Petunjuk

Praktikum

Mikroteknik
Prodi S1 Biologi
Disusun Oleh :
Tim Mikroteknik 2021

KEMENTERIAN PENDIDIKAN, KEBUDAYAAN,

RISET DAN TEKNOLOGI
UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN
FAKULTAS BIOLOGI
PURWOKERTO
2021
 KATA PENGANTAR

Mikroteknik pada kurikulum 2013 Program Studi S1 Fakultas Biologi

Unsoed merupakan salah satu mata kuliah memperluas wawasan (pilihan).
Mata kuliah ini membekali mahasiswa dengan pengetahuan dan ketrampilan
dalam pembuatan sediaan histologi baik dari jaringan hewan maupun
tumbuhan, sedangkan pada kurikulum 2018 merupakan salah satu mata kuliah
wajib.
Sebagai mata kuliah yang berbasis pada ketrampilan maka bobot
praktikum menjadi sangat esential. Oleh karena itu Petunjuk Praktikum ini
disusun sebagai pedoman dalam pelaksanaan praktikum. Materi praktikum
dikembangkan dari teori dan praktikum standar dengan memodifikasi beberapa
aspek dalam prosedur standar berdasarkan hasil-hasil penelitian dosen mapun
mahasiswa yang dilakukan di Laboratoium Struktur dan Perkembangan Hewan,
Laboratorium Struktur dan Perkembangan Tumbuhan, Fakultas Biologi Unsoed.
Pengalaman adalah guru yang terbaik, oleh karena itu segala masukan
dari para kolega dan praktisi yang bergerak di bidang mikroteknik/histologi
akan sangat kami hargai dan kami gunakan untuk penyempurnaan petode
mikroteknik yang kami asuh. Semoga Petunjuk Praktikum ini dapat digunakan
sebagaimana mestinya.

Purwokerto, Mei 2021

Tim Penyusun

2
 TATA TERTIB PRAKTIKUM

Demi kelancaran, keamanan dan keselamatan pengguna laboratorium,

maka peserta praktikum maupun pengelola praktikum diwajibkan untuk
mematuhi tata tertib praktikum yang meliputi :

A. Praktikan
1. Sebelum pelaksanaan praktikum, setiap praktikan diwajibkan
mengikuti kegiatan asistensi pada waktu yang telah dijadwalkan.
2. Setiap praktikan wajib hadir dan mengikuti kuis pada setiap acara
praktikum. Kehadiran praktikan dicatat dalam buku kehadiran dan
kartu peserta praktikum.
3. Selama kegiatan praktikum berlangsung, praktikan harus
memperhatihkan hal-hal sebagai berikut:
a. Selama kegiatan praktikum setiap praktikan diwajibkan
mengenakan jaslab
b. Kemikalia yang tergolong berbahaya seperti larutan xilol, HCl
pekat, NaOH pekat, dan paraffin cair hendaknya diperlalukan
dengan hati-hati
c. Pada saat menggunakan peralatan, patuhi Standar Operasional
Prosedur (SOP) yang tersedia atau petunjuk asisten pendamping
praktikum demi keselamatan pribadi dan sesama pengguna
laboratorium lainnya.
d. Pada saat melakukan pengirisan jaringan hendaknya berhati-hati
agar tidak terluka oleh pisau mikrotom.
e. Pada saat melalukan embedding hendaknya menangani parafin cair
dengan hati-hati.
f. Semua pengguna Laboratorium tidak diperkenankan merokok dan
atau mengkonsumsi makanan/minuman di dalam ruang
laboratorium.
g. Apabila karena keteledoran/kecerobohannya, praktikan
menumpahkan kemikalia dan atau merusakkan peralatan
laboratorium, maka mahasiswa tersebut wajib melapor kepada
koordinator praktikum dan mengganti kemikalia/peralatan
tersebut.
h. Setiap selesai menggunakan peralatan praktikan wajib
membersihkan atau mencuci peralatan yang digunakannya dan
mengembalikan kepada asisten pendamping.
4. Setelah selesai acara praktikum, praktikan wajib membuat laporan
praktikum dan diserahkan kepada asistem pendamping pada waktu
yang telah ditetapkan.
5. Setelah seluruh rangkaian acara kegiatan praktikum selesai, praktikan
diwajibkan mengikuti ujian akhir praktikum.
6. Setiap praktikan wajib menjaga kebersihan laboratorium.

3
B. Asisten Pendamping
1. Asisten pendamping diwajibkan hadir pada setiap acara praktikum
selambat-lambatnya 15 menit sebelum acara praktikum dimulai.
Apabila asisten berhalangan hadir, dianjurkan untuk memberitahu
koordinator praktikum.
2. Asisten pendamping berkewajiban memandu pelaksanaan praktikum
dan membantu praktikan bila dijumpai hal-hal yang kurang dipahami
oleh praktikan.
3. Pasa setiap acara praktikum, asisten memberikan soal kuis dan
mengkoreksi jawaban kuis.
4. Asisten mengawasi dan menjaga kelancaran serta ketertiban jalannya
praktikum.
5. Aisten menerima, mengkoreksi dan menilai laporan praktikum dari
setiap praktikan.
6. Pada akhir rangkaian kegiatan praktikum, asistem menyelenggarakan
ujian khir praktikum.
7. Setelah ujian akhir praktikum, asisten melakukan rekap seluruh
komponen nilai praktikum yang meliputi: kuis setiap acara praktikum,
aktivitas praktikan, laporan praktikum dan ujian akhir praktikum.
8. Asisten menyerahkan nilai praktikum kepada koordinator praktikum
atau dosen pengampu mata kuliah.
9. Asisten wajib menjada kebersihan laboratorium.

Hal-hal lain yang belum termasuk dalam tata tertib ini dan dipandang
perlu untuk kelancaran, keamanan dan ketertiban praktium dapat ditambahkan
kemudian. Demikian tata tertib inin dibuat untuk diketahui dan dipatuhi
bersama. Atas perhatian dan kerjasamanya diucapkan terima kasih.

4
 DAFTAR ISI

Halaman

PENDAHULUAN ..................................................................................................................... 6
ACARA I. PREPARAT APUS ................................................................................... 9
ACARA II. PREPARAT RENTANG .......................................................................... 14
ACARA III. PREPARAT PEMBELAHAN (Metode Squash) ............................. 18
ACARA IV. PREPARAT POLLEN (Metode Asetolisis) ..................................... 20
ACARA V. PREPARAT IRISAN UNTUK HEWAN (Metode Parafin,
Bagian 1) .................................................................................................... 23
PENGIRISAN SAMPEL (Metode Parafin, Bagian 2) .................. 27
ACARA VI. PEWARNAAN UNTUK HEWAN (Metode Parafin) .................... 31
ACARA VII PREPARAT IRISAN UNTUK TUMBUHAN (Metode Parafin) ... 35
ACARA VIII. INDEKS STOMATA ................................................................................ 42
ACARA IX. MIKROMETRI .......................................................................................... 44
ACARA X. PREPARAT AWETAN TUMBUHAN (Non Embedding) ........... 46
DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................................... 47
LAMPIRAN ........................................................................................................................ 48

5
 PENDAHULUAN

Mikroteknik merupakan salah satu ketrampilan yang sangat dibutuhkan

oleh mahasiswa ataupun peneliti yang bergerak dibidang biologi
perkembangan, struktur hewan ataupun tumbuhan, histopatologi maupun
patologi klinis.
Sediaan sitologis/histologis bukan hanya sebagai alat diagnostik tetapi
juga merupakan bahan ajar yang dapat membantu para siswa untuk memahami
berbagai bentuk, ukuran dan sifat sel serta tipe, komponen dan susunan
jaringan yang menyusun organ tubuh suatu individu. Agar dapat memahami
dengan baik hasil dari sediaan sitologis ataupun sediaan histologis, seseorang
harus memiliki pemahaman yang memadai tentang struktur dan sifat sel
ataupun jaringan. Pemahaman tentang struktur dan sifat sel ataupun jaringan
akan sangat menentukan ketepatan interpretasi terhadap sediaan sitologis
maupun sediaan histologis yang diperoleh.

Mikroteknik dikembangkan lebih dari seabad yang lalu, dalam

perjalanannya metode ini banyak mengalami perkembangan seiring dengan
berkembangannya peralatan mikroskopis, metode pewarnaan dan peningkatan
pemahaman tentang sifat dan perilaku sel ataupun jaringan. Perkembangan
informasi tentang sifat biokimiawi sel dan reaksi enzimatik memungkinkan
dilakukannya sitokimia/histokimia untuk mengidentifikasi senyawa-senyawa
yang terkandung dalam suatu sel ataupun jaringan. Perpaduan antara
mikroteknik dengan immunologi telah memunculkan teknik baru yang dikenal
dengan imunositokimia dan imunohistokimia (immunocytochemistry/
immunohistochemistry). Melalui teknik ini kita dapat mendeteksi ada tidaknya
suatu perotein tertentu sekaligus menentukan lokasi protein tersebut di dalam
sel/jaringan. Perpaduan antara mikroteknik dengan biologi molekuler
memungkinkan kita untuk mendeteksi kapan dan dimana suatu gen melakukan
aktivitasnya melalui suatu teknik yang dikenal dengan hibridisasi in situ (in situ
hybridisation). Kenyataan tersebut menunjukkan bahwa pada era molekuler
seperti sekarang ini sediaan histologis masih relevan dan tetap dibutuhkan.

6
 Praktikum Mikroteknik (Hewan maupun Tumbuhan) diselenggarakan
dengan tujuan untuk membekali mahasiswa dengan ketrampilan dalam
pembuatan sediaan histologi baik dalam bentuk preparasi apus, squash/pencet,
rentang ataupun irisan (dengan embedding/penyelubungan) maupun non
embedding; melatih mahasiswa dalam menghitung, mengamati indeks stomata,
trampil mengoperasikan micrometer untuk peneraan besaran mikroskopis dari
struktur yang diamati dan mengkalibrasikan micrometer tersebut sebelum
digunakan, juga dalam kerja tim dan melatih mahasiswa mengefisienkan
manajemen waktu.
Output yang diharapkan adalah setelah pelaksanaan praktikum
mahasiswa mampu secara mandiri membuat sediaan histologi, mengevaluasi
sediaan histologi dan menginterpretasikan hasilnya.
Mengingat banyaknya metode dalam mikroteknik yang semakin
berkembang maka dalam praktikum ini hanya diberikan metode standar yang
perlu diketahui sebagai dasar untuk pengembangan selanjutnya. Adapun acara
Praktikum yang telah disusun meliputi:
1. Pembuatan preparat apus
2. Pembuatan preparat rentang
3. Pembuatan preparat pembelahan (metode pencet/squash)
4. Pembuatan preparat pollen (metode asetolisis)
5. Menghitung indeks stomata
6. Mikrometri
7. Pengambilan sampel jaringan dan pemrosesan jaringan menggunakan
metode parafin (penyelubungan/embedding)
8. Pembuatan sampel tanpa penyelubungan/non embedding
9. Pengirisan blok jaringan
10. Pewarnaan jaringan
11. Evaluasi hasil preparasi
Demi efisiensi dan efektivitas pelaksanaan praktikum maka paktikum
dilaksanakan dalam shift. Setiap shift terdiri atas 20-25 mahasiswa yang
dikelompokkan dalam 3-5 kelompok. Masing-masing kelompok akan
didampingi oleh minimal satu orang asisten praktikum.

7
 ACARA I. PREPARAT APUS

Kompetensi
Pada acara I adalah tentang pembuatan preparat apus darah.
Kompetensi dari acara praktikum ini adalah agar mahasiswa dapat mengkaji
proses diferensiasi sel-sel darah selama masa perkembangan dan juga dapat
mendiagnosis penyakit tertentu.

Pendahuluan
Preparat apus merupakan metode untuk mengevaluasi sediaan berupa
sel dalam keadaan utuh. Preparat apus yang sering dilakukan adalah apus
darah untuk melihat bentuk-bentuk sel darah; apus bukal untuk mengamati sel-
sel mukosa pada rongga mulut dan apus vagina untuk mengamati tipe sel dan
proporsi masing-masing sel yang diperoleh dari apusan epitelium vagina
sebagai metode untuk mengetahui tahapan siklus estrus pada hewan tertentu.
Dalam praktikum ini hanya akan dilakukan pembuatan preparat apus darah.

Pembuatan preparat apus darah

Preparat apus darah dapat digunakan untuk mengkaji proses diferensiasi

sel-sel darah selama masa perkembangan dan juga digunakan untuk diagnosis
penyakit tertentu. Diagnosis penyakit yang membutuhkan konfirmasi melalui
pembuatan apus darah antara lain: dugaan anemia dan jaundice, dugaan adanya
penyakit sickle, dugaan lymphoma, thrombocytopenia, dan penyakit
myeloproliferative, dugaan koagulasi intravaskuler, gagal ginja akut pada anak-
anak. Aspek yang diamati dalam uji apus darah meliputi proporsi jenis, bentuk
dan ukuran sel darah. Sumber darah yang digunakan untuk keperluan apus
darah pada manusia biasanya diambil dari ujung jari tangan atau pembuluh
vena (bila secara bersamaan juga dilakukan uji kimia darah), pada bayi sampel
darah dapat diambil dari tungkai. Pada hewan mammalia, sampel darah dapat
diambil dari cuping telinga atau pembuluh vena pada bagian ekor.

8
 Jumlah darah yang diperlukan untuk pembuatan apusan cukup beberapa
tetes. Prosedur pembuatan apus darah meliputi pembuatan apusan di atas
gelas benda, fiksasi, dan pewarnaan. Cara pembuatan apusan dapat dilihat pada
Gambar 1.
Bahan Praktikum
1. Darah ikan, aves (ayam) dan mamalia (kelinci atau manusia)
2. Pewarna Giemsa, air kran, metanol.
Peralatan Praktikum
1. Gelas objek (object glass) dan gelas penutup (cover glass/cover slip)
2. Jarum Franke steril (sebelum digunakan ujung jarum dibersihkan
dengan larutan alkohol 70%)
3. Pipet tetes
4. Staining jarr
5. Kertas penghisap
6. Mikroskop cahaya

Cara kerja Praktikum

1. Setiap kelompok praktikum mempersiapkan 6 gelas objek yang masih
baru, kemudian dibersihkan dengan kapas yang dibasahi dengan larutan
alkohol 70% dan dikering udarakan.
2. Pengambilan sampel darah. Apabila sampel darah diambil dari manusia
maka sebelum dilakukan pengambilan darah, tangan probandus dicuci
bersih menggunakan sabun dan dibilas dengan air mengalir. Usap ujung
jari yang akan diambil darahnya dengan kapas yang telah dibasahi
dengan alkohol 70%. Darah diambil dari ujung jari no 2 atau 3 atau 4
dengan cara menusuk salah satu jari tersebut menggunakan jarum
Franke yang telah disterilkan menggunakan larutan alkohol 70%.
Penusukan dilakukan sedemikian rupa sehingga setidaknya ujung jarum
dapat masuk sedalam 2-3 mm. Sampel darah kelinci diambil dengan cara
yang sama dengan pengambilan darah dari jari manusia tetapi darah
diampil dari cuping telinga. Sampel darah ikan diambil dengan
menggunakan jarum injeksi ikuran 1 ml dengan menusukkannya pada
daerah di belakang sisip anal tegak lurus ke arah dorsal hingga mencapai

9
 pembuluh darah vena kaudal. Sampel darah ayam diambil menggunakan
jarum injeksi dari vena jugularis.
3. Tetesan darah pertama hingga ketiga dihapuskan pada kertas serap.
Tetesan berikutnya diteteskan di atas salah satu ujung gelas benda,
sedemikian rupa sehingga tetesan merupakan lingkaran dengan
diameter ±3-5 mm.
4. Letakkan gelas benda yang lain pada tepi/sisi yang pendek di muka
tetesan darah tersebut di atas, kemudian tariklah sedikit kebelakang
hingga gelas benda kedua mencapai bagian tengah dari tetesan darah
agar timbul gerakan kapiler yang menungkinkan darah menyebar
merata ke kiri dan kanan gelas benda pertama. Sudut di antara kedua
gelas benda sebaiknya sekitar 45°. Bila sudut di antara kedua gelas
benda tadi terlalu besar maka film/apusan akan terlalu tebal sedangkan
bila sudutnya terlalu kecil maka apusan menjadi terlalu tipis. Gelas
benda kedua sebaiknya menggunakan gelas benda dengan kedua sudut
yang terpotong sehingga apusan tidak selebar gelas benda pertama.
5. Doronglah gelas benda kedua sesuai dengan arah sudut dari kedua gelas
benda dengan kekuatan dan kecepatan yang konstan sehingga dapat
diperoleh apusan yang rata.
6. Apusan dikering udarakan kemudian difiksasi dengan larutan metanol
selama 3-5 menit, dikering udarakan kemudian diwarnai dengan
meneteskan larutan Giemsa di atas apusan dan didiamkan selama 10
menit atau hingga bagian tepi pewarna telah tampak mengering. Bilas
pewarma dengan air mengalir pada debit kecil.
7. Apusan yang telah terwarna dikeringudarakan kemudian diamati di
bawah mikroskop cahaya dengan perbesaran rendah kemudian dengan
perbesaran tinggi. Identifikasi tipe sel darah yang tampak, amati
penyerapan warnanya dan hitung proporsi masing-masing tipe sel.
Preparat difoto sebagai dokumentasi dan bahan laporan.
8. Catat hasilnya dan serahkan salinannya kepada asisten sebagai laporan
sementara.

10
Gambar 1. Cara pembuatan preparat apus darah

Gambar 2. Pengambilan darah pada manusia

Gambar 3. Pengambilan darah pada ayam

Gambar 4. Pengambilan darah pada Ikan

11
Gambar 5. Pengambilan darah pada ular, kura-kura, kadal dan katak (Dyer &
Cervasio, 2008)

Gambar 6. Preparat apus darah ayam (A) dan darah manusia (B)

12
 ACARA II. PREPARAT RENTANG

Pendahuluan
Preparat ini biasanya dibuat pada saat dilakukan pembedahan (sectio).
Jaringan yang dapat digunakan untuk preparat rentang antara lain jaringan sub-
cutis (jaringan ikat longgar atau jaringan yang mengandung sel-sel lemak),
mesenterium, dan pericardium.
Pembuatan preparat rentang biasanya dilakukan pada pengujian secara
sitokimia untuk melihat adanya enzim-enzim misalnya phosphatase dan
hyaluronidase, ataupun pada pengujian sitologis/histologis untuk melihat
morfologi sel mast, fibroblast, histiocytes, macrophage, serabut kolagen, serabut
elastin, serabut retikuler ataupun matriks jaringan ikat. Metode ini digunakan
untuk mengevaluasi abnormalitas jaringan dan keberadaan parasit tertentu.

Pembuatan preparat rentang membutuhkan ketrampilan dan seni

tersendiri karena jaringan yang digunakan pada umumnya sangat tipis dan
mudah robek (misalnya mesenterium dan perikardium) meskipun demikian
kedua jaringan ini relatif mudah menyerap pewarna. Jaringan sub-cutis relatif
lebih mudah diambil namum keberadaan lemak pada pada jaringan seringkali
pengganggu pada proses pewarnaan dan mounting.

Preparat rentang dihasilkan melalui beberapa tahapan meliputi:

pengambilan jaringan, perentangan jaringan di atas gelas benda, fiksasi
jaringan, pewarnaan, dehidrasi, penjernihan dan penutupan dengan gelas
penutup. Pengambilan jaringan, perentangan dan fiksasi harus dilakukan
sesegera mungkin setelah hewan dimatikan, hal ini untuk menjaga kesegaran
jaringan sehingga jaringan yang diperoleh tidak rusak. Kondisi ini diperlukan
agar struktur dan biokimiawi jaringan sedapat mungkin mendekati kondisi
sebagaimana pada saat hewan tersebut hidup. Keterlambatan pengambilan
jaringan dan fiksasi akan menghasilkan jaringan yang berada pada kondisi post-
mortem. Larutan fiksatif yang sering digunakan adalah metanol sedangkan
pewarna yang sering digunakan adalah Mallory Triplestains dan Mason’s
Trichrome. Dengan pewarna Mallory, fibril yang mengandung kolagen akan

13
terwarna biru kuat; tulang rawan, tulang, mukus dan amiloid terwarna biru
samar; nukleoli, inti sel, mioglia dan fibrin terwarna merah; korpuskula darah
dan myelin terwarna kuning sedangkan fibril elastin terwarna merah muda
pucat, kuning pucat atau tak terwarna. Dengan pewarna Mason’s Trichrome,
inti sel terwarna hitam; granula argentaffin terwarna hitam atau merah;
sitoplasma serabut neuroglia, keratin dan serabut interseluler terwarna merah
terang; kolagen terwarna biru kuat dan mukus terwarna biru sedangkan
aparatus golgi jernih atau tak terwarna.

Bahan Praktikum
1. Jaringan sub-cutis pada ayam dan mesenterium ikan
2. Pewarna Malory Triple Stain
3. Larutan alkohol bertingkat (70, 90, 100%), larutan Xylol dan entelan new

Peralatan Praktikum
1. Pisau dan alat bedah (dissecting kit)
2. Gelas benda dan gelas penutup
3. Staining jar
4. Kertas tissue
5. Mikroskop cahaya
6. Pengukur waktu (timer)

Cara Kerja Praktikum

1. Siapkan gelas benda dan gelas penutup yang baru dan bersihkan dengan
larutan alkohol 70%.
2. Potong (sembelih) ayam menggunakan pisau dan matikan ikan.
3. Bedah ayam dan ikan menggunakan alat bedah yang telah disediakan
sehingga rongga abdomennya dapat terlihat dengan jelas.
4. Ambil jaringan sub-cutis ayam selebar 3 cm2 atau mesenterium ikan,
kemudian langsung rentangkan di atas gelas benda sedatar dan setipis
mungkin.

14
 5. Fiksasi jaringan dalam larutan metanol selama maksimal 3 menit. Selain
metanol dapat pula digunakan fiksatif Formon-Calcium tergantung aspek
yang akan diamati.
6. Warnai dengan 0,1 % Acid Fuchsin akuosa selama 3 - 5 menit dan cuci
dengan akuades.
7. Masukkan ke dalam PMA (Phospho Molybdic Acid) 1% selama 5
menit, dicuci dengan aquades.
8. Pindahkan ke dalam pewarna Malory (Campuran dari: Orange G 2,0 gr,
Aniline blue 0,5 gr, Aquadest 100,0 cc, Acidum Aceticum Glaciale 7,5
cc) selama 2 menit.
9. Pindahkan ke dalam larutan alkohol 95% beberapa celupan.
10. Dehidrasi dalam larutan alkohol 100% selama ± 1 menit, jernihkan
dalam larutan xylol, kemudian tutup dengan gelas penutup
menggunakan perekat entelan new atau Canada balsam.
11. Amati preparat rentang yang telah terwarna di bawah mikroskop cahaya
dan amati komponen-komponen yang terlihat beserta spesifikasi
warnanya.
12. Catat komponen jaringan yang anda amati beserta masing-masing
warnanya dan serahkan salinannya kepada asisten sebagai laporan
sementara.
13. Foto preparat untuk laporan penelitian.

Catatan :

Dengan pewarnaan Mallory maka :

Warna Biru kuat : fibril yang mengandung kolagen.
Warna Biru samar : tulang rawan, tulang, mukus dan amiloid.
Warna Merah : nukleoli, inti sel, mioglia dan fibrin.
Warna Kuning : korpuskula darah dan myelin.

Fibril elastin : terwarna merah muda pucat, kuning pucat atau tak
terwarna.

15
 ACARA III. PREPARAT PEMBELAHAN
(METODE SQUASH)

Pendahuluan
Pada saat sel membelah, kromosom relatif mudah diamati dengan
memperlakukan sel-sel tersebut dengan metode fiksasi dan pewarnaan
sederhana. Bahan dasar yang sering dipakai dalam mengamati pembelahan
mitosis adalah ujung akar bawang merah atau bawang bombay, sedangkan
untuk mengamati pembelahan meiosis dapat digunakan kepala sari dari suatu
bunga.
Pembuatan preparat pembelahan dengan metode squash (pencet),
adalah teknik pembuatan preparat dengan menggunakan metode pencet atau
menekan bahan yang akan digunakan sampai membentuk lapisan yang sangat
tipis sehingga bagian tersebut terlihat dengan jelas. Bagian ujung akar sering
digunakan untuk mengamati pembelahan mitosis. Pewarnaan yang digunakan
untuk memperjelas bagian-bagian kromosom biasanya digunakan aceto-carmin
atau orceto-orcein.

Bahan Praktikum
1. Ujung akar; 3 mm dari ujung untuk mengamati pembelahan mitosis.
(Pengambilan siang jam 14.00 WIB)
2. Anthera sebelum mikrosporogenesis untuk mengamati pembelahan
meiosis. (Pengambilan antara 08.00 – 11.00 WIB)
3. Zat warna aceto-carmin atau orceto-orcein, HCl.

Peralatan Praktikum
1. Gelas arloji
2. Botol fiksasi
3. Batang pengaduk
4. Erlenmeyer
5. Kaca benda dan kaca penutup
6. Mikroskop cahaya
7. Kerta tissue

16
Cara Kerja Praktikum
Hari ke 1 : FIKSASI
Dipakai larutan Farmers (Farmers solution)
 Alkohol Absolut .......................................... 3 bagian
 Glacial acetid acid .................................... 1 bagian
Selama 1-14 jam, setelah itu dipindahkan ke dalam alkohol 70
%.
Hari ke 2 : Hydrolisa dengan menggunakan HCl. (Campuran 5 cc HCl pekat
dengan 55 cc aquadest). Panaskan pada temperatur 60 %
selama 30 detik.
Kemudian pewarnaan dengan acetocarmin/ orcetoorcein.
Setelah dihancurkan/disquash dengan menggunakan jarum
preparat (yang gepeng)
Mounting dengan menggunakan Hoyer’s medium yang terdiri
dari :
 Destilied water ----------------------------------------------- 50 ml
 Arabic gum ----------------------------------------------------- 30 gr
 Chloral hydrate ----------------------------------------------- 200 gr
 Glycerin -------------------------------------------------------- 16 ml
Cara membuatnya : Gom arab dilarutkan dulu dengan akuades
kemudian dilarutkan ke dalam chloralhydrat. Dalam proses ini ±
20 jam. Kemudian tambahkan glycerin dan campur dengan baik.
Penutupan : Ambil 1 tetes dengan menggunakan batang gelas,
kemudian tutup dengan cover glass.

17
 ACARA IV. PREPARAT POLEN
(METODE ASETOLISIS)

Pendahuluan
Angiospermae disebut juga tumbuhan berbunga. Angiospermae ditandai
dengan adanya bunga yang tersusun dari bunga jantan dan bunga betina dalam
satu tangkai bunga. Butir-butir polen dalam benang sari mengelilingi bunga
betina disekitar sisinya. Angiospermae dikenal juga dengan tumbuhan berbiji
tertutup, yang menunjukan adanya perkembangan buah dari bagian bunga
betina. Keistimewaan angiospermae adalah adanya pembuahan ganda. Polen
melepaskan dua inti sperma, satu inti akan membentuk zygote yang akan
berkembang membentuk embrio, inti lain membentuk cadangan makanan.
Hal penting yang perlu diperhatikan dalam mempersiapkan bahan untuk
membuat koleksi referensi polen/spora segar adalah dalam hal :
1. Memilih bunga yang siap mekar atau yang sudah mekar yang masih
memiliki serbuk sari. Untuk spora paku pilih yang kotak sporanya sudah
matang.
2. Pada saat acetolysis perbandingan antara (CH3CO2)2O dengan H2SO4 adalah
9:1.
3. Pada saat mengambil polen/spora dengan ujung jarum dan meletakannya
di atas object glass masih di meja biasa, setelah menemel baru dipanaskan
di hot plate agar glycerin mencarir, tutup object glass dengan cover glass,
untuk perekatnya bisa digunakan lem dari parafin atau Canada balsam.
4. Beri nama species/kode untuk urutan koleksi, selanjutnya adalah
mengamati polen/ spora tersebut di bawah mikroskop.
5. Sisa polen yang ada dalam tabung reaksi diberi glycerin cair, disimpan
dalam botol kecil, beri nama species.

Bahan Praktikum
1. Kepala sari/pollen beberapa bunga tumbuhan berbiji
2. HCl, asam sulfat
3. Gliserin
4. Akuades
5. Safranin 10% dalam alkohol 70%

18
Peralatan Praktikum
1. Tabung reaksi (tabung vial)
2. Skalpel
3. Batang pengaduk
4. Kaca benda dan kaca penutup
5. Sentrifuge
6. Mikroskop cahaya
7. Kerta tissue

Cara Kerja Praktikum

Acara Praktikum
Hari ke 1 : Persiapan di laboratorium. Menyediakan semua alat-alat serta
membuat larutan-larutan yang diperlukan.
Hari ke 2 : Fiksasi
Pollen-pollen yang diambil dari antera, dikumpulkan dalam
tabung (vial) yang sudah berisi dengan asam acetat glasial.
Bahan tersebut dibiarkan selama 24 jam
Hari ke 3 : Bahan-bahan dipindahkan dalam tabung centrifuge, kemudian
disentrifuge. Setelah itu cairan dibuang dan diganti dengan
campuran isi asam sulfat selalu ditambahkan setetes ke dalam
asam acetat glasial.
 Kemudian tabung-tabung itu dipanaskan dalam waterbath
dari temperatur kamar sampai mendidih.
 Setealah mendidih pemanasan dihentikan dan tabung
diambil dan diamkan selama ± 15 menit.
 Kemudian dicentrifuge dan setelah itu cairan dibuang dan
diganti dengan akuades.
 Kemudian dicek di bawah mikroskop.
 Apabila masih tampak gelap maka perlu dilakukan/diadakan
bleaching
 Bleaching dengan menggunakan :
2 cc asam asetat glasial ditambah 2-3 tetes Natrium chlorat
ditambah 2-3 tetes HCl
 Kemudian dicentrifuge

19
  Kemudian dibuang dan endapannya dicuci dengan akuades
2-3 kali dimana setiap pencucian harus dicentrifuge lagi.
 Akhirnya akusdes dibuang dan diganti dengan glycerin jelly
yang telah dipanaskan serta dicampur dengan zat warna
safranin.
Dengan menggunakan batang gelas, bahan diambil dan ditaruh pada
gelas benda kemudian ditutup dengan cover glass dimana sudut-sudut dari
gelas penutup tersebut diberikan potongan parafin.

20
 ACARA V. PREPARAT IRISAN UNTUK HEWAN
(METODE PARAFIN, Bagian 1)

Pendahuluan
Gambaran histologis jaringan-jaringan padat dan organ-organ tubuh
hewan tidak dapat diamati melalui preparat apus ataupun preparat rentang
karena terlalu tebal. Oleh karena itu jaringan atau organ tersebut hasrus diiris.
Untuk memudahkan pengirisan maka sampel jaringan atau organ harus
ditanam dalam suatu media yang memudahkan kita pada saat melalukan
pengirisan.
Media yang digunakan disesuaikan dengan tujuannya, untuk
pengamatan jaringan dasar (stuktur histologis) dapat digunakan media paraffin,
seloidin, ataupun resin; sedangkan untuk pengamatan enzimatik dapat
dilakukan dengan metode beku. Dalam praktikum ini yang akan dilakukan
adalah metode parafin.
Pada pelaksanaan metode paraffin terdapat beberapa tahapan yang
harus dilakukan secara berurutan dengan alokasi waktu yang tepat untuk
masing-masing tahapan yang mepiputi: pengambilan jaringan, fiksasi jaringan,
dehidrasi, penjernihan (clearing), infiltrasi/impregnasi, penanaman
(embedding), pengirisan (sectioning), penempelan jaringan pada gelas benda
(affixing), deparafinisasi, rehidrasi, pewarnaan (staining), dehidrasi,
penjernihan (clearing), penempelan gelas penutup (mounting), pemberian label
(labelling) dan evaluasi/pengamatan di bawah mikroskop cahaya.
Preparat irisan adalah 1) kesegaran sampel pada saat difiksasi. Apabila
jarak antara kematian individu dengan pengambilan sampel jaringan dan fiksasi
terlalu lama maka jaringan sudah berada pada kondisi post mortem dan
biasanya akan menghasilkan preparat yang kurang baik kualitasnya. 2). Volume
fiksatif dan lama fiksasi. Agar sampel jaringan dapat terfiksasi dengan baik
maka volume fiksatif yang digunakan minimal 10 kali volume sampel. Bila
volume fiksatif kurang maka fiksasi sampel kurang sempurna. Demikian pula
dengan lama fiksasi, bila sampel difiksasi terlalu singkat maka fiksasi kurang

21
optimal. Lama fiksasi tergantung pada jenis fiksatif yang digunakan dan jenis
serta ukuran jaringan.

Bahan Praktikum
1. Organ ginjal, hati, gonad, jantung dan jaringan otot rangka dari ikan,
ayam dan mencit atau kelinci.
2. Larutan fiksatif neutral buffered formalin (NBF).
3. Larutan alkohol 70%, 90% dan 100%.
4. Larutan xylol.
5. Paraplast reguler (Sigma p3858).
6. Gelatin 1%
7. Pewarna Carazzi’s Haematoxylin dan 1% Eosin akuosa
8. Entelan new

Peralatan praktikum
1. Pisau dan alat bedah
2. Botol sampel
3. Beaker glass volume 50 ml
4. Oven inkubator dengan thermostat
5. Hot plate
6. Cetakan dari kertas karton
7. Blok kayu sebagai holder
8. Pensil dan label
9. Mikrotom putar
10. Kuas dan mangkuk air hangat
11. Aluminium foil
12. Gelas benda dan gelas penutup
13. Staining jar
14. Mikroskop cahaya

Cara Kerja Praktikum

A. Pengambilan sampel organ
1. Potong (sembelih) ayam dan kelinci menggunakan pisau, matikan ikan
dengan cervical dislocation dan matikan ikan merusak otaknya.
2. Bedah ayam, kelinci atau mencit dan ikan menggunakan alat bedah
yang telah disediakan.
3. Angkat hati, jantung, ginjal, gonad dan jaringan otot dari masing-masing
sampel hewan, bersihkan dari darah dan difiksasi dengan NBF di dalam
botol sampel selama minimal 24 jam. Perhatikan bahwa volume fiksatif

22
 minimal 10 kali volume sampel jaringan. Apabila organ terlalu besar,
organ tersebut dapat dipotong menjadi beberapa bagian. Apabila
sampel akan difiksasi selama lebih dari 24 jam, maka pada hari ke 2
NBF diganti dengan yang baru. Pada kondisi demikian sampel dapat
dibiarkan di dalam NBF selama beberapa minggu selama larutan fiksatif
masih tempak jernih
B. Pemrosesan Jaringan Untuk Embedding.
1. Pencucian. Apabila sampel difiksasi selama 1-3 hari, cuci sampel dalam
alkohol 70% selama 3 kali kemudian direndam dalam alkohol 70%
selama 45 menit baru dilanjutkan dengan dehidrasi. Apabila sampel
difiksasi selama lebih dari 3 hari maka setelah dicuci dengan alkohol
70%, sampel direndam dalam alkohol 70% selama 6-12 jam baru
dilanjutkan dengan dehidrasi. Tujuan pencucian adalah untuk
menghilangkan fiksatif dari dalam jaringan.
2. Dehidrasi. Tahap dehidrasi dilakukan dengan merendam sampel di
dalam larutan alkohol bertingkat mulai dari 70%, 80%, 90% dan
2x100% masing-masing selama 45 menit. Tujuan dehidrasi adalah
untuk mengeluarkan air yang terkandung dalam jaringan sehingga
proses penjernihan dapat berlangsung secara efektif.
3. Penjernihan. Apabila dehidrasi dilakukan dalam larutan alkohol, proses
penjernihan disebut juga sebagai dealkoholisasi. Tujuan tahap ini adalah
untuk menghilang dehidran dari dalam jaringan sehingga pada saat
infiltrasi paraffin dapat masuk secara sempurna ke dalam jaringan.
Tahap ini dilakukan dengan merendam sampel dalam campuran
akohol:xylol (1:1), alkohol:xylol (1:3), dua kali xylol murni masing-
masing selama 30 menit. Perhatian, jangan biarkan sampel terlalu lama
dalam larutan xylol karena sampel akan menjadi terlalu keras.
4. Infiltrasi. Tahap dilakukan di dalam oven inkubator pada temperatur 58-
60°C (sesuai dengan titik cair paraplast). Sampel direndam dalam
campuran xylol:paraffin (1:1), Xylol:paraffin (1:3) masing-masing selama
45 menit dan 2 kali dalam paraffin murni masing-masing selama 60
menit. Waktu dapat diubah sesuai dengan ukuran sampel. Perhatian,

23
 jangan biarkan sampel terlalu lama dalam paraffin karena sampel akan
menjadi terlalu keras. Perhatikan pula temperatur inkubator, usahakan
tidak lebih dari 60°C karena sampel akan menjadi keras dan mudah
retak. Kekeliruan pada tahap ini tidak dapat diperbaiki lagi.
5. Embedding. Untuk penanaman jaringan di dalam blok paraffin, siapkan
cetakan dari kertas karton sesuai dengan ukuran sampel (ukuran
cetakan kurang lebih 3 kali ukuran sampel). Tuangkan paraffin cair ke
dalam cetakan sekitar 2/3 tinggi cetakan. Letakkan cetakan di atas blok
es sebentar agar paraffin pada dasar cetakan agak sedikit memadat.
Tanamkan sampel ke dalam paraffin yang agak memadat, atur posisinya
sesuai dengan orientasi pengirisan jaringan yang diinginkan.
Tambahkan paraffin cair hingga 4/5 cetakan kemudian tetakkan holder
dari blok kayu yang telah diberi label. Biarkan paraffin membeku dalam
temperatur ruang.
6. Evaluasi hasil embedding. Hasil perosesan jaringan yang baik ditandai
dengan: blok paraffin terlihat jernih tanpa gelembung udara, tidak
terlihat adanya batas antara paraffin dengan sampel, blok tidak berbau
xylol dan apabila diiris paraffin maupun sampelnya terpotong dengan
baik, tidak hancur, tidak terasa keras dan sampel tetap terikat oleh pita
paraffin. Beberapa faktor yang dapat menyebabkan proses embedding
menjadi tidak sempurna antara lain: dehidrasi, penjernihan dan infiltrasi
yang kurang sempurna.
7. Catat hasil embedding yang anda lakukan dan serahkan salinannya
kepada asisten sebagai laporan sementara.

24
 PENGIRISAN SAMPEL
(METODE PARAFIN, Bagian 2)

Pendahuluan
Pengirisan jaringan dalam blok merupakan suatu tahapan yang
memerlukan ketelitian dan ketelatenan. Ada beberapa hal yang perlu
diperhatikan sebelum dilakukan pengirisan jaringan. Pertama harus dipastikan
bahwa mikrotom dalam keadaan baik dan dapat dioperasikan serta memiliki
pisau mikrotom yang cukup tajam. Kedua semua peralatan yang diperlukan
tersedia.
Ketebalan irisan dapat bervariasi tergantung pada kebutuhan dan
tingkat ketelitian yang diharapkan. Evaluasi histologis rutin dapat dimati
melalui irisan dengan ketebalan 8-10 µm sedangkan untuk mendapat gambaran
strutur yang lebih baik dapat digunakan ketebalan 4-6 µm atau di bawahnya.
Semakin tipis irisan yang diharapkan dibutuhkan pisau yang semakin tajam
dengan pemrosesan jaringan yang baik dan ketrampilan pengirisan yang lebih
tinggi.
Setelah sampel diiris menjadi bentuk pita, selanjutanya pita paraffin
berisi sampel tersebut ditempelkan ke gelas benda yang telah diberi perekat.
Perekat yang paling sering digunakan adalah Mayer-albumen dan gelatin baik
metode kering maupun basah.
Bahan Praktikum
1. Sampel jaringan dalam blok paraffin
2. air hangat
3. gelatin atau Mayer-albumen

Peralatan Praktikum
1. Mikrotom putar beserta asesorinya
2. kuas kecil dan sedang
3. pinset
4. cutter
5. gelas benda
6. mangkuk untuk air hangat atau waterbath
7. slide rack atau slide tray
8. inkubator

25
Cara Kerja Praktikum
1. Sambungkan mikrotom dengan power supply, switch tombol mikrotom
ke posisi on. Perhatikan bahwa lampu indikator berwarna hijau pada
mikrotom menyala.

Gambar 7. Mikrotom rotary untuk pengirisan blok parafin berisi

jaringan hewan/tumbuhan.

2. Ubah posisi hendle pemutar mikrotom ke posisi tak terkunci dan putar
untuk memastikan bahwa mikrotom dalam keadaan baik dan
operational.
3. Kembalikan posisi hendle pemutar mikrotom ke posisi terkunci, atur
kisaran ketebalan irisan dengan memutar tombol pengatur ukuran
irisan.
4. Atur sudut kemiringan (elevasi) pemegang pisau dan lakukan ujicoba
dengan blok kosong. Gunakan sudut elevasi yang menghasilkan pita
terbaik.
5. Siapkan kuas dan pinset untuk pemotongan dan pemindahan pita
paraffin dan waterbath untuk mengembangkan jaringan. Apabila tidak
ada waterbath dapat digunakan mangkuk berisi air hangat-hangat kuku.

26
6. Sebelum diiris, paraffin di sekeliling sampel dapat dikurangi melalui
trimming sehingga paraffin disekeliling sampel tinggal ± 5 mm.
Usahakan agar masing-masing sisi blok benar-benar sejajar.
7. Pasang holder pada pemegang holder dengan erat.
8. Sesuaikan posisi blok dengan pisau mikrotom, atur posisinya dengan
memajukan atau memundurkan pemegang sampel.
9. Iris blok dengan kecepatan dan kekuatan putaran yang konstan. Periksa
pita hasil irisan.

Gambar 8. Pengirisan dan pita hasil irisan blok parafin dengan

menggunakan mikrotom rotary.

10. Dengan menggunakan kuas kecil dan pinset, pindahkan pita berisi
beberapa irisan sampel ke dalam waterbath atau mangkuk berisi air
hangat agar sampel mengembang. Jangan biarkan sampel terlalu
mengembang karena akan merusak strutur jaringan.

Gambar 9. Penempelan irisan

sampel pada objeck glass

11. Tempelkan irisan sampel ke gelas benda yang telah dilapisi gelatin atau
Mayer-albumen, tiriskan dan tata pada slide rack atau slide tray,
keringkan dalam inkubator pada temperatur 37°C selama sekitar 12 jam.
Sampel yang telah kering dapat disimpan di dalam slide box hingga saat
pewarnaan.

27
 Evaluasi hasil. Proses pengirisan dinilai baik apabila pita yang
diperoleh utuh dengan ketebalan yang homogen, tidak mengkerut, tidak
melengkung ke salah satu sisi, tidak retak dan sampel menempel
terpegang dengan baik dalam pita paraffin.
12. Catat hasil irisan yang anda peroleh dan serahkan salinannya kepada
asisten sebagai laporan sementara.

28
 ACARA VI. PEWARNAAN

Pendahuluan
Pewarnaan bertujuan untuk memudahkan kita dalam mengidentifikasi
struktur jaringan yang telah diiris. Pewarna dasar untuk inti sel yang sering
digunakan adalah haematoxylin sedangkan pewarna untuk sitoplasma adalah
Eosin. Dalam metode pewarnaan dikenal beberapa macam formula
haematoxylin dan Eosin, penggunaannya disesuaikan dengan tujuan yang ingin
dicapai. Apabila digunakan alum haematoxylin maka perlu dilakukan
diferensiasi dalam alkohol asam. Dalam alkohol asam, jaringan yang telah
diwarnai dengan alum haematoxylin akan menjadi merah sehingga setelah
dicuci dengan air jaringan perlu dimasukkan ke dalam larutan yang bersifat
basa agar jaringan menjadi biru. Larutan basa yang digunakan biasanya berupa
air Scott. Dengan pewarna haematoxylin inti sel terwarna biru atau ungu
sedangkan Eosin menjadikan sitoplasma tampak merah muda atau merah
jingga.
Sebelum dilakukan pewarnaan pada preparat irisan yang diproses
dengan metode paraffin, jaringan harus dideparafinikasi (dibersihkan dari
paraffin) dengan cara meremdamnya dalam larutan xylol. Larutan xylol dicuci
dengan alkohol absolut kemudian jaringan didehidrasi dalam larutan alkohol
bertingkat menurun dari 100%, 90%, 70% hingga akuades. Setelah pewarnaan,
jaringan didehidrasi dalam alkohol bertingkat naik hingga 100% kemudian
dijernihkan dalam xylol dan ditutup dengan gelas penutup menggunakan
perekat baik entelan new Canada balsam atau DPX. Proses petunupan jaringan
dengan gelas penutup menggunakan perekat disebut mounting. Pada saat
melakukan mounting perlu diusahakan agar tidak terdapat gelembung udara.
Adanya gelembung udara akan mengganggu pada saat pengamatan disamping
itu memberi peluang untuk terjadinya kontak antara jaringan dan mikroba
sehingga jaringan tidak dapat disimpan dalam waktu lama. Tahap berikutnya
adalah pengamatan/evaluasi jaringan di bawah mikroskop.

29
Bahan Praktikum
1. Pewarna Carazzi’s Haematoxylin dan Eosin
2. Larutan alkohol : 70%, 90%, 100%
3. Larutan xylol
4. Akuades
5. Entelan New atau Canada Balsam

Peralatan Praktikum
1. Staining jarr
2. pinset
3. Lidi
4. Kertas tissue
5. Inkubator
6. Mikroskop

Gambar 10. Stainning jarr untuk pewarnaan jaringan (hewan dan

tumbuhan)

Cara Kerja Praktikum :

1. Isi 4 staining jarr dengan larutan xylol murni, 8 staining jarr dengan larutan
alkohol 100%, 2 staining jarr dengan alkohol 90%, 2 staining jarr dengan
alkohol 70%, 3 kontainer untuk akuades dan air. Tata staining jarr dan
kontainer dengan urutan sebagai berikut: 2 xylol, 2 alkohol 100%, 1 alkohol

30
 90%, 1 alkohol 70%, 1 akuades, haematoxylin, air, larutan Scott (atau
penggantinya), air, 1 alkohol 70%, 1 alkohol 90%, 2 alkohol 100%, 2 xylol.
2. Siapkan jaringan yang akan diwarnai.
3. Deparaffinisasi. Celupkan jaringan kedalam larutan xylol I selama 2 menit,
kemudian pindahkan ke dalam larutan xylol II selama 2 menit.
4. Rehidrasi. Celupkan jaringan kedalam larutan alkohol 100% (2 kali ganti),
alkohol 90%, alkohol 70% secara berturut-turut masing masing 30-40
celupan, kemudian bilas dengan akuades.
5. Rendam jaringan dalam larutan Carazzi’s haematoxylin selama 2-10 menit
(biasanya 2 menit sudah cukup), kemudian cuci dalam air mengalir. Amati
di bawah mikroskop untuk memastikan bahwa pewarna telah masuk ke
dalam jaringan dengan baik, apabila jaringan masih kurang terwarna, waktu
pewarnaan dapat diperpanjang.
6. Celupkan jaringan kedalan larutan Eosin selama 30 – 60 detik kemudian
cuci sebentar dalan air mengalir. Amati jaringan di bawah mikroskop.
Apabila pewarnaan telah cukup baik, lanjutkan dengan dehidrasi.
7. Dehidrasi. Celupkan jaringan ke dalam larutan alkohol 70%, 90% dan
100% (dua kali ganti) masing-masing selama 30-40 celupan.
8. Jernihkan jaringan dalam larutan xylol I dan xylol II masing-masing selama
30-40 celupan. Bila proses dilakukan dengan baik maka setelah
penjernihan gelas benda akan tampak jernih, apabila gelas benda tampak
keruh menunjukkan bahwa proses dehidrasi kuran optimal. Hal ini akan
mengganggu pada saat pengamatan jaringan.
9. Angkat gelas benda dari larutan xylol, letakkan di atas kertas tissue dengan
bagian yang mengandung jaringan menghadap ke atas. Teteskan 1-2 tetes
mounting agent (entelan new atau Canada balsam) di atas jaringan dan
tutup dengan gelas penutup. Ratakan dengan menekankan lidi di atas gelas
penutup hingga seluruh jaringan tertutup oleh mounting agent. Keringkan
preparat dalam inkubator pada temperatur 40°C selama 24-48 jam.
10. Amati di bawah mikroskop dengan perbesaran lemah kemudian perbesaran
kuat. Catat hasil pengamatan dan serahkan salinannya kepada asisten
sebagai laporan sementara.

31
Gambar 11. Tahap pewarnaan jaringan (hewan dan tumbuhan)

32
 ACARA VII. PREPARAT IRISAN TUMBUHAN
(METODE PARAFIN)

Pendahuluan
Suatu jaringan dipotong tanpa diberi perlakuan, maka segera jaringan
tersebut mengalami perubahan yaitu akar kering dan mengkerut. Apabila
jaringan dipertahankan dalam keadaan basah (dimasukkan larutan garam),
tidak akan mengalami perubahan dengan segera, tetapi akan dirusak oleh
bakteri, sehingga untuk mempertahankan elemen-elemen sel atau jaringan
tersebut perlu di beri media yaitu fiksatif.
Pada pelaksanaan metode parafin terdapat beberapa tahapan yang
harus dilakukan secara berurutan dengan alokasi waktu yang tepat untuk
masing-masing tahapan yang mepiputi: pengambilan jaringan, fiksasi jaringan,
dehidrasi, penjernihan (clearing), infiltrasi/impregnasi, penanaman
(embedding), pengirisan (sectioning), penempelan jaringan pada gelas benda
(affixing), deparafinisasi, rehidrasi, pewarnaan (staining), dehidrasi,
penjernihan (clearing), penempelan gelas penutup (mounting), pemberian label
(labelling) dan evaluasi/pengamatan di bawah mikroskop cahaya.
Preparat irisan adalah 1) kesegaran sampel pada saat difiksasi. Apabila
jarak antara kematian individu dengan pengambilan sampel jaringan dan fiksasi
terlalu lama maka jaringan sudah berada pada kondisi post mortem dan
biasanya akan menghasilkan preparat yang kurang baik kualitasnya. 2). Volume
fiksatif dan lama fiksasi. Agar sampel jaringan dapat terfiksasi dengan baik
maka volume fiksatif yang digunakan minimal 10 kali volume sampel. Bila
volume fiksatif kurang maka fiksasi sampel kurang sempurna. Demikian pula
dengan lama fiksasi, bila sampel difiksasi terlalu singkat maka fiksasi kutang
optimal. Lama fiksasi tergantung pada jenis fiksatif yang digunakan dan jenis
serta ukuran jaringan.
Berbagai macam irisan jaringan agar dapat diamati dengan jelas di
bawah mikroskop perlu diwarnai dengan menggunakan zat warna tertentu,
karena setiap bagian dari sel/jaringan mempunyai sifat khusus, sehingga
afinitas bagian-bagian tersebut terhadap zat warna juga berbeda-beda. Zat

33
warna sendiri mempunyai kemampuan khusus dalam mewarnai jaringan sesuai
dengan sifat-sifatnya. Kadang-kadang 2 macam zat warna yang mempunyai sifat
yang sama, memberikan kemamapuan yang berbeda untuk mewarnai satu
macam jaringan.
A. Macam - macam zat warna
1. Berdasarkan sifat
a. Zat warna asam
Garam-garam dari asam pembawa warna dan radikal basa tak
berwarna
Misalnya : asam fuchsin, eosin
b. Zat warna basa
Garam-garam dari basa pembawa warna dan radikal asam tak
berwarna
Misalnya : basic fuchsin hematoxylin
2. Berdasarkan Kemampuan
a. Zat warna substantif
Mampu langsung mewarnai jaringan
Misalnya : eosin, safranin, fast green, yanus green
b. Zat warna ajektif
Berfungsi dengan baik bila dibantu zat lain (zat mordan)
Misalnya : hematoxylin
3. Berdasarkan pengaruh zat warna terhadap obyek
a. Perwarnaan efektif
Hanya mewarnai satu atau beberapa bagian jaringan saja
Misalnya : Toluidin blue untuk jaringan mesenterium yang jelas
hanya granula mastsel
b. Pewarnaan difus
Mewarnai seluruh jaringan hanya daya serapnya tidak sama
Misalnya : eosin
4. Beradasarkan tebal / tipis zat warna yang diberikan
a. Pewarnaan progresif
Yang diberikan sangat tipis  lama

34
 b. Pewarnaan regresif
Jaringan menyerap zat warna tebal  perlu ditipiskan /
deferensiasi
5. Asal
a. Zat warna alamiah
Berasal dari tumbuhan / hewan
Misalnya : Hematoxylin dari H. campechianum L., Carmin dari
Coccuscacti (insecta pada cactus )
b. Zat warna sintetis
Dibuat di pabrik
Misalnya : crystal violet, anilin blue, malachit green, safranin, dll
B. Cara Pewarnaan
 Beradasarkan pemberian zat warna
a. Pewarnaan simultan, 2 atau lebih macam zat warna dipakai
bersama-sama.
Misalnya : larutan malory (anilin blue & orange G)
b. Pewarnaan suksedan, 2 atau lebih zat warna diberikan bergantian
diselingi pencucian.
Misalnya : Safrani-fast green, hematoxylin-eosin
 Berdasarkan jumlah zat warna yang digunakan
a. Pewarnaan tunggal
b. Pewarnaan ganda ( 2 atau lebih )

Bahan Praktikum
1. Organ tumbuhan (akar, batang, daun, bunga atau bagian lain)
2. Safranin 1 % dalam alkohol 70 %
3. Ethanol PA
4. Xilol
5. Alkohol teknis 96%
6. Formalin
7. Asam asetat glasial
8. Akuades
9. Entelan New atau Canada Balsam

35
Peralatan Praktikum
1. Mikrotom putar beserta asesorinya
2. Kuas kecil dan sedang
3. Pinset
4. Cutter
5. Skalpel
6. Gelas benda dan gelas penutup
7. Inkubator

Cara Kerja Praktikum

Hari I : Persiapan di laboratorium. Menyediakan semua alat-alat dan
bahan-bahan yang digunakan. Membuat larutan-larutan yang
diperlukan.
Hari II : Pemotongan bahan dan fiksasi. Larutan fiksatif yang digunakan
FAA terdiri dari :
 Alkohol 70 % .............................................. 90 bagian
 Asam Asetat glasial ................................... 5 bagian
 Formalin ....................................................... 5 bagian
Hari III : Pencucian dan dehidrasi
Fiksatif dibuang berturut-turut digantu dengan
 Alkohol 70 % -------------------------------------------- 0,5 jam
 Alkohol 80 % -------------------------------------------- 0,5 jam
 Alkohol 90 % -------------------------------------------- 0,5 jam
 Alkohol 96 % -------------------------------------------- 0,5 jam
 Alkohol Absolut I % ----------------------------------- 0,5 jam
 Alkohol Absolut II % ---------------------------------- 0,5 jam
DEALKOHOLISASI
Alkohol dibuang berturut-turut diganti dengan :
 Campuran alkohol/xilol 3:1 ----------------------- 0,5 jam
 Campuran alkohol/xilol 1:1 ----------------------- 0,5 jam
 Campuran alkohol/xilol 1:3 ----------------------- 0,5 jam
 Xilol I --------------------------------------------------- 0,5 jam
 Xilol II -------------------------------------------------- 0,5 jam
 Campuran xilol / parafin 1 : 9 dengan temperatur 570C
selama 24 jam

Hari IV : INFILTRASI
Campuran xilol/parafin dibuang dan diganti dengan parafin
murni, pada temperatur 57 0C selama 24 jam.

36
HARI V : PENYELUBUNGAN
Parafin dibuang, diganti dengan parafin baru. Setelah 1 jam
dibuat blok.

Gambar 12. Kotak-kotak karton untuk penyelubungan jaringan

HARI VI : PENGIRISAN
Dibuat irisan-irisan dengan mikrotom dengan tebal ± 8 µm
PEREKATAN
Irisan diatur dan dilekatkan di atas gelas benda dengan
campuran gliserin/albumin yang ditetesi air. Kemudian gelas
benda diletakkan di atas thermostat pada temperatur 45 0C
sampai parafin merenggang.

Gambar 13. Blok parafin berisi jaringan, dipotong sedemikian rupa,

kemudian ditempel pada balok kayu/holder.

37
Gambar 14. 3 Arah irisan jaringan/organ pada tumbuhan. Melintang; B. Radial;
dan C. Membujur.

HARI VII : PEWARNAAN

Pewarnaan tunggal menggunakan zat warna safranin 1 %
dalam alkohol 70 %. Berturut-turut gelas benda dimasukkan ke
dalam :
 Xilol I ----------------------------------------------------- 3 menit
 Xilol II ---------------------------------------------------- 3 menit
 Campuran alkohol/xilol 1:3 ------------------------- 3 menit
 Campuran alkohol/xilol 1:1 ------------------------- 3 menit
 Campuran alkohol/xilol 3:1 ------------------------- 3 menit
 Alkohol Absolut I % ----------------------------------- 3 menit
 Alkohol Absolut II % ---------------------------------- 3 menit
 Alkohol 96 % -------------------------------------------- 3 menit
 Alkohol 90 % -------------------------------------------- 3 menit
 Alkohol 80 % -------------------------------------------- 3 menit
 Alkohol 70 % -------------------------------------------- 3 menit
 Safranin dalam Alkohol 70 % ----------------------- 1 jam
 Alkohol 70 % -------------------------------------------- 3 menit
 Alkohol 80 % -------------------------------------------- 3 menit
 Alkohol 90 % -------------------------------------------- 3 menit
 Alkohol 96 % -------------------------------------------- 3 menit
 Alkohol Absolut I % ----------------------------------- 3 menit
 Alkohol Absolut II % ---------------------------------- 3 menit
 Campuran alkohol/xilol 3:1 ------------------------- 3 menit
 Campuran alkohol/xilol 1:1 ------------------------- 3 menit
 Campuran alkohol/xilol 1:3 ------------------------- 3 menit
 Xilol I ----------------------------------------------------- 3 menit
 Xilol II ---------------------------------------------------- 3 menit

38
PENUTUPAN
Irisan ditutup dengan gelas penutup dengan ditetesi canada
balsam atau entellan new terlebih dahulu. Preparat dikeringkan
di atas thermostat pada temperatur 450C sampai canada
balsam cukup kering.

PEMEBERIAN LABEL
Disebelah kiri gelas penutup diletakkan label dengan diberi
keterangan meliputi : Nama spesies, organ dan penampang.

39
 ACARA VIII. INDEKS STOMATA

Pendahuluan
Stomata pada tumbuhan mempunyai tugas sebagai tempat pertukaran
gas antara jaringan daun dan atmosfer. Hidayat (1995) menyatakan bahwa
apabila stomata ditemukan pada kedua sisi daun maka daun tersebut
dinamakan daun amfistomatik, jika stomata hanya di sebelah atas maka disebut
daun epistomatik atau jika pada sebelah bawah maka disebut daun
hipostomatik. Berdasarkan bentuk sel penutup maka stomata mempunyai dua
bentuk yaitu bentuk halter untuk tanaman monokotil dan bentuk ginjal untuk
tanaman dikotil.
Jumlah stomata per satuan luas suatu daun sangat beragam. Seperti yang

dikemukakan oleh Earnest and Mac Daniels (1953) bahwa tanaman xerofit yang

beradaptasi pada habitat kering sedikitnya memiliki stomata 10-15 per mm2.

Jumlah ini berkaiatan erat dengan habitat yang menjadi tempat hidupnya.

Bahan Praktikum
1. Epidermis bawah/atas daun
2. Akuades
Peralatan Praktikum
1. Gelas benda dan gelas penutup
2. Silet atau cutter
3. Kertas tissue
4. Pipet tetes
5. Mikroskop
6. Mikrometer square

Cara Kerja Praktikum

1. Potongan daun diletakkan dalam larutan khloralhidrat pada gelas
benda. Permukaan yang ada stomatanya diletakkan di bagian atas,
kemudian ditutup dengan gelas penutup. Sebaiknya ditetesi
gliserin pada tepi gelas penutup supaya preparat tidak cepat
kering.

40
2. Dengan menggunakan objektif mikrometer dan camera lusida
dibuar 10 gambar dengan sisi sesungguhnya 1 mm (pada kertas
jauh lebioh besar). Luas segia empat tersebut sesungguhnya 1
mm2.
3. Preparat diamati pada 10 daerah yang berlainan dengan
menggunakan mikroskop untuk menghindari adanya pengamatan
lebih dari 1 kali pada daerah yang sama.
4. Tiap sel epidermis (E) ditandai dengan tanda silang (X) pada kertas
gambar dan stoma (S) ditandai dengan lingkaran (0)
5. Indeks Stoma

S
Indeks stoma  x100
ES
Jumlah stomata (S) per m2 pada epidermis dapat dihitung.
6. Hasil akhir adalah rata-rata dari 10 kali pengamatan

41
 ACARA IX. MIKROMETRI

Pendahuluan
Mikrometri merupakan suatu cara untuk mengukur panjang, lebar dan
ukuran sel secara mikroskopis menggunakan okuler mikrometer yang
ditempatkan di dalam lensa okuler dan obyektif mikrometer untuk menera
(kalibrasi) yang diletakkan di meja preparat. Hal pertama yang harus dilakukan
adalah mencari nilai skala okuler mikrometer, kemudian baru melakukan
pengukuran panjang, lebar atau ukuran sel/jaringan. Ukuran sel/jaringan
merupakan hasil perkalian antara bagian skala yang terukur dengan nilai hasil
kalibrasi.
Kalibrasi merupakan serangkaian kegiatan yang membentuk hubungan
antara nilai yang ditunjukkan oleh instrumen ukur atau sistem pengukuran,
atau nilai yang diwakili oleh bahan ukur, dengan nilai-nilai yang sudah
diketahui yang berkaitan dari besaran yang diukur dalam kondisi tertentu.
Dengan kata lain, kalibrasi adalah kegiatan untuk menentukan kebenaran
konvensional .

Bahan Praktikum
1. Preparat irisan jaringan akar/batang/daun yang akan diukur
Peralatan Praktikum
1. Gelas benda dan gelas penutup
2. Silet atau cutter
3. Kertas tissue
4. Pipet tetes
5. Mikrometer obyektif dan okuler

Cara Kerja Praktikum

1. Persiapan : mikroskop disiapkan dengan dipasang okuler mikrometer
pada okulernya. Juga disiapkan objektif mikrometer serta preparat yang
diukur.
2. Mencari nilai skala okuler mikrometer

42
 a. Mata ditempelkan di atas lensa okuler, dilihat apakah bayangan
skala-skala okuler mikrometer sudah jelas. Pada skala tertentu,
lensa atas okuler dapat diatur sedemikian rupa, sehingga bayangan
skala-skala jelas.
b. Objektif mikrometer ditempatkan dibawah objektif, dicari
bayangan yang jelas dari skala-skala objektif mikrometer tersebut
bersama-sama dengan bayangan skala-skala okuler mikrometer.
c. Kedua bayangan skala tersebut dibuats ejajar dengan memutar
okuler dalam tabungnya. Titik 0 dari kedua skalat tersebut
diletakkan sama tinggi dengan menggerakkan objektif mikrmeter.
d. Dicari bayangan garis skala kedua mikrometer tersebut yang
berhimpit (sama tinggi). Dihitung jumlah bagian skala pada
masing-masing mkrometer, dihitung dari titik 0 sampai garis skala
yang berhimpit tadi.
e. Jarak sesungguhnya antara dua garis skala objektif mikrometer
diketahui (tertulis pada objektif mikrometer), jadi nilai skala okuler
dapat dihitung.
3. Mengukur panjang/lebar sel atau bagian sel
a. Objektif mikrometer diambil, diganti dengan preparat. Bayangan
pereparat dicari. Kombinasi objektif, okuler panjang tubus sama
dengan waktu mencari nilai skla mikrometer.
b. Bayangan skala okuler mikrometer ditempatkan pada bayangan
preparat sedemiian rupa, sehingga arah bayangan skala itu sesuai
dengan arah panjang/lebar sel atau bagian sel yang diukur. Jumlah
bagain skala dikalikan dengan nilai skala panjang/lebar yang dicari.

43
 ACARA X. PREPARAT AWETAN TUMBUHAN
NON EMBEDDING

Pendahuluan
Metode non embedding digunakan karena memiliki beberapa
keuntungan, yaitu proses non embedding lebih cepat dan lebih sederhana untuk
dilakukan. Pembuatan preparat non embedding hanya dapat dilakukan untuk
jaringan atau organ yang sifatnya kaku, seperi akar dan batang. Untuk
mendapatkan hasil yang baik irisan jaringan dibuat setipis mungkin dan
diusahakan irisan dalam keadaan utuh sehingga kita dapat mengamati setiap
bagian yang dikehendaki. Oleh karena itu untuk mendapatkan irisan yang baik
dan tipis digunakan silet yang tajam.
Pembuatan preparat jaringan tumbuhan yang dilakukan dengan
metode non embedding melalui beberapa tahapan, diantaranya adalah
pengirisan (sectioning), fiksasi, pencucian dan dehidrasi, pewarnaan,
penjernihan (clearing), penutupan (mounting) dan pemberian label.
 Pengirisan adalah membuat sayatan atau irisan dari bahan yang akan
dibuat preparat dengan menggunakan silet tajam, irisan dibuat setipis
mungkin.
 Fiksasi dengan FAA bertujuan agar jaringan tidak membusuk dan dapat
mempertahankan struktur jaringan.
 Pencucian dan dehidrasi adalah melakukan penghilangan molekul air
dari dalam jaringan secara bertahap dengan memasukkan irisan jaringan
ke dalam alkohol bertingkat dan alkohol absolut.
 Pewarnaan tunggal dengan safranin 1% dalam alkohol 70%, selama 0,5 –
1 jam.
 Penjernihan adalah mengeluarkan alkohol dari dalam jaringan. Syarat
larutan clearing adalah memiliki indeks refraksi tinggi dan cepat menarik
alkohol, misalnya xilol, toluol, bensen, dll.
 Penutupan adalah menutup slide yang telah ditempeli irisan jaringan
dengan menggunakan medium mounting, misalnya entellan.

44
Bahan Praktikum
1. Akar dan batang jagung
2. Batang Cordyline
3. Fiksatif FAA
4. Safranin 1% dalam alkohol 70%
5. Entellan

Peralatan Praktikum
1. Gelas benda dan gelas penutup
2. Silet atau cutter
3. Kertas tissue
4. Pipet tetes
5. Mikroskop
6. Gelas arloji
7. Kuas
8. Pinset

Cara Kerja Praktikum

PENGIRISAN
Pengirisan bahan dan fiksasi. Larutan fiksatif yang digunakan
FAA terdiri dari :
 Alkohol 70 % ................................................ 90 bagian
 Asam Asetat glasial ..................................... 5 bagian
 Formalin ....................................................... 5 bagian
Irisan bahan difiksasi dalam FAA selama 24 jam.
Pencucian, dehidrasi dan pewarnaan tunggal
Fiksatif dibuang berturut-turut diganti dengan
 Alkohol 70 % ..................................................... 0,5 jam
 Pewarnaan dengan safranin 1 % dalam alkohol 70 %
............................................................................. ----- 1 jam
 Alkohol 70 % -------------------------------------------- 0,5 jam

Preparat kemudian diamati di bawah mikroskop. Apabila praparat yang

dihasilkan baik, proses pembuatan awetan dilanjutkan.
DEHIDRASI
 Alkohol 80 % ----------------------------------------- 0,5 jam
 Alkohol 90 % ----------------------------------------- 0,5 jam
 Alkohol 96 % ----------------------------------------- 0,5 jam
 Alkohol Absolut I % --------------------------------- 0,5 jam
 Alkohol Absolut II % -------------------------------- 0,5 jam

45
DEALKOHOLISASI
Alkohol dibuang berturut-turut diganti dengan :
 Campuran alkohol/xilol 3:1 ----------------------- 0,5 jam
 Campuran alkohol/xilol 1:1 ----------------------- 0,5 jam
 Campuran alkohol/xilol 1:3 ----------------------- 0,5 jam
 Xilol I --------------------------------------------------- 0,5 jam
 Xilol II -------------------------------------------------- 0,5 jam
PENUTUPAN
Irisan ditutup dengan gelas penutup dengan ditetesi canada
balsam atau entellan terlebih dahulu. Preparat dikeringkan di
atas thermostat pada temperatur 450C sampai canada balsam
cukup kering.

PEMEBERIAN LABEL
Disebelah kiri gelas penutup diletakkan label dengan diberi
keterangan meliputi : Nama spesies, organ dan penampang.

46
 DAFTAR PUSTAKA

Bain, B.J. 2005. Current concept diagnosis from the blood smear. N.Engl J. Med
353 (5): 498-507
Berlyn, G.P. & J.P, Miksche. 1976. Botanical Microtechnique And Cytochemistry.
The Iowa State University Press. Ames. Iowa
Budiono, J.D. 1992. Pembuatan Preparat Mikroskopis. University Press. IKIP,
Surabaya.
Campbell, T.W. 2015. Evaluation of the Blood Film. Veterinary Clinics of North
America: Exotic Animal Practice, 18(1):117-135.
Clark, G. 1972. Staining Procedures, used by Biological Staining Commision 3rd
edition. The Williams & Wilkins Co. London
Dawes, C.J. 1971. Botanical Technique in Electron Microscopy. Barnes & Noble
Inc. new York.
Dyer, S.M. & Cervasio, E.L. 2008. An Overview of Restraint and Blood Collection
Techniques in Exotic Pet Practice. Veterinary Clinics of North
America: Exotic Animal Practice, 11(3):423-443.
Hayama, F.H., A.C.F. Motta, Silva, A. P.G. & D.A. Migliari. 2005. Liquid-based
preparation versus conventional cytology: specimen adequacy and
diagnostic agreement in oral lession. Med Oral Patol Cir Bucal 10:
115-122
Hendarto S. Sudarwati & I. Prawirosuhardjo. 1983. Metode Pewarnaan.
Bhratara. Karya Aksara. Jakarta.
Jungueira, L.C. & J. Carneiro. 1997. Histologi Dasar. Penerbit Buku Kedokteran
EGC, Jakarta.
Lindstrom, N.M., Moore, D.M., Zimmerman, K. & Smith, S.A. 2015. Hematologic
Assessment in Pet Rats, Mice, Hamsters, and Gerbils: Blood Sample
Collection and Blood Cell Identification. Veterinary Clinics of North
America: Exotic Animal Practice, 18(1):21-32.
Sass, J.E. 1961. Botanical Microtechnique. The Iowa State University Press. Ames.
Iowa
Suntoro, H. 1983. Metode Pewarnaan (Histologi dan Histokimia). Penerbit
Bhatara Karya Aksara. Jakarta
Wijayanti, G.E. & P. Susatyo. 2006. Petumjuk Praktikum Mikroteknik Hewan.
Laboratorium Struktur dan Perkembangan Hewan. Fakultas Biologi
UNSOED. Purwokerto

47
Lampiran :
JADWAL PRAKTIKUM MIKROTEKNIK SESI HEWAN
SEMESTER GENAP
Tempat : Lab. Struktur Perkembangan Hewan
NO HARI
1 Senin, 08.00 - selesai
2 Selasa, 08.00 - selesai
3 Rabu, 07. 00 - selesai
4 Kamis, 08.00 - selesai
5 Jum’at, 09.00 - selesai
ACARA/KEGIATAN
1. Asistensi Praktikum
2. Metode Apus Darah
a. Darah Manusia (praktikan)
b. Darah Aves (Ayam)
Sampai dengan difiksasi, diwarnai, diamati,
didokumentasi
3. Metode Embedding (Organ trimming & Fiksasi 24
jam)
4. Metode Rentang (spread Preparation)
mesenterium ayamdifiksasi sampai dengan
diwarnai, di labeldiamati
1. Melanjutkan metode embedding setelah fiksasi
24 jam tissue processing
a. dehidrasi,
b. clearing,
c. infiltrasi,
d. embedding/blocking (pembuatan blok)
1. Melanjutkan metode embedding,
melalukan sectioning (pengirisan terhadap blok
organ dalam cetakan parafin) dilanjut affixing
(penempelan pita irisan), label sementara
1. Melanjutkan metode embedding,staining
process (pewarnaan), dimulai dari:
a. Deparafinisasi
b. Rehidrasi
c. Staining dengan Carazzi’s
Haematoxylin - Eosin
d. Dehidrasi
e. Clearing
f. Mounting
g. Labelling
h. Pembacaan slide/ pengamatan sementara
hasil
1. Melanjutkan metode embedding,
 melanjutkan pengamatan hasil dengan
mikroskop:
a. Pengamatan hasil metode embedding
b. Melanjutkan pengamatan hasil metode apus
darah
c. Melanjutkan pengamatan hasil metode
rentang/spread preparation.
2. Evaluasi hasil seluruh tugas praktikum
3. Penjelasan pelaporan praktikum
4. Tugas terstruktur (dilaksanakan pada praktikum
divisi/materi tumbuhan)
48
 PEMROSESAN HISTOLOGI METODE PARAFIN
Praktikum Mikroteknik Semester Genap

Waktu yang
Proses Start Keterangan
diperlukan
1. Fiksasi Minimal 24 jam,
- Bouin disesuaikan jenis
- NBF 24 jam fiksatif dan
- FAA sampel jaringan
- Formalin 10% yang diproses.
2. Dehidrasi
- Alkohol 70 % 45 menit 05.15
- Alkohol 80 % 45 menit 06.00
- Alkohol 96 % 45 menit 06.45
- Alk. Absolut I 45 menit 07.30
- Alk. Absolut II 45 menit 08.15
3. Penjernihan/Clearing
- Alkohol : Xylol (3:1) 30 menit 09.00
- Alkohol : Xylol (1:1) 30 menit 09.30
- Alkohol : Xylol (1:3) 30 menit 10.00
- Xylol I 30 menit 10.30
- Xylol II 30 menit 11.00
4. Infiltrasi/Impregnasi
- Xylol : Paraffin (3:1) 30 menit 11.30 Dilakukan dalam
- Xylol : Paraffin (1:1) 30 menit 12.00 inkubator
- Xylol : Paraffin (1:3) 30 menit 12.30 temperatur 58 –
- Paraffin murni I 60 menit 13.00 600C
- Paraffin murni II 60 menit 14.00
5. Penanaman/Embedding 15.00
6. Pengirisan/Cutting+penempelan.
7. Pewarnaan/Staining
8. Mounting
9. Pembacaan slide

49
 PROTOKOL PEWARNAAN JARINGAN HEWAN
Pewarna Carazzi’s Haematoxylin Eosin
Praktikum Mikroteknik
Semester Genap

Tahap Waktu Keterangan

1. Deparaffinisasi
Menghilangkan pita
- Xylol murni I 2-5 menit
paraffin
- Xylol murni II 2-5 menit
2. Rehidrasi
- Alkohol absolut 1 30 celupan
- Alkohol absolut 2 30 celupan
- Alkohol 90% 30 celupan
- Alkohol 80% 30 celupan
- Alkohol 70% 30 celupan
- Aquadest 30 celupan (hingga
tampak jernih)
3. Carazzi’s Direndam, dimonitor di
2 – 10 menit
Haematoxylin bawah mikroskop.
Perhatikan debit air
4. Air mengalir 2 menit
jangan terlalu besar.
Bila diperlukan (jika
5. Air Scott 8 -10 celupan menggunakan Alum
haematoxylin)
Perhatikan debit air
6. Air mengalir 2 menit
jangan terlalu besar.
7. Eosin 1 menit Direndam
8. Air mengalir Beberapa celupan
9. Dehidrasi
- Alkohol 70% 30 – 40 celupan
- Alkohol 90% 30 – 40 celupan
- Alkohol absolut 1 30 – 40 celupan
- Alkohol absolut 2 30 – 40 celupan
10. Penjernihan
- Xylol murni 1 2 menit
- Xylol murni 2 2 menit
Menggunakan Entelen New
11. Mounting
/Canada Balsam
12. Pembacaan Slide Evaluasi hasil pewarnaan

50
 JADWAL PRAKTIKUM MIKROTEKNIK SESI TUMBUHAN
SEMESTER GENAP
Tempat : Lab. Struktur Perkembangan Tumbuhan
NO HARI ACARA/KEGIATAN
1 Senin, 08.00 - selesai 1. Asistensi Praktikum
2. Metode Embedding (Fiksasi)
3. Metode Non Embedding (Fiksasi)
4. Menyiapkan bahan Metode Asetoliis
2 Selasa, 08.00 - selesai 1. Melanjutkan metode embedding,
2. pewarnaan, dehidrasi, infitrasi
3. Melanjutkan metode non embedding
4. Metode asetolisis (Fiksasi polen)
5. Mikrometri (sampai selesai)
3 Rabu, 07. 00 - selesai 1. Melanjutkan metode embedding,
2. Infiltrasi, pembuatan blok
3. Melanjutkan metode asetolisis sampai
selesai.
4. Metode Squash (Preparat Pembelahan)
4 Kamis, 08.00 - selesai 1. Melanjutkan metode embedding,
2. pengirisan blok parafin, affixing
3. Pengamatan hasil metode non embedding
4. Melanjutkan pengamatan metode Squash
5 Jum’at, 09.00 - selesai 1. Melanjutkan metode embedding,
2. deparafinisasi, mounting dan labeling serta
pengamatan hasil.
3. Evaluasi hasil seluruh tugas praktikum
4. Penjelasan pelaporan praktikum
5. Tugas terstruktur.

51