LAPORAN PRAKTIKUM ANALISIS KIMIA INSTRUMENTAL

MODUL VIII

HPLC/KCKT

Tanggal Praktikum : Rabu, 21 April 2021

Nama/NIM Asisten : Rizki Apriliyanto (118260116)

Nama/NIM Anggota Kelompok:

Adinda Maranata Siburian (119260166)

Annisa Tri Cahyati (119260071)

Faricha Elwarda A. (119260115)

Fishabil Prabaswara (119260157)

Muhammad Ryan Fahrezha Herman (119260111)

PROGRAM STUDI FARMASI JURUSAN SAINS

INSTITUT TEKNOLOGI SUMATERA

2020/2021
 I. Tujuan Percobaan
a) Menjelaskan uji analisis sampel secara HPLC
b) Menerangkan uji analisis sampel secara HPLC
c) Mendemonstrasikan uji analisis sampel secara HPLC
d) Menguji sampel secara HPLC

II. Metodologi

Pada praktikum kali ini digunakan alat seperti HPLC, Kolom HPLC, Mikropipet, Neraca
Analitik, Jarum suntik 1 mL, pH meter, Mikrotube, dan Sonikator. Sedangkan bahan yang
digunakan anara lain Asam salisilat, KH2PO4, Larutan asam metafosfat HPO3, Aquades, Asam
benzoate, Asetonitril, dan Metanol. Pertama, dilakukan pembuatan larutan dapar fosfat. Diambil
2,7216g KH2PO4 dan dilarutkan kedalam 1L aquabides. Kemudian dimasukkan larutan asam
ortho-fosfat secukupnya. Lalu disesuaikan pH hingga 3,5 – 2,5.

Kemudian tahap kedua, dilakukan pembuatan larutan induk sample. Diambil tablet asetosal
10mg, digerus hingga halus, dan dilarutkan kedalam labu takar 10mL. Kemudian diambil asam
benzoate 10mg, dan dimasukkan kedalam labu takar 10mL. Lalu diambil asam salisilat 10mg,
dan dimasukkan kedalam labu takar 10mL. Setelah itu, dimasukkan asetonitril hingga tanda
batas. Kemudian dikocok hingga bahan terlarut.

Kemudian Tahap ketiga yaitu dilakukan penentuan sistem HPLC. Dibuat beberapa fase
gerak. Kemudian dibuat fase gerak dengan perbandingan methanol : asetonitril : dapar fosfat
(15:15:70), (10;20;70), (0:30:70) v/v. Lalu Dibuat fase gerak kedua degan menggunakan aseto
nitril dan dapar fosfat perbandingan (30:70) dengan variasi pH dapar 3,5;3.0 ; dan 2,5. Setelah
itu, dianalisis sample dengan menggunakan HPLC kolom LiChroCART 250 X 4,6 mm i.d., 5
micrometer, Purospher Star RP-18 Endcapped (Merck) volume injeksi 20 microliter, kecepatan
alir 1,5 mL/menit, dan detector UV-Vis dengan Panjang gelombang 230nm.

Tahap terakhir yaitu uji kesesuaian sistem. Diinjeksikan larutan asetosal, asam salisilat, dan
asam benzoate sebanyak enam kali kedalam system HPLC. Stelah itu, digunakan fase gerak
dengan perbandingan asetonitril : dapar fosfat Ph 2,5 sebesar (30:70) v/v. Lalu didapatkan hasil
instrument HPLC.
III. Data dan Pengolahan Data
1. Data Hasil Percobaan
A. AUC Tablet Asetosal

Kadar (ppm) AUC

10 38,88
20 80,78
30 130,23
40 178,54
50 213,43

B. Pengulangan

Replikasi AUC
1 81,82
2 86,76
3 83,4

2. Pengolahan Data
Didapat hasil persamaan regresi linear
Y = 4,4686x – 5,686
𝑅2 = 0,997

Grafik Hubungan Antara AUC

Terhadap Kadar Tablet Asetosal
250 y = 4,4686x - 5,686
200 R² = 0,997

150
AUC

100
50
0
0 10 20 30 40 50 60
Kadar (ppm)
 Replikasi AUC Konsentrasi (ppm)
1 81,82 19,58
2 86,76 20,69
3 83,4 19,94
Rata - rata 83,99 20,07
%Kadar 131,71 %

Berdasakan Farmakope Indonesia Edisi VI (2020) menyatakan bahwa Tablet Asetosal

mengandung tidak kurang dari 90.00% dan tidak lebih dari 110.00%. Namun dari hasil
percobaan didapat kadar asetosal sebesar 131,17%, maka kadar tablet asetosal tersebut tidak
memenuhi syarat Farmakope Indonesia.

IV. Pembahasan

Pada praktikum kali ini tentang kromatografi cair kenerja tinggi bertujuan untuk memahami
prnsip dan penggunaan HPLC/KCKT, menentukan kadar tablet asam asetil salisilat, dan
menentukan apakah sample yang digunakan memenuhi persyaratan atau tidak. HPLC atau
KCKT merupakan jenis kromatografi kolom dan bekerja dengan prinsip yang sama dengan
pronsip kromatografi pada umumnya yaitu pemisahan komponen analit berdasarkan
kepolarannya, setiap campuran yang keluar akan dideteksi oleh detector kemudian ditampilkan
dalam bentuk kromatogram. Dimana jumlah peak menyatakan jumlah komponen, sedangkan
luas eak menyatakan konsentrasi komponen dalam campuran. (Ahuja & Rasmussen, 2007)

Untuk Langkah praktikum kali ini dijelaskan dalam Farmakope Indonesia Edisi VI dimana
digunakan metode HPLC. Pertama dibuat fase geraknya dengan menggunakan natrium 1-
heptansulfonat didalam campuran 850mL air dan 150 asetonitril. Dan diatur pH-nya hingga 3,4
dengan ditambahkan asam asetat glasial. Digunakannya campuran tersebut karena alasan
kepolaran. Fase gerak yang digunakan dalam analisis aspirin adala fase gerak polar yaitu
asetonitril. Selain kepolarannyayang tidak jauh berbeda, alasan digunakannya asetonitril sebagai
fase gerak adalah karena biaya yang digunakan lebih murah, memiliki absorbansi yang rendah
sehingga mengurangi noise, dan dapat mengurangi tailing factor. (Shimadzu, 2008)

Selanjutnya dibuat pengencer larutan dengan menggunakan asetonitril-asam format dengan asam
format, penggunaan asetonitril digunakan adalah karena aspirin (asam asetil salisilat) merupakan
senyawa yang memiliki sifat larut dalam pelarut organik, asetonitril merupakan pelaur organik
dengan rumus senyawa C3H3N. (Anonymous, 2021) setelah itu dibuat baku pembanding dari
sample standar aspirin sesuai yang ada di farmakope, hal ini digunakan untuk membandingkan
bagaimana senyawa baku akan bereaksi terhadap analisis kromatografi baik dari peak yang
dibentuk maupun kurva untuk menganalisis secara kuantitatif.

Setelah itu dilakukan pembuatan uji persediaan dengan cara menimbang 20 tablet sample dan
diserbukkan. Kemudian diambil 100mg dan diamsukkan kedala wadah dan ditambahkan 20mL
pengencer dan ditambahkan manik kaca lebih kurang 10 buah dan dikocok kuat dengan
menggunaan sentrifus. Tujuan ditambambahkan adalah untuk memudahkan sample melarut.
Selanjutnya dipipet sebumlah volume samole dan diencerkan menggunakan pengencer hingga
diperoleh kadar 500ppm dan sisa sample disimpan untuk uji asam salisilat bebas.

Lalu dilakukan uji kromatografi,KCKT dilengkapi dengan detector 280nm dan kolom berkuran 4
mm x 30cm dan berisi pengisi L1. Laju air lebih kurang 2mL per menit. Dan dilakuan
kromatografi pada larutan baku pula sebagai pembanding , direkam kromatografinya dan diukur
respons puncak seperti yang ada didalam prosedur. Factor ikutan dalam kadar tidak lebih besar
dari 2 dan simpangan baku relative tidak lebih dari 2%. Prosedur penyuntikan dilakukan secara
terpisah antara larutan baku dan larutan uji kedalam kromatograf, hal ini dilakukan karena kita
akan menguji masing-masing hasil dari KCKT dan membandingkannya antara sample baku dan
sample, direkam kromatogram dan diuur respons puncak utama dan dihitung dengan
menggunakan rumus.

Selain penggunaan asetonitril sebagai fase gerak, digunakan juga fase diam, fase diam yang
digunakan adalah fase diam yang memiliki system elusi isokratik. Elusi isokratik adaah suatu
system elusi dimana fase gerak dibuat tetap dari awal hingga akhir analisis, pada system ini elusi
dilakukan dengan satu macam pelaru pemebang atau lebih dengan perbandingan yang tetap.
(Susanti & Dachriyanusus, 2017). Fase diam yang umum digunakan adalah jenis oktadesil silane
(C18) dan oktil silama (C8) untuk jenis kormatografi fase balik, dan pada fase normal jenis kolom
kromatografi yang umum digunakan adaah alkilnitril dan alkilamina. Pemanjangan masa
pemaaian kolom dapat dilakukan dengan pemasangan pelindung atau prakolom diantara katu
pemasukan dan kolom utama (Aulia, et al., 2016)

Setelah dilakukan percobaan diperoleh hasil seperti tabel pengelahan data. Terbentuk data AUC
yang dapat digunakan sebagai analisis asetotal (asam asetil salisilat) secara kuantitatif. Pada
larutan baku pembanding (BFI) diperoleh hasil dimana terjadi kenaikan konsentrasi setiap
kenaikan AUC hal ini dapat dilihat dari nilai korelasi grafik yaitu sebesar 0.997 yang berarti
memiliki korelasi yang sangat kuat dan diperoleh persamaan regresi linear y= 4.4686x – 5.686.
setelah itu dilakukan perhitungan AUC sample dan diperoleh nilai AUC sebesar 81.82; 86.76;
dan 83.4 setelah itu dimasukkan kedalam persamaan regresi linear untuk dicari kadar asetosal
dalam tabet dan diper oleh kadar masing-masing sebesar 19.58 ppm, 20.69 ppm, dan 19.94ppm
lalu ketiga data dirata-rata dan dihitung Kembali konsentrasi awalnya dan diperoleh kadar
131.71%. Setelah dibandingkan dengan literatur, kadar ini melewati batas yang telah ditentukan.
Tablet Asetosal mengandung tidak kurang dari 90.00% dan tidak lebih dari 110.00%. (Anonim,
2020). Ketidak akuratan ini terjadi karena beberapa alasan, alasan umum yang terjadi merupakan
kesalahan sistematik seperti alat yang tidak dikalibrasi, penggunaan perekasi dan pelarut yang
kurang baik, tidak dikontrolnya suhu, dan pelaksanaannya kurang tepat sesuai prosedur yang
seharusnya. (Susanti & Dachriyanusus, 2017).

V. Kesimpulan
1. HPLC atau KCKT merupakan jenis kromatografi kolom dan bekerja dengan prinsip
pemisahan komponen analit berdasarkan kepolarannya, setiap campuran yang keluar
akan dideteksi oleh detector kemudian ditampilkan dalam bentuk kromatogram.
2. Pada analisis dengan kromatografi cair kinerja tinggi HPLC /KCKT jumlah peak
menyatakan jumlah komponen, sedangkan luas peak menyatakan konsentrasi komponen
dalam campuran.
3. HPLC atau KCKT menggunakan detektor (UV-VIS) untuk mengenali pemisahan analit
ini setelah melewati kolom HPLC. SIgnal akan dikonversi dan direkam oleh komputer
dan ditunjukkan menjadi kromatogram.
4. Berdasakan Farmakope Indonesia Edisi VI (2020) menyatakan bahwa Tablet Asetosal
mengandung tidak kurang dari 90.00% dan tidak lebih dari 110.00%. Namun dari hasil
percobaan didapat kadar asetosal sebesar 131,17%, maka kadar tablet asetosal tersebut
tidak memenuhi syarat Farmakope Indonesia.

VI. Daftar Pustaka

Ahuja, S. & Rasmussen, H., 2007. HPLC Method Development for Pharmaceuticals. Elsavier,
pp. 111-144.
Anonim, 2020. Farmakpe Indonesia Edisi VI. Jakarta: Kementrian Kesehatan Republik
Indonesia.
Anonymous, 2021. Caymanchem. [Online] Available at:
https://www.caymanchem.com/pdfs/70260.pdf [Accessed 26 April 2021].
Aulia, S. S., Sopyan, I. & Muchtaridi, 2016. PENETAPAN KADAR SIMVASTATIN
MENGGUNAKAN KROMATORAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT) : REVIEW.
Farmaka, 14(4), pp. 70-78.
Shimadzu, 2008. Tips for practical HPLC Analysis. Kyoto: Schimadzu.
Susanti, M. & Dachriyanusus, 2017. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. Padang: LPTIK
UNAND.

VII. Tabel Pengerjaan

Nama
Pengerjaan Annisa Tri M. Ryan Faricha Fisabil Adinda
Cahyati Fahreza Elwarda A Prabaswara Maranata S
Cover v
Tujuan v
Metodologi v
Data dan v v
Pengolahan
Data
Pembahasan v
Kesimpulan v
Daftar v
Pustaka
Tabel Kerja v
Lampiran v v

LAMPIRAN

1. Perhitungan
A. Tahap Pengenceran
1) Ditimbang asetosal baku 5 mg, dilarutkan dalam 10 ml larutan pengencer
5 𝑚𝑔 5000 𝜇𝑔 5 𝑚𝑔
= = 500 𝑝𝑝𝑚 = = 500 𝑚𝑔/𝐿
10 𝑚𝑙 10 𝑚𝑙 0,01 𝐿

2) Dari 500 mg/L diambil cuplikan dengan variasi 10 ; 20 ; 30 ; 40 ; dan 50 ppm

dilarutkan dengan pelarutnya pada labu ukur ad 100 ml
Mi = 500 mg/L
M2 = Variasi konsentrasi 10 ; 20 ; 30 ; 40 ; dan 50 ppm (mg/L)
V2 = 100 ml
a) Dibuat larutan konsentrasi 10 ppm
M1. V1 = M2. V2
500 mg/L. V1 = 10 mg/L. 100 ml
 V1 = 2 ml
Diambil 2 ml larutan standar 500 mg/L dengan pelarut pada labu ukur ad 100 ml

b) Dibuat larutan konsentrasi 20 ppm

M1. V1 = M2. V2
500 mg/L. V1 = 20 mg/L. 100 ml
V1 = 4 ml
Diambil 4 ml larutan standar 500 mg/L dengan pelarut pada labu ukur ad 100 ml

c) Dibuat larutan konsentrasi 30 ppm

M1. V1 = M2. V2
500 mg/L. V1 = 30 mg/L. 100 ml
V1 = 6 ml
Diambil 6 ml larutan standar 500 mg/L dengan pelarut pada labu ukur ad 100 ml
d) Dibuat larutan konsentrasi 40 ppm
M1. V1 = M2. V2
500 mg/L. V1 = 40 mg/L. 100 ml
V1 = 8 ml
Diambil 8 ml larutan standar 500 mg/L dengan pelarut pada labu ukur ad 100 ml

e) Dibuat larutan konsentrasi 50 ppm

hsbdsj M1. V1 = M2. V2
500 mg/L. V1 = 50 mg/L. 100 ml
V1 = 10 ml
Diambil 10 ml larutan standar 500 mg/L dengan pelarut pada labu ukur ad 100 ml

3) Diambil 20 tablet asetosal sediaan 80 mg dengan berat rta-rata 105 mg dan digerus
lalu diambil sampel 100 mg asetosal diencerkan dalam 50 ml larutan pengencer
100 𝑚𝑔 100000 100 𝑚𝑔
= = 2000 𝑝𝑝𝑚 = = 2000 𝑚𝑔/𝐿
50 𝑚𝑙 50 𝑚𝑙 0,05 𝐿
 4) Diambil 1 mL dari 2000 mg/L dimasukkan dalam labu takar 100 mL ditambah
pengencer sampai tanda batas
M1 = 2000 mg/L
V1 = 1 mL
V2 = 100 mL
M1. V1 = M2. V2
2000 mg/L . 1 mL = M2. 100 mL
M2 = 20 mg/L atau 20 ppm

Jadi, didapat hasil tahap pengenceran yaitu :

• Konsentrasi awal sampel = 500 ppm
• Konsentrasi akhir pengenceran sampel = 20 ppm

B. Tahap Penentuan Kadar

Didapat Persamaan regresi linear yaitu, y = 4,4686x – 5,686
• Menghitung konsentrasi
a) y = 81,82
y = 4,4686x – 5,686
81,82 = 4,4686x – 5,686
81,82 + 5,686
𝑥= = 19,58 𝑝𝑝𝑚
4,4686

b) y = 86,76
y = 4,4686x – 5,686
86,76 = 4,4686x – 5,686
86,76 + 5,686
𝑥= = 20,69 𝑝𝑝𝑚
4,4686

c) y = 83,4
y = 4,4686x – 5,686
83,4 = 4,4686x – 5,686
 83,4 + 5,686
𝑥= = 19,94 𝑝𝑝𝑚
4,4686

𝑦1 + 𝑦2 + 𝑦3 19,58 + 20,69 + 19,94

𝑅𝑎𝑡𝑎 − 𝑟𝑎𝑡𝑎 = = = 20,07 𝑝𝑝𝑚
3 3

• Menghitung faktor Pengenceran

𝐾𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑎𝑤𝑎𝑙 𝑡𝑒𝑜𝑟𝑖𝑡𝑖𝑘
𝐹𝑃 =
𝐾𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑎𝑘ℎ𝑖𝑟 𝑡𝑒𝑜𝑟𝑖𝑡𝑖𝑘
500 𝑝𝑝𝑚
𝐹𝑃 = = 25
20 𝑝𝑝𝑚

• Menghitung C sampel (awal)

𝐶𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 = 𝑋 . 𝐹𝑃
= 20,07 𝑥 25
= 501,75 𝑝𝑝𝑚

• Menghitung faktor massa

𝑀𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑎𝑤𝑎𝑙
𝐹𝑀 =
𝐾𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑎𝑤𝑎𝑙
5 𝑚𝑔
𝐹𝑀 = = 0,01 𝑚𝑔/𝑝𝑝𝑚
500 𝑝𝑝𝑚

• Menghitung massa sampel

𝑀𝑎𝑠𝑠𝑎 = 𝐶𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 𝑥 𝐹𝑀
= 501,75 𝑝𝑝𝑚 𝑥 0,01 𝑚𝑔/𝑝𝑝𝑚
= 5,0175 𝑚𝑔

• Menghitung massa murni sampel

𝑀𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 𝑀𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑚𝑢𝑟𝑛𝑖 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙
=
𝑀𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑎𝑤𝑎𝑙 𝑀𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑡𝑎𝑏𝑙𝑒𝑡
 5,0175 𝑚𝑔 𝑀𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑚𝑢𝑟𝑛𝑖 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙
=
5 𝑚𝑔 105 𝑚𝑔
5,0175 𝑚𝑔
𝑀𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑚𝑢𝑟𝑛𝑖 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 = 𝑥 105 𝑚𝑔
5 𝑚𝑔
= 105,37 𝑚𝑔

• Menghitung kadar
𝑀𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑚𝑢𝑟𝑛𝑖 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙
% 𝐾𝑎𝑑𝑎𝑟 = 𝑥 100%
𝑆𝑒𝑑𝑖𝑎𝑎𝑛 𝑡𝑎𝑏𝑙𝑒𝑡
105, 37 𝑚𝑔
= 𝑥 100 %
80 𝑚𝑔
= 131,71 %
2. Bukti Kehadiran (Screenshot)