah penyakit yang disebabkan oleh Clostridium
colinum, bakteri Gram positif berbentuk batang, bersporulasi, dan anaerobik.
Penyakit ini paling sering dikenali pada burung puyuh muda, meskipun kasus juga
terjadi pada ayam, kalkun, dan beberapa spesies unggas lainnya. Ditularkan
melalui rute fekal-oral dan menghasilkan UE akut, sub-akut atau kronis, dan
cukup jarang colitis. UE paling sering terjadi pada individu muda dari semua
spesies (ayam 4-12 minggu; kalkun 3-8 minggu; puyuh 4-12 minggu) dan kasus
puyuh dewasa jarang diamati (Swayne et al., 2020).
Clostridium colinum adalah bakteri Gram-positif, berbentuk batang,
muncul secara tunggal sebagai batang lurus atau sedikit melengkung, 3-4μm x
1μm dengan ujung membulat, dan merupakan bakteri motil. Sporulasi jarang
terjadi pada media buatan, tetapi jika ada spora berbentuk oval dan sub terminal.
Sel sporogenik jauh lebih panjang dan lebih tebal daripada sel yang tidak
berspora. Jika diinokulasi pada pre-reduced plat dengan bahan dari lesi dan
diinkubasi secara anaerob selama 24-48 jam pada suhu 35°C-42°C, maka koloni
yang dihasilkan berdiameter 1-2 mm, berwarna putih, melingkar, cembung, dan
semi transparan dengan tepi filamentous (Swayne et al., 2020).
Patogenesis
Clostridium colinum ditularkan melalui konsumsi pakan, air, litter atau
bahan lain yang terkontaminasi feses. Ketika kasus UE terjadi, spora Clostridium
colinum mencemari tempat yang, setelah wabah penyakit, diasumsikan tetap
terkontaminasi selama berbulan-bulan. Baik unggas dengan infeksi aktif maupun
unggas yang sembuh dari penyakit menjadi carrier dan mengeluarkan organisme
tersebut melalui kotorannya. Bukti anekdotal menunjukkan bahwa hal tersebut
adalah salah satu faktor terpenting dalam penularan penyakit ini. Telah
dikemukakan bahwa lalat yang memakan kotoran yang terkontaminasi dapat
menyebabkan infeksi di tempat (Swayne et al., 2020).
Setelah infeksi oral, Clostridium colinum menempel pada epitel usus,
menghasilkan lesi peradangan dan borok di usus halus dan, kadang-kadang, kolon
proksimal. Organisme kemudian dapat bermigrasi ke hati melalui sirkulasi portal
dna menghasilkan foki nekrosis hati yang sering terlihat pada kasus UE. Setelah
inokulasi eksperimental, penyakit akut berkembang dan disertai kematian unggas
dalam 1-3 hari. Perjalanan penyakit dalam kelompok umumnya sekitar 3 minggu,
dengan kematian puncak terjadi 5-14 hari setelah kasus awal. Sangat sedikit yang
diketahui tentang dasar virulensi Clostridium colinum. Peran toksin dalam
patogenesis UE telah disarankan, tetapi tidak dibuktikan. Genom Clostridium
colinum belum dikarakterisasi (Swayne et al., 2020).
Clostridium colinum ada dimana-mana dan diekskresikan dalam jumlah
besar melalui kotoran ternak yang terkena, yang merupakan sumber infeksi
penting. Spora tersebut menghasilkan kontaminasi yang terus-menerus pada
tempat setelah wabah. Faktor yang mempengaruhi tampaknya memainkan peran
penting dalam produksi penyakit. termasuk koksidiosis, faktor imunosupresif
seperti penyakit infeksi bursal, virus anemia pada ayam, kepadatan kandang yang
berlebihan, dan kebersihan kandang yang tidak memadai. Memelihara ayam pada
lantai kawat telah dilaporkan sebagai tindakan pencegahan (Pattison et al., 2008).
Gejala Klinis
Gejala dari UE adalah diare yang awalnya berair, tetapi bisa menjadi
hemoragik. Saat UE berkembang, unggas yang terinfeksi menjadi lesu, bungkuk
dengan mata sebagian tertutup, dan bulu kusam dan kusut. Kekurusan yang
mencolok dengan atrofi otot dada terlihat pada burung yang terkena dampak
selama seminggu atau lebih. Pada penyakit akut dapat terjadi peningkatan
mortalitas tanpa tanda-tanda yang jelas. Puyuh muda bisa mati 100% dalam
beberapa hari. Tingkat kematian pada ayam biasanya berkisar antara 2% hingga
10% (Pattison et al., 2008; Swayne et al., 2020).
Diagnosa
Diagnosis dugaan dapat didasarkan pada tanda-tanda klinis (peningkatan
mortalitas, biasanya dengan diare hemoragik), lesi mikroskopis dan kasar,
termasuk ulserasi usus dan nekrosis, serta nekrosis hati multifokal. Pengamatan
adanya bakteri Gram positif berbentuk batang yang besar biasanya dengan spora
subterminal dan beberapa spora bebas pada apusan hati yang diwarnai dengan
pengecatan Gram mampu menambah kepastian diagnosis dugaan ini. Diagnosis
akhir, bagaimanapun, harus didasarkan pada deteksi Clostridium colinum melalui
kultur atau PCR dari organ usus, hati, atau limpa. Organisme ini sering hadir di
hati dalam bentuk yang kurang lebih murni, maka isolasi dari hati lebih disukai
daripada dari usus (Cooper et al., Swayne et al., 2020).
Pengambilan Sampel
Isolasi bakteri menggunakan koleksi sampel organ hati yang mengalami
nekrosis pada ayam menderita diare serta menunjukkan lesi tipikal ulseratif
enteritis pascamortem. Sampel dapat berasal dari organ usus, hati, atau limpa.
Organisme ini sering hadir di hati dalam bentuk yang kurang lebih murni, maka
isolasi dari hati lebih disukai daripada dari usus. Sampel organ diambil dan
dimasukkan ke dalam tabung konikel steril dan disimpan di dalam freezer (-20oC)
(Swayne et al., 2020).
Isolasi dan Identifikasi
Isolasi Clostridium colinum membutuhkan media yang diperkaya dan
lingkungan anaerobik. Media isolasi terbaik adalah agar tryptose-fosfat dengan
glukosa 0,2%, ekstrak ragi 0,5%, dan plasma kuda 8%. Pre-reduced plat
diinokulasi dengan bahan dari lesi hati, usus, atau limpa dan diinkubasi secara
anaerob selama 24-48 jam pada suhu 35°C-42°C. Koloni yang dihasilkan
berdiameter 1–2 mm, berwarna putih, melingkar, cembung, mengkilap, halus, dan
semi-translusen dengan tepi berserabut. Organisme ini juga dapat tumbuh pada
agar darah yang telah direduksi sebelumnya diinkubasi secara anaerob dan
hasilnya adalah alpha-hemolysis (Swayne et al., 2020). Selain itu, bakteri juga
dapat diisolasi pada media Reinforced Clostridial Agar (RCA) dilakukan dengan
inkubasi anaerobik suhu 37OC selama 48 jam. Pertumbuhan pada RCA
menunjukan adanya koloni spesifik. Medium RCA diketahui adalah medium
enrichment untuk mikroorganisme anaerob seperti Clostridia (Zimbro et al.,
2009).

Gambar. Media Plat Agar Darah (PAD) (Leboffe and Pierce, 2011).

Gambar. Media Reinforced Clostridial Agar (RCA) (Osman et al., 2012).

Sebagai bantuan dalam diagnosis, dapat dilakukan pula pengecatan Gram.

Jaringan hati nekrotik dapat dihancurkan antara 2 slide, difiksasi dengan panas,
dan diwarnai dengan metode Gram. Setelah metode pengecatan selesai, lalu
diamati di bawah mikroskop. Bakteri berbentuk batang, besar, tercat ungu (Gram-
positif) memiliki spora subterminal dan spora bebas dapat dilihat, walaupun
terkadang sporanya tidak terlihat (Swayne et al., 2020).
Gambar . Hasil pengecatan Gram pada Clostridium sp. terlihat bakteri berbentuk
batang dan tercat ungu (Gram positif) (Leboffe and Pierce, 2011).

Uji Biokemis
Uji katalase dilakukan untuk mengetahui aktivitas enzim katalase yang
dimiliki oleh bakteri yang mampu memecah H2O2. H2O2 merupakan produk hasil
sampingan dari respirasi bakteri yang bilamana terakumulasi akan bersifat toksik.
Oleh karena itu, komponen ini harus dipecah oleh enzim katalase agar tidak
bersifat toksik lagi. Ketika hidrogen peroksida ditambahkan ke kultur katalase-
positif, gelembung gas oksigen segera terbentuk. Jika tidak ada gelembung yang
muncul, organisme tersebut negatif katalase (Leboffe and Pierce, 2011). Hasil
pada Clostridium colinum adalah negatif yang berarti bakteri tidak memproduksi
enzim katalase dan tidak terbentuk gelembung (Swayne et al., 2020).

Gambar 7. Uji katalase dimana jika terbentuk gelembung menandakan bakteri

yang diuji adalah katalase positif (Leboffe and Pierce, 2011).

Uji urease dilakukan untuk mendeteksi bakteri yang mampu

menghidrolisis urea dengan enzim urease. Bakteri yang mampu menghidrolisis
urea dengan enzim urease akan mengubah warna media menjadi merah muda,
sedangkan bakteri yang tidak mampu mengubah urea dengan enzim urease akan
menyebabkan media tetap berwarna kuning (Leboffe dan Pierce, 2011).
Clostridium colinum tidak memproduksi enzim urease sehingga media tetap
berwarna kuning (Swayne et al., 2020).

Gambar 8. Bakteri positif urease akan mengubah warna media menjadi warna
merah muda (Leboffe and Pierce, 2011).

Uji indol digunakan untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam

menghasilkan molekul indol akibat adanya enzim tryptophanase. Reagen Kovacs
yang berisi dimethylaminobenzaldehide (DMABA), HCl, dan amil alkhohol
selanjutnya akan berikatan dengan molekul indole dan menghasilkan rose indole
berbentuk cincin merah. Hasil positif ditandai dengan adanya cincin berwarna
merah di permukaan media (Leboffe dan Pierce, 2011). Media tidak membentuk
cincin merah setelah penambahan reagen karena tidak memiliki enzim
tryptophanase, maka Clostridium colinum memberi hasil negatif pada uji indol
(Markey et al., 2013).

Gambar 9. Hasil positif pada uji indol akan menunjukkan terbentuknya cincin
merah (Leboffe and Pierce, 2011).

Uji Methyl Red (MR) dirancang untuk mendeteksi organisme yang

mampu melakukan fermentasi asam campuran, yang menggunakan buffer fosfat
dalam media dan menurunkan pH. Asam yang dihasilkan oleh organisme ini
cenderung stabil, sedangkan asam yang dihasilkan oleh organisme lain cenderung
tidak stabil dan selanjutnya diubah menjadi produk yang lebih netral. Indikator
methyl red akan berubah menjadi warna merah pada pH 4,4 dan menjadi kuning
pada pH 6,2. Hasil positif akan mengubah warna menjadi merah setelah
diinkubasi dan ditetesi dengan reagen MR, sedangkan hasil negatif akan
mengubah warna media menjadi kuning (Leboffe dan Pierce, 2011). Hasil pada
Clostridium colinum adalah negatif sehingga media tetap berwarna kuning
(Swayne et al., 2020).

Gambar 10. Uji Methyl Red dengan hasil positif media akan berwarna merah
(Leboffe and Pierce, 2011).
 Uji Voges-Proskauer (VP) bertujuan mengetahui kemampuan bakteri yang
dapat memproduksi asetoin dari degradasi glukosa selama fermentasi α-2,3-
butanediol merubah larutan merah ketika penambahan VP reagents (α-Napthol
and KOH) dan reaksi oksidase asetoin pada diacetyl merubah nuklei guanidin dari
peptone. Reaksi positif akan menunjukkan warna merah, sedangkan reaksi negatif
tidak menunjukkan adanya perubahan warna (Leboffe dan Pierce, 2011). Hasil
pada Clostridium colinum adalah negatif sehingga media tidak berubah warna
(Swayne et al., 2020).

Gambar 11. Tidak adanya perubahan warna pada uji Voges-Proskauer

menandakan hasil negatif (Leboffe and Pierce, 2011).

Uji motilitas bertujuan untuk mengetahui kemampuan motilitas bakteri.

Pada uji motilitas menggunakan agar semisolid. Bakteri motil akan tumbuh
menyebar dari tusukan, sedangkan bakteri non motil tumbuh hanya pada bekas
tusukan (Leboffe and Pierce, 2011). Clostridium colinum merupakan bakteri motil
sehingga menunjukkan pertumbuhan bakteri menyebar dari bekas tusukan
(Swayne et al., 2020).
Gambar 13. Clostridium colinum adalah bakteri motil sehingga dalam uji
motilitas pertumbuhannya menyebar dari area bekas tusukan (Swayne et al.,
2020).

Litmus milk merupakan media yang terdiri dari susu skim dan indikator
pH azolitmin. Susu skim memberikan nutrisi untuk pertumbuhan, laktosa untuk
fermentasi, dan protein dalam bentuk kasein. Azolitmin (litmus) berwarna merah
muda pada pH 4,5 dan biru pada pH 8,3. Di antara kedua ekstrem ini berwarna
ungu. Empat reaksi dasar terjadi dalam media ini, yaitu fermentasi laktosa,
reduksi litmus, koagulasi kasein, dan hidrolisis kasein. Kombinasi reaksi ini
menghasilkan berbagai hasil, yang masing-masing dapat digunakan untuk
membedakan bakteri. Fermentasi laktosa mengasamkan media dan mengubah
litmus menjadi merah muda. Akumulasi asam dapat menyebabkan kasein
mengendap dan membentuk acid clot. Acid clot memadatkan media dan dapat
tampak merah muda atau putih dengan pita merah muda di bagian atas tergantung
pada status oksidasi-reduksi litmus. Litmus yang direduksi berwarna putih dan
litmus teroksidasi berwarna ungu. Celah atau retakan pada bekuan adalah bukti
produksi gas. Produksi gas berat yang memecah clot disebut stormy fermentation
(Leboffe dan Pierce, 2011). Clostridium colinum pada uji litmus milk
menunjukkan hasil media tidak berubah dan kasein tidak dicerna, tetapi bakteri ini
memproduksi gas sehingga ada retakan pada media (Swayne et al., 2020).
Gambar 14. Uji litmus milk dengan berbagai macam hasil dan interpretasi
(Leboffe dan Pierce, 2011).

Uji biokemis yang terakhir adalah uji gula-gula atau uji fermentasi
karbohidrat. Uji ini bertujuan untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam
memfermentasikan suatu jenis karbohidrat atau gula spesifik. Uji fermentasi
karbohidrat menggunakan satu jenis karbohidrat dalam media cair dengan
indikator warna phenol red. Produksi asam dari fermentasi gula akan menurunkan
pH dibawah netral sehingga media berubah warna menjadi kuning dan akan
berubah warna menjadi merah akibat hidrolisis pepton (Leboffe dan Pierce, 2011).
Hasil pemeriksaan Clostridium colinum mampu memfermentasi glukosa, sukrosa,
dan maltosa sehingga pada media tersebut warna berubah menjadi kuning. Produk
fermentasi adalah asam asetat dan asam format (Markey et al., 2013; Swayne et
al., 2020).

Gambar 15. Uji fermentasi karbohidrat menggunakan berbagai macam jenis

karbohidrat (Leboffe and Pierce, 2011).

Egg Yolk Agar bertujuan untuk mendeteksi produksi lesitinase, aktivitas

lipase, dan proteolitik. Lesitinase mendegradasi lesitin yang ada di kuning telur,
menghasilkan endapan buram yang tidak larut dalam media pertumbuhan di
sekitarnya. Lipase memecah lemak bebas yang ada dalam kuning telur,
menyebabkan terbentuknya kemilau “minyak di atas air” yang berwarna-warni di
permukaan koloni. Reaksi lipase mungkin tertunda, maka plat harus disimpan
hingga 7 hari sebelum dianggap negatif untuk produksi lipase. Proteolisis
diindikasikan oleh zona bening di media sekitar pertumbuhan (Zimbro et al.,
2009). Clostridium colinum diketahui tidak memproduksi enzim lesitinase dan
enzim lipase, maka pada media ini tidak terjadi perubahan apapun (Swayne et al.,
2020).

Gsmbar 16. Media Egg Yolk Agar (Zimbro et al., 2009).

Tabel 2. Hasil isolasi dan uji biokemis bakteri Clostridium colinum (Markey et
al., 2013; Swayne et al., 2020).
Uji Hasil Interpretasi
Tryptosfosfat + Koloni bakteri berwarna putih, bulat,
Agar cembung, berkilau, halus, dan semi
translusen dengan tepi berserabut.
PAD + Bakteri tumbuh dan terbentuk zona
hemolisis alfa.
RCA + Bakteri tumbuh dan media menghitam.
Pengecatan + Bakteri tercat ungu dan berbentuk batang,
Gram memiliki spora subterminal, tetapi jarang
terlihat.
Uji katalase - Bakteri tidak menghasilkan enzim katalase.
Uji urease - Bakteri tidak mampu menghidrolisis urea
dengan enzim urease.
Uji indol - Bakteri tidak memiliki enzim
tryptophanase.
Uji MR - Bakteri tidak mampu melakukan
fermentasi asam campuran.
Uji VP - Bakteri tidak mampu memproduksi asetoin
dari degradasi glukosa selama fermentasi
α-2,3-butanediol.
Uji motilitas + Bakteri tumbuh menyebar menandakan
bakteri motil.
Uji litmus milk + Adanya retakan menandakan bakteri
memproduksi gas.
Uji fermentasi + Bakteri hanya dapat memfermentasi
karbohidrat glukosa, sukrosa, dan maltose.
Egg Yolk Agar - Bakteri tidak memproduksi enzim
lesitinase dan enzim lipase.

Polymerase Chain Reaction (PCR)

Campuran PCR untuk Clostridium colinum disiapkan dalam volume total
50 μL yang mengandung 25 μL campuran utama (5 unit / μL Taq polimerase, 400
mM deoksinukleotida campuran 5P-trifosfat, dan 3 mM MgCl2), 18 μL air bebas
nuklease (Promega Corp., Madison, WI), 1 μL (50 pmol / μL) dari masing-masing
primer hilir dan hulu (DNA Alfa; Tabel 1), dan 5 μL template DNA. Amplifikasi
reaksi berantai polimerase dilakukan di thermal cycler DNA Engine (Bio-Rad
Laboratories Ltd., Hercules, CA) (Roussan et al., 2009). Temperatur untuk siklus
adalah 94o C selama 4 menit untuk mendenaturasi DNA diikuti oleh 25 siklus
94oC selama 1 menit, 60oC selama 1 menit, dan 72oC selama 1 menit.
Perpanjangan akhir dilakukan pada 72oC selama 4 menit (Bano et al., 2008).
Strain Clostridium colinum (ATCC 27770) digunakan sebagai kontrol positif
untuk ekstraksi DNA dan PCR. Kontrol negatif (air bebas nuklease) juga
digunakan dalam setiap proses. Produk PCR dielektroforesis pada gel agarosa
1,5% dalam buffer Tris-asetat-EDTA (40 mM Tris dan 2 mM EDTA, dengan nilai
pH 8,0) yang mengandung etidium bromida (Pro-mega Corp.) untuk 45 menit
pada 100 V dan divisualisasikan di bawah sinar UV (AlphaImager,
AlphaInnotech, San Leandro, CA) (Roussan et al., 2009). Amplikon PCR
dibersihkan dengan Minielute PCR Purification Kit (Qiagen) sesuai dengan
instruksi pabrik dan diurutkan menggunakan ABI Genetic Analyzer (Applied
Biosystems). Urutan kemudian dikonfirmasi dengan melakukan analisis BLAST
(Bano et al., 2008).
Batas deteksi PCR untuk Clostridium colinum adalah 10 cfu/mL tanpa
adanya feses, sedangkan keberadaan feses (isi usus) menurunkan sensitivitas PCR
terhadap batas deteksi 1,6 × 104 cfu/g feses. Kehadiran inhibitor PCR dalam tinja
secara tradisional dikaitkan dengan sensitivitas PCR yang lebih rendah untuk
deteksi langsung. Oleh karena itu, tingkat deteksi yang rendah dapat ditingkatkan
secara signifikan dengan penerapan metode ini untuk sampel yang diperkaya
daripada deteksi langsung dari sampel tinja (Bano et al., 2008).

Gambar . Elektroforesis (1,5% gel agarosa) untuk Clostridium colinum. Jalur M

= 100 bp sampai 1,5 kbp ladder marker DNA; jalur 1 = kontrol Clostridium
colinum positif (positif; pita pada 905 bp); jalur 2 = kontrol Clostridium colinum
negatif; jalur 3 sampai 4 = sampel Clostridium colinum positif (positif; pita pada
905 bp); jalur 5 dan 6 = sampel Clostridium colinum negatif (Roussan et al.,
2009).

Diferensial Diagnosa
Penyakit serupa yang harus dibedakan dari UE termasuk koksidiosis,
enteritis nekrotik oleh Clostridium perfringens, dan histomoniasis. Seringkali,
koksidiosis pada ayam, kalkun, dan burung mendahului atau terjadi bersamaan
dengan UE. Kedua penyakit tersebut mungkin hadir dalam spesimen yang sama
atau berbeda yang diajukan untuk diagnosis. Diagnosis banding antara koksidiosis
dan UE harus dibuat karena obat untuk setiap penyakit berbeda. Lebih lanjut,
penyakit ini dapat terjadi secara bersamaan, memerlukan penggunaan dua obat
yang berbeda (Swayne et al., 2020).
Histomoniasis juga berhubungan dengan lesi di seka dan hati, tetapi tidak
menyebabkan lesi usus halus. Pemeriksaan histologis dari seka dan hati akan
menunjukkan histomonad. Coccidiosis dapat mendahului enteritis ulseratif, atau
kedua kondisi dapat terjadi secara bersamaan. Koksidiosis dan enteritis ulseratif
memerlukan pengobatan yang berbeda. Clostridium perfringens dan Clostridium
colinum dapat muncul bersamaan pada unggas yang sakit. Enteritis nekrotik dan
ulseratif memiliki beberapa lesi usus serupa yang dapat mempersulit diagnosis,
dan kemungkinan bahwa kedua organisme penting dalam wabah tidak dapat
dikesampingkan (Pattison et al., 2008).
 DAFTAR PUSTAKA

Bano, L., Ilenia, D., Kenneth, M., Omar, O., Sacit, B. 2008. Development of A
Polymerase Chain Reaction Assay for Specific Identification of
Clostridium colinum. Avian Pathology.
Cooper, K. K., Songer, J. G., Uzal, F. A. 2013. Diagnosing Clostridial Enteric
Disease in Poultry. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation,
25(3): 314-327.
Feliatra, Syahrul, Yoswaty, D. 2013. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Pekanbaru:
Faperika Press.
Ghoneim, N. H., and Hamza, D. A. 2017. Epidemiological Studies on Clostridium
perfringens Food Poisoning in Retail Foods. Rev. Sci. Tech. Off. Int.
Epiz., 2017, 36(3): 1025-1032.

Keyburn, A. L., Boyce, J. D., Vaz, P., Bannam, T. L., Ford, M. E., Parker, D.,
Rubbo, A. D., Rood, J. I., Moore, R. J. 2008. NetB, A New Toxin that is
Associated with Avian Necrotic Enteritis Caused by Clostridium
perfringens. Plos Pathogens, 4(2): 1-11.

Leboffe, M. J. and Pierce, B. E. 2011. A Photographic Atlas for Microbiology

Laboratory. USA: Morton Publishing Company.

Loh, J. P., Liu, Y. C., Chew, S. W., Ong, E. S., Fam, J. M., Ng, Y. Y., Taylor, M.
B., Ooi, E. E. 2008. The Rapid Identification of Clostridium perfringens
As The Possible Aetiology of A Diarrhoeal Outbreak Using PCR.
Epidemiol. Infect., 136, 1142–1146.

Markey, B., Leonard, F., Archambault, M., Cullinane, A., Maguire, D. 2013.
Clinical Veterinary Microbiology 2nd Edition. UK: Mosby Elsevier.

Miah, M. S., Asaduzzaman, M., Sufian, M. A. and Hossain, M. M. 2011. Isolation

of Clostridium perfringens, Causal Agents of Necrotic Enteritis in
Chickens. Journal Bangladesh Agril. Univ. 9(1): 97–102.

Osman, K., Soliman, Y., Amin, Z. M. S., Aly, M. 2012. Prevalensi Clostridium
perfringens Isolat Tipe A Pada Ayam Broiler Komersial dan Induk Ayam
Broiler Induk di Mesir. Sci. Teknologi. Mati. Int. Epiz., 31(3): 931-941.
Pattison, M., McMullin, P. F., Bradbury, J. M., Alexander, D. J. 2008. Poultry
Diseases 6th Edition. USA: Saunders Elsevier.
Quinn, P. J., Markey, B. K., Leonard, F. C., FitzPatrick, E. S., Fanning, S.,
Hartigan, P. J. 2002. Veterinary Microbiology and Microbial Disease 2nd
Edition. USA: Wiley-Blackwell.
Roussan, D. A., Rifai, R. H. Al., Khawaldeh, G. Y., Totanji, W. S. 2009. Flock-
Level Prevalence of Clostridium colinum in Broiler Flocks with
Digestive Disease in Jordan by Polymerase Chain Reaction. Poultry
Science, 88: 1639-1642.
Swayne, D. E., Boulianne, M., Logue, C. M., McDougald, L. R., Nair, V., Suarez,
D. L. 2020. Diseases of Poultry 14th Edition. USA: Wiley-Blackwell.
Tabbu, C. R. 2002. Penyakit Ayam dan Penanggulangannya: Penyakit Asal
Parasit, Noninfeksius, dan Etiologi Kompleks Vol 2. Yogyakarta:
Penerbit Kanisius.
Thomas, P., Arun, T. R., Karthik, K., Berin, P. V., Kumar, M. A., Neetu S.,
Usharani, J., Palanivelu, M., Gupta, S. K., Dhama, K., Viswas, K. N.
2014. Molecular Characterization and Toxinotyping of a Clostridium
perfringens Isolate from a Case of Necrotic Enteritis in Indian Kadaknath
Fowl. Asian Journal of Animal and Veterinary Advances, 9(7): 385-394.

Timbermont, L., Haesebrouck, F., Ducatelle, R., Immerseel, F. V. 2011. Necrotic

Enteric in Broilers: An Update Review on The Pathogenesis. Avian
Pathology, 40(4): 341-347.
Uzal, F. A., Senties-Cue, C. G., Rimoldi, G., Shivaprasad, H. L. 2016. Non-
Clostridium perfringens Infectious Agents Producing Necrotic Enteritis-
like Lesions in Poultry. Avian Pathology, 45(3): 326-333.
Zimbro, M. J., Power, D. A., Miller, S. M., Wilson, G. E., Johnson, J. A. 2009.
Difco and BBL Manual: Manual of Microbiological Culture Media 2 nd
Edition. USA: BD Company.