MAKALAH

MATA KULIAH MANAJEMEN LABORATORIUM

ARTIKEL REVIEW LITERATUR / JURNAL ILMIAH 1

JUDUL

(Teknik Validasi Dan Verifikasi Metode Pengujian Spektrofoto UV-AAS )

Dosen Pengampuh Mata Kuliah : Mufti Hatur Rahmah, S.Si., M.Si

DISUSUN OLEH :

Nur Haliza

H0320320

Biologi c

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN BIOLOGI

FAKULTAS KEGURUAN DAN ILMU PENDIDIKAN UNIVERSITAS
SULAWESI BARAT
2021
 Kata Pengantar

Puji syukur Kami panjatkan kehadirat Tuhan Yang Maha Esa, karena
atas limpahan rahmat dan karunia-Nya, Kami dapat menyelesaikan
penyusunan makalah ini dengan baik serta tepat waktu. Penyusunan makalah
ini merupakan salah satu syarat untuk guna menyelesaikan tugas yang
bertema. Teknik Validasi dam Verifikasi metode pengujian spektrofotomrter
UV-ASS.

Oleh sebab itu pada kesempatan ini, Kami ingin mengucapkan Terima
kasih kepada dosen pengampuh mata kuliah ini yang telah membimbing Kami
dalam penyelesaian makalah ini,dan kepada seluruh rekan yang telah
membantu Kami dalam penyusunan makalah ini, kami juga menyadari bahwa
dalam penyusunan tugas makalah ini banyak kekurangan, sehingga jauh dari
kata sempurna. Saran dan kritik yang membangun Kami harapkan dari semua
pembaca untuk kesempurnaan makalah ini yang sangat Kami butuhkan untuk
dapat lebih menyempurnakannya di masa yang akan dating.

Akhir kata, semoga makalah ini dapat menjadi bahan pembelajaran

bagi penulis khususnya dan bagi pembaca semua pada umumnya.

Campalagian, 11 Mei 2021

Penyusun

Nur haliza
 Daftar Isi

SAMPUL

KATA PENGANTAR

DAFTAR ISI

BAB I PENDAHULUAN

A. Latar Belakang
B. Rumusan masalah
C. Tujuan
D. Manfaat

BAB II PEMBAHASAN

A. Teknik validasi
B. Verivikasi metode pengujian spektrofotomrter UV-ASS

BAB III PENUTUP

A. KESIMPULAN
B. SARAN

DAFTAR PUSTAKA
 BAB I
PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Validasi adalah konfirmasi melalui pengujian dan pengadaan bukti

objektif bahwa persyaratan tertentu untuk suatu maksud khusus dipenuhi,
dimana bukti objektif berupa data pendukung eksistensi sesuatu atau
kebenaran sesuatu. Persyaratan adalah kebutuhan atau harapan yang
dinyatakan secara umum diterapkan dan menjadi keharusan (SNI 19-
17025- 2005 klausul 5.4.5.1). Sehinga dapat disimpulkan Validasi metode
adalah proses pembuktian bahwa metode tersebut sesuai untuk maksud
atau tujuan tertentu (Anonimous1 , 2005). Laboratorium penguji wajib
melakukan validasi metode uji bila menggunakan metode tidak baku,
metode yang didesain atau dikembangkan oleh laboratorium, metode baku
yang digunakan di luar ruang lingkup yang dimaksudkan, metode baku
yang dimodifikasi dan metode baku untuk menegaskan dan
mengkonfirmasi bahwa metode itu sesuai untuk penggunaan yang
dimaksudkan (Anonimous, 1998).
Parameter utama yang harus divalidasi dari suatu metode uji
mencakup akurasi (ketepatan), presisi (repeatability dan reproducibility),
perolehan kembali (recovery), linieritas, limit deteksi, limit kuantisasi,
sensitifitas, selektifitas, ruggedness/robustness, dan ketidakpastian
(uncertainty) (Chaerul Anwar, 2007). Akurasi didefinisikan sebagai
kesesuaian antara hasil analisis dengan ISSN 2089-0877 Vol. 01, No. 02,
Desember 2010 32 BIOPROPAL INDUSTRI nilai benar analit atau nilai
acuan analit yang dapat diterima. Akurasi dapat ditentukan melalui
berbagai cara yaitu Pemakaian Certified Reference Material (CRM),
Perbandingan dengan metode lain dan Standar Adisi. Untuk mendapatkan
nilai akurasi dari suatu metode dapat menggunakan Uji t.

Presisi (repeatability dan reproducibility) menunjukkan kedekatan

diantara hasil-hasil pengujian yang independent dibawah kondisi yang
ditentukan. Nilai Presisi dapat ditentukan melalui repeatability, bila
dilakukan pada laboratorium, analis dan peralatan yang sama; intra
reproducibility, bila dilakukan pada laboratorium yang sama dengan analis
yang berbeda; dan inter reproducibility, bila dilakukan pada laboratorium,
analis dan peralatan yang berbeda. Perolehan kembali (recovery) adalah
nilai perolehan kembali dari yang tidak difortifikasi dan yang difortifikasi
dengan analit pada range konsentrasi tertentu.

Linieritas suatu metode adalah kemampuan memberikan hasil uji

secara langsung atau setelah transformasi matematika, yang proporsional
dengan konsentrasi komponen uji dalam rentang tertentu. Limit deteksi
adalah konsentrasi terendah dari analit dalam contoh yang dapat terdeteksi
tetapi tidak perlu terkuantitasi, dibawah kondisi pengujian yang disepakati.
Limit kuantisasi atau biasa disebut juga limit pelaporan (Limit of
Reporting) adalah konsentrasi terendah dari analit yang dapat ditentukan
 dengan tingkat presisi dan akurasi yang dapat diterima, dibawah kondisi
pengujian yang disepakati. Sensitifitas adalah metode yang sensitif yang
memberikan respon untuk sejumlah (segolongan) komponen yang dapat
atau tidak dapat dibedakan satu sama lain.

Selektifitas adalah metode yang selektif atau spesifik yang

memberikan respon terhadap satu komponen tunggal.
Ruggedness/Robustness adalah ukuran metode dalam mempertahankan
unjuk kerja dimana pengaturan kondisi tidak sesempurna yang
dipersyaratkan oleh metode.Ketidakpastian (uncertainty) adalah parameter
yang menetapkan rentang nilai yang didalamnya diperkirakan nilai
kuantitas yang diukur.

Nilai ketidakpastian sudah memperhitungkan atau

mempresentasikan semua ketidakpastian yang bersumber dari efek acak
maupun efek sistematik. Laboratorium penguji Baristand Industri
Pontianak menggunakan metode yang telah standar yaitu metode SNI 01-
3554-2006 butir 2.22.2.1 di dalam melakukan pengujian logam Cu dalam
Air Minum dalam kemasan.

Alat yang digunakan adalah AAS flame dan bukan AAS tungku
karbon seperti yang disebutkan dalam metode SNI sehingga laboratorium
perlu melakukan validasi metode. Validasi metode pengujian kadar logam
tembaga dalam produk Air Minum Dalam Kemasan ini bertujuan untuk
mengevaluasi melalui studi laboratorium kesesuaian metode SNI 01-3554-
2006 butir 2.22.2.1 yang telah dikembangkan sebagai metode pengujian
standar di Laboratorium Penguji Aneka Komoditi Baristand Industri
Pontianak. Parameter validasi yang dilakukan meliputi akurasi, presisi,
recovery, liniaritas metoda, limit deteksi metoda, limit kuantisasi,
sensitifitas dan ketidakpastian pengukuran.

B. Rumusan masalah

1. Tekhnik validasi
2. Verivikasi metode pengujian spektrofotometer UV-AAS

C. Tujuan

1. Untuk mengetahui tekhnik validasi

2. Mengetahui verivikasi metode pengujian spektrofotomrter AV-ASS

D. Manfaat

Mahasiswa dapat mengetahui bagaimana manfaat /kegunaan tekhnik

validasi dan verivikasi metode pengujian spektrofotometer UV-AAS
 BAB II
PEMBAHASAN

A. TEKHNIK VALIDASI

Selama ini pengukuran kadar logam dalam lingkungan perairan dapat

dilakukan dengan berbagai metode. Ali (2017) telah menggunakan spektroskopi
absorbsi atom (AAS) untuk menentukan kadar logam berat di Sungai
Meghna Bangladesh, Guo (2017) menggunakan spektroskopi UV-Vis untuk
menentukan logam Cu, Ni dan Co, dan Santoyo (2000) menggunakan
kromatografi ion untuk menentukan logam berat pada air permukaan.
Sayangnya teknik AAS belum dapat digunakan untuk analisis secara simultan
meski pun memiliki limit deteksi yang rendah, sedangkan teknik kromatografi dan
spektorfotometri UV Vis dapat memberikan analisis simultan namun ke dua
teknik ini sering memerlukan prakonsentrasi contoh terlebih dahulu, penambahan
agen pengkompleks, atau derivatisasi sehingga teknik tersebut relatif menjadi
lebih rumit.

Kemajuan pada teknik spektroskopi atom dengan ditemukannya sumber

eksitasi baru berupa plasma memunculkan teknik analisis alternatif untuk
menentukan kadar logam berat menggunakan Inductively Coupled Plasma (ICP).
Sumber eksitasi pada ICP berupa plasma yang dihasilkan dari gelombang
elektromagnetik pembangkit frekuensi radio melalui kumparan induksi. Sumber
eksitasi ini menghasilkan nyala api dengan suhu tinggi, yang lebih tinggi
dibandingkan AAS, sehingga meminimalkan kemungkinan adanya gangguan
kimia serta meningkatkan sensitifitas metode.

Teknik ini memiliki kemampuan pengukuran analit secara simultan,

sensitivitas yang tinggi, dengan batas deteksi analit rendah sampai satuan ppb dan
dapat dilakukan secara mudah dan cepat. Teknik ini banyak digunakan untuk
analisis logam berat yang mempunyai nilai ekonomis tinggi seperti penentuan
lantanida atau aktinida (Archer et al, 2003). Namun, teknik ini juga mulai
digunakan untuk analisis logam berat yang umumnya ada di lingkungan perairan
seperti yang dilakukan oleh Botes and Staden (2004) dan Rinawati (2008)
 BAB II
PEMBAHASAN

B. METODE PENGUJIAN SPEKTROFOTOMETER UV-AAS

a. VALIDASI METODE PENGUJIAN LOGAM TEMBAGA PADA PRODUK

AIR MINUM DALAM KEMASAN SECARA SPEKTROFOTOMETRI
SERAPAN ATOM NYALA

Metode penelitian

Metode yang digunakan untuk melakukan validasi metode pengujian

kadar logam Tembaga dalam produk Air Minum dalam kemasan sesuai
SNI 01- ISSN 2089-0877 BIOPROPAL INDUSTRI Vol. 01, No. 02,
Desember 2010 33 3554-2006 butir 2.22.2.1 menggunakan AAS nyala.
Akurasi ditentukan menggunakan analisis Certified Reference Material
(CRM). Dilakukan analisis berulang sebanyak minimal enam kali ulangan
terhadap CRM yang memiliki konsentrasi analit dan matriks sama dengan
contoh uji. Reratakan kadar hasil uji, lalu uji beda nyata (t-student test) dengan
konsentrasi analit sebenarnya dalam CRM pada tingkat kepercayaan 95%.
Metode uji terbukti akurat jika rerata hasil uji tidak memberikan perbedaan
nyata dengan nilai analit sebenarnya. Presisi metode ditentukan melalui teknik
repitabilitas melalui cara suatu contoh homogen dan representatif dianalisis
sebanyak minimal enam kali ulangan oleh analis yang sama pada waktu yang
berdekatan, menggunakan peralatan dan pereaksi dari batch yang sama. Dari
hasil analisis berulang tersebut dihitung nilai Koefisien Variasi (CV) lalu
dibandingkan dengan nilai 2/3 x CVHorwitz.

Metode memiliki repeatability yang baik jika diperoleh nilai CV d 2/3

x CVHorwitz. Recovery ditentukan melalui cara suatu contoh homogen
dan stabil yang memiliki kandungan matriks mewakili dengan volume
yang cukup. Analisis dilakukan berulang sebanyak minimal enam kali
ulangan terhadap contoh tersebut guna menetapkan konsentrasi uji baseline,
kemudian ditambahkan analit dengan konsentrasi 0,40 mg/L ke dalam contoh
tersebut dan dilakukan analisis berulang minimal enam kali. Hasil pengukuran
kemudian dibandingkan terhadap konsentrasi analit teoritis yang ditambahkan
ke dalam contoh tersebut. Metode akurat jika didapat % recovery sesuai
syarat keberterimaan. Linieritas metode ditentukan melalui cara suatu
contoh homogen dan stabil yang memiliki kandungan matriks mewakili
dengan volume yang cukup. Analisis dilakukan berulang terhadap contoh
tersebut guna menetapkan konsentrasi uji baseline, dibuat preparat deret
kalibrasi dengan menambahkan secara kuantitatif analit standar yang
diketahui konsentrasinya secara pasti ke dalam contoh yang telah dipilih
tadi. Analit standar yang ditambahkan meliputi konsentrasi 0,10; 0,20; 0,30;
0,40; 0,50; 0,60; 0,75 dan 0,80 mg/L Cu.
 Dilakukan analisis pada masing-masing preparat menggunakan metode
yang akan divalidasi dengan jumlah pengulangan sebanyak dua kali. Dihitung
korelasi antara respon analitik rata-rata yang didapat dengan konsentrasi
teoretis analit dalam preparat. Metode dikatakan linier pada rentang
konsentrasi tertentu jika didapat nilai koefisien korelasi ( r ) t nilai tabel
Pearson. Limit Deteksi Metode (LOD) ditentukan dengan metode evaluasi
visual atau dikenal pula dengan teknik Trial & Error. LOD dievaluasi dengan
menambahkan ke dalam contoh analit standar pada berbagai level konsentrasi
rendah (0,0005, 0,001 dan 0,002 mg/L) yang diduga sebagai nilai LOD.
Dilakukan analisis berulang terhadap masing-masing preparat tersebut.
Konsentrasi analit terendah dalam contoh yang dapat terdeteksi oleh
mekanisme pengukuran analitik metode tersebut ditetapkan sebagai LOD.
Limit Kuantisasi Metode (LOQ) dievaluasi menggunakan teknik pendekatan
yang sama dengan LOD, hanya saja dalam LOQ nilai yang didapat harus
dibuktikan tingkat presisi dan akurasinya sebanyak minimal 7 kali
pengulangan.

Nilai yang didapat ditetapkan sebagai LOQ jika CV d 2 /3CVHorwitz dan

uji beda nyata menyatakan hasil tidak berbeda nyata. Sensitifitas ditentukan
melalui cara membuat larutan standar Cu dengan konsentrasi 0,1, 0,5, 1, 2, 3
dan 4 mg/L. Dilakukan analisis pada masing-masing preparat menggunakan
metode yang akan divalidasi dengan jumlah pengulangan sebanyak empat kali.
Dihitung sensitifitas kemudian dibandingkan terhadap sensitifitas alat. Metode
dinyatakan akurat jika didapat nilai sensitifitas kurang dari atau sama dengan
1,25 kali sensitifitas alat. Ketidakpastian pengukuran. Proses Estimasi
Ketidakpastian meliputi 4 tahap, yaitu (1) Penentuan spesifikasi kuantitas yang
diukur dengan formula/persamaan; (2) Identifikasi sumber-sumber kesalahan;
(3) Mengkuanti-sasikan masing-masing komponen ketidak-pastian kemudian
dinyatakan sebagai ketidakpastian baku (µ) lalu digabungkan semua
komponen ketidakpastian baku menjadi ketidakpastian baku gabungan (µc);
dan (4). Menghitung ketidakpastian yang diperluas ( U ). Ketidakpastian yang
diperluas inilah yang dinyatakan dalam pelaporan hasil uji (Sumardi, 2006).
b. VALIDASI METODE PENENTUAN Mn DALAM OLI LUBRIKAN
DENGAN METODE PENGENCERAN LANGSUNG MENGGUNAKAN
SPEKTROFOTOMETER SERAPAN ATOM

METODOLOGI PENELITIAN

Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah larutan blank oil,
larutan standar logam Mn 50 ppm, n-Heksan, Thinner, MIBK (Methyl
Isobutyl Ketone) dan sampel oli lubrikan yang diambil pada kompresor Train
G. PT Badak NGL Bontang dan aquabidest.

Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini diantaranya, gelas kimia, pipet
volume, pipet tetes, bulp, labu ukur, corong kaca, Spektrofotometer Serapan
Atom Agilent Spectra AA 220 FS, lampu katoda Mn.

Prosedur Kerja
Penentuan Pelarut Optimum Sebanyak 1 mL larutan larutan standar logam
conostan 50 ppm ditambahkan ke dalam masing-masing labu ukur. Setelah itu,
dilakukan pengenceran menggunakan pelarut n-Heksan, Thinner dan MIBK
(Methyl Isobutyl Ketone) pada masing-masing labu ukur hingga tanda tera
kemudian dihomogenkan. Kemudian, dilakukan pembacaan absorbansi
menggunakan pelarut nHeksan, Thinner dan MIBK (Methyl Isobutyl Ketone).

Optimasi Kinerja Analitik

Linearitas
Larutan blanko dan oli standar 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0 ppm yang telah
diencerkan menggunakan pelarut MIBK disiapkan. Setelah itu, dilakukan
analisis dengan AAS. Kemudian nilai konsentrasi dan absorbansinya dicatat.

Akurasi
Larutan spike dan larutan sampel yang dipersiapkan dianalisis dengan AAS
serta dicatat masing-masing nilai konsentrasi dan absorbansinya. Kemudian
dilakukan pembacaan absorbansi dan konsentrasi pada masing-masing larutan
sebanyak 10 kali. Nilai rata-rata konsentrasi digunakan untuk mentukan %
perolehan kembali.

Presisi
Larutan sampel yang telah diencerkan menggunakan pelarut MIBK dianalisis
dengan AAS serta dicatat nilai konsentrasi dan absorbansi untuk larutan
sampel. Kemudian dilakukan pembacaan absorbansi dan konsentrasi pada
masing-masing larutan sebanyak 10 kali. Setelah data diperoleh, dihitung
standard deviasi,% KV Horwitz dan 2/3 % KV Horwitz.
 Uji LOD
Pada uji LOD dilakukan secara statistik melalui garis regresi linier dari kurva
kalibrasi, dimana respon instrument y berhubungan linier dengan konsentrasi
x. Besar limit deteksi biasanya dinyatakan dengan 3 Sa/b, dimana Sa adalah
standar deviasi dan b adalah slope.

Uji LOQ
Pada uji LOD dilakukan secara statistik melalui garis regresi linier dari kurva
kalibrasi, dimana respon instrument y berhubungan linier dengan konsentrasi
x. Besar limit deteksi biasanya dinyatakan dengan 10Sa/b, dimana Sa adalah
standar deviasi dan b adalah slope.

Uji IDL dan MDL

Larutan blanko yang telah dipreparasi disiapkan. Kemudian analisa dilakukan
dengan SSA serta dicatat nilai konsentrasi dan absorbansinya untuk larutan
blank. Setelah itu, Pembacaan konsentrasi pada masing-masing larutan
sebanyak 10 kali dilakukan. Kemudian, nilai pada hasil pembacaan larutan
blank dicatat. Setelah itu, dilakukan perhitungan untuk mendapatkan nilai IDL
dan MDL. Lalu, larutan spike berdasarkan nilai IDL disiapkan. Kemudian
pembacaan konsentrasi dengan SSA pada masing-masing larutan sebanyak 7
kali dilakukan.

c. VERIFIKASI METODE ANALISIS LOGAM Pb, Cd, Cr, Cu, Ni, Co, Fe, Mn
DAN Ba PADA AIR MENGGUNAKAN INDUCTIVLY COUPLED
PLASMA-OPTICAL EMISSION SPECTROMETER(ICP-OES)

METODE

Bahan dan Alat

Bahan-bahan yang digunakan yaitu asam nitrat (HNO3) 65 % for analysis
EMSURE® ACS, ISO (1 L = 1,39 Kg), asam klorida (HCl) 37 % for analysis
EMSURE® ACS, ISO,Reag. PhEur (1 L= 1,19 Kg), multi-element standard
solution IV 1000 mg/L (23 element dalam asam nitrat), kertas saring whatman
No. 41 dan ultrapure water.

Alat-alat
Alat yang digunakan yaitu ICP-OES Varian 715-ES, Heavy Metal merk Behr,
botol HDPE dan alat-alat gelas.

Prosedur
Preparasi sampel :
Sebanyak 10 mL sampel air dimasukan ke labu destruksi, ditambahkan 0,2 mL
HNO3 (1+1) dan 0,1 mL HCl (1+1). Kemudian dilakukan destruksi dengan
heavy metal digester selama 15 menit dengan suhu 95oC. Sampel dibiarkan
sampai menjadi dingin. Sampel yang telah dingin kemudian disaring dengan
 kertas saring Whatman No.41 dan volume sampel ditepatkan menjadi 10,0 mL
dengan ultrapure water.

Preparasi Larutan Kerja Standar :

Larutan kerja standar dibuat dengan tehnik pengenceran bertingkat dari multi-
element standard solution IV 1000 mg/L yang diencerkan dengan HNO3 1%.
Konsentrasi larutan kerja standar yang digunakan adalah 0,01; 0,05; 0,10;
0,50; 1,00; 2,50 dan 5,00 mg/L.

Verifkasi Metode Analisis :

Parameter linieritas ditentukan dengan mengukur larutan kerja standar dengan

rentang konsentrasi 0,01 – 5,00 mg/L. Kemudian membuat kurva kalibrasi
dengan memplot intensitas terhadap konsentrasi standar sehingga diperoleh
koefisien regresi dari kurva kalibrasi. Parameter presisi dihitung menggunakan
teknik repeatabilty. Satu larutan sampel diukur sebanyak 8 kali. Teknik
spiking sampel digunakan untuk menentukan parameter akurasi. Sebanyak 5
mL larutan standar 25 mg/L dipipet ke labu 100 mL, ditambahkan sampel
sampai batas miniskus dan dihomogenkan. Larutan spiking ini dilakukan
destruksi seperti sampel sebanyak 8 kali. Batas deteksi (LoD) dan batas
kuantifikasi (LoQ) ditentukan dengan menggunakan sampel dengan
konsentrasi kecil yang diukur sebanyak 6 kali.

d. VALIDASI METODE ANALISIS UNTUK PENETAPAN KADAR

TABLET ASAM MEFENAMAT SECARA SPEKTROFOTOMETRI
ULTRAVIOLET

METODOLOGI PENELITIAN

Alat dan bahan

Alat yang digunakan adalah spektrofotometer UV Merk Shimadzu 00787,
Neraca analitik KERN ACJ 220- 4M, alat –alat gelas, mortir dan stamper.
Bahan yang digunakan adalah zat aktif asam mefenamat, 2 sampel tablet asam
mefenamat dagang, 2 sampel tablet asam mefenamat generik , metanol p.a,
Aquabidestilata (Otsuka).

Pengambilan Sampel
Sampel diperoleh dari apotekapotek di kota Manado. Sampel yang digunakan
yaitu asam mefenamat merk dagang dan generik dalam bentuk sediaan tablet.

Pembuatan larutan baku Asam mefenamat konsentrasi 250

ppm Ditimbang 12,5 mg zat aktif asam mefenamat dimasukkan kedalam labu
ukur dan tambahkan 50 mL metanol, dikocok hingga homogen sehingga
diperoleh konsentrasi 250 ppm yang akan digunakan untuk pembuatan seri
konsentrasi.

Penetapan panjang gelombang maksimum

Dari larutan baku asam mefenamat 250 ppm diambil 0,36 mL lalu diencerkan
dengan metanol sampai volume 10 mL hingga diperoleh konsentrasi 9 ppm.
Larutan dengan konsentrasi 9 ppm tersebut dikocok hingga homogen dan
dimasukkan kedalam kuvet kemudian dibaca absorbansinya pada panjang
gelombang 200 – 400 nm.

Penetapan Operating time

Dari larutan baku 250 ppm diencerkan menjadi konsentrasi 11 ppm dengan
cara diambil 0,44 mL larutan 250 ppm, tambahkan metanol sampai volume 10
mL kocok hingga homogen lalu dibaca absorbansinya sampai hasil absorbansi
yang diperoleh relatif konstan dengan rentang waktu 1 menit.

Pembuatan Kurva Baku

Dari larutan baku 250 ppm dibuat seri konsentrasi 5, 7, 9, 11 dan 13 ppm
dengan cara diambil 0,2 mL larutan baku kemudian encerkan dengan metanol
sampai 10 mL untuk konsentrasi 5 ppm selanjutnya untuk konsentrasi 7, 9, 11
dan 13 ppm dilakukan cara yang sama lalu dibaca absorbansinya pada panjang
gelombang maksimum. Dari data hasil absorbansi dapat dihitung persamaan
kurva bakunya sehingga diperoleh persamaan garis y = bx+a.

Ketelitian (precision)
Dari larutan baku asam mefenamat 250 ppm dibuat larutan baku dengan
konsentrasi 11 ppm dengan cara seperti pada pembuatan seri konsentrasi.
Larutan baku asam mefenamat dengan konsentrasi 11 ppm tersebut dibaca
absorbansinya pada panjang gelombang maksimum. Uji ketelitian ini
dilakukan dengan lima kali pengulangan.

Ketepatan (Accuracy)
Ditimbang 12,5 mg zat aktif asam mefenamat secara duplo dan masing –
masing dimasukkan kedalam labu takar, pada salah satu labu takar
ditambahkan 5 mL larutan baku asam mefenamat konsentrasi 250 ppm. Kedua
sampel tersebut ditambahkan metanol hingga volume 50 mL. Dikocok hingga
homogen kemudian dari masing – masing larutan tersebut diambil 0,2 mL dan
diencerkan dengan metanol hingga volumenya tepat 10 mL lalu dibaca
absorbansinya pada panjang gelombang maksimum. Uji ketepatan metode
dilakukan dengan penambahan larutan baku 250 ppmdengan 5 kali
pengulangan. Hasil absorbansi digunakan untuk menghitung persen perolehan
kembali.
e. Validasi Metode Bioanalisis Vankomisin dalam Spiked-plasma Manusia
Menggunakan Kromatografi cCair Kinerja Tinggi-detektor UV untuk Aplikasi
Pemantauan Kadar Obat dalam Darah

Metode Penelitian

Alat dan Bahan

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain standar
vankomisin (grade BPFI, BPOM), plasma darah (PMI Kab. Sleman),
asetonitril (pro LC, J.T. Baker), akuabidestilata (Ikapharmindo Putramas,
Indonesia), kalium dihidrogen fosfat (pro analisis, Merck), asam ortofosfat
(pro analisis, Merck), metanol (pro LC, J.T. Baker), diklorometan (pro
analisis, Merck), dan asam klorida (pro analisis, Merck).

Penentuan kadar vankomisin dalam plasma menggunakan instrumen

KCKT-UV (waters Alliance e2695) fase terbalik dengan kolom C18 (Xterra®
250x4,6 mm, 5 μm). Pembacaan standar dan sampel menggunakan fase gerak
campuran 5 mM dapar fosfat pH 3 dan metanol (80:20 v/v) pada suhu kamar,
panjang gelombang 213 nm dengan volume injeksi 20 μL.

Prosedur

Penyiapan Sampel plasma

Plasma manusia diperoleh dari Palang Merah Indonesia (PMI) Kabupaten
Sleman, yang berasal dari pendonor sehat yang telah mengisi formulir dan
memenuhi kriteria inklusi dan ekslusi.

Kurva Baku spiked-plasma Vankomisin dan Linieritas Metode Analisis

Dibuat larutan stok vankomisin 1000 µg/mL untuk membuat larutan stok
kerja vankomisin 100 µg/mL menggunakan pelarut fase gerak. Dipipet
sejumlah larutan stok kerja lalu ditambahkan plasma hingga mencapai volume
akhir 200 mikroliter untuk membuat seri kadar spiked-plasma vankomisin
pada konsentrasi 0, 3, 10, 20, 30, 50, dan 60 μg/mL. Nilai linearitas
ditentukan dengan menggunakan least square method dari kurva baku
tersebut.

Selektivitas, Akurasi, dan Presisi Metode Analisis

Sebanyak 6 larutan spiked-plasma vankomisin pada konsentrasi 3 μg/mL
yang berasal dari individu yang berbeda disiapkan untuk pengujian
selektivitas metode. Disiapkan pula 4 larutan sampel spiked-plasma pada
konsentrasi 3,0; 15,0; 31,5; 48,0 μg/mL sebagai konsentrasi LLoQ (Lower
Limit of Quantification), QCL (Quality ControlLow), QCM (Quality Control-
Medium), dan QCH (Quality Control-High). Dilakukan pengujian akurasi dan
presisi metode sebanyak 5 kali replikasi pada keempat konsentrasi tersebut
selama 3 hari.
Stabilitas
Disiapkan 2 larutan sampel spiked-plasma pada konsentrasi QCL dan QCH
untuk uji stabilitas jangka pendek, jangka panjang, siklus bekucair, dan paska
preparasi vankomisin. Pada uji stabilitas jangka pendek, sampel disimpan
pada suhu kamar (25oC), kemudian pengujian dilakukan pada jam ke- 0, 6,
dan 24 dengan dibuat sebanyak 3 replikasi untuk masingmasing konsentrasi.
Sementara itu, untuk uji stabilitas jangka panjang, sampel disimpan pada suhu
-20oC dan pengujian dilakukan pada hari ke- 0, 7, 14, dan 21. Seperti halnya
pada uji stabilitas jangka pendek, pada pengujian ini juga dibuat sebanyak 3
replikasi untuk masing-masing konsentrasi. Sedangkan pada uji stabilitas
beku-cair dilakukan dengan menyimpan sampel pada suhu -20oC selama 24
jam selanjutkan dibiarkan mencair pada suhu kamar (25oC) untuk
memperoleh 1 siklus. Hal ini dilakukan sebanyak 3 kali siklus beku-cair
dengan pengujian dilakukan pada siklus ke- 0, dan 3 pada masing-masing
konsentrasi dengan 3 kali replikasi. Untuk uji stabilitas paska preparasi
dilakukan dengan menyimpan sampel yang telah diekstraksi dalam wadah
autosampler pada suhu kamar (25oC) selama 24 jam. Pengujian dilakukan
pada jam ke- 0, 6, dan 24 paska penyiapan sampel dengan 3 replikasi pada
masing-masing konsentrasi.

Penentuan Kadar Vankomisin dalam Spiked-plasma

Sebanyak 200 µL sampel spikedplasma vankomisin di dalam mikrotube
ditambahkan pelarut 400 µL metanol sebagai pengendap protein. Campuran
divortex selama 1 menit dan disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm
selama 10 menit. Sebanyak 400 µL supernatan diambil dan ditambahkan
pelarut 500 µL HCl pH 3 dan 1 mL diklorometan. Kemudian campuran
divortex selama 1 menit dan disentrifugasi dengan kecepatan 4000 rpm
selama 10 menit. Fase air diambil dan disaring menggunakan syringe filter
 BAB III
PENUTUP

A. Kesimpulan

Spektrofotometri merupakan salah satu metode dalam kimia analisis yang

digunakan untuk menentukan komposisi suatu sampel baik secara kuantitatif dan
kualitatif yang didasarkan pada interaksi antara materi dengan cahaya. Cahaya yang
dimaksud dapat berupa cahaya visibel, UV dan inframerah, sedangkan materi dapat
berupa atom dan molekul namun yang lebih berperan adalah elektron valensi. Pada
spektrofotometri ini yang digunakan sebagai sumber sinar/energi adalah cahaya
tampak (visible). Cahaya visible termasuk spektrum elektromagnetik yang dapat
ditangkap oleh mata manusia. Panjang gelombang sinar tampak adalah 380 sampai
750 nm. Sehingga semua sinar yang dapat dilihat oleh kita, baik itu putih, merah, biru,
hijau, apapun, selama ia dapat dilihat oleh mata, maka sinar tersebut termasuk ke
dalam sinar tampak (visible)

B. Saran

Saran yang dapat diberikan adalah kebersihan kuvet harus diperhatikan,

karena dapat menyebabkan kesalahan pembacaan absorbansi dan transmitansi pada
alat spektrofotometer. Serta ketelitian dalam proses penyiapan larutan standar maupun
sampel.
 DAFTAR PUSTAKA

https://media.neliti.com/media/publications/54726-ID-none.pdf

file:///C:/Users/ASUS/Downloads/717-Article%20Text-3201-4-10-
20190207.pdf

file:///C:/Users/ASUS/Downloads/1668-3712-1-SM.pdf

file:///C:/Users/ASUS/Downloads/11993-27920-1-PB.pdf

10204-20321-1-SM.pdf

http://eprints.undip.ac.id/47790/8/BAB_VII.pdf