Dalam beberapa dekade terakhir, kemajuan luar biasa telah dibuat pada pengobatan kerusakan

cacat tulang menggunakan sel, molekul bioaktif, bahan matriks, atau kombinasinya.

Sutra adalah biopolimer protein alami yang dipintal menjadi serat oleh larva Lepidoptera tertentu
(seperti ulat sutra), arakhnida (laba-laba, tungau, dan beberapa kalajengking), dan beberapa lalat.
Meskipun profil dan penelitian lengkap sutra dari sumber yang berbeda masih sulit dipahami,
terlepas dari sumbernya, sutra terdiri dari protein, sejumlah kecil polisakarida, dan lipid. Sebagai
keuntungan tambahan, serat protein sutra dapat memandu pembentukan kalsium fosfat, suatu
komponen molekul utama tulang. Serat sutra komersial diperoleh dari serangga lepidopteron dari
keluarga Bombycidae atau Saturniidae. Bombyx mori merupakan anggota famili Bombycidae yang
paling representative dan umumnya dikenal sebagai ulat sutra murbei. Famili Saturniidae yang
mengandung spesies nonmurbei terdiri dari anggota yang berbeda termasuk (i) spesies India seperti
ulat sutra tasar tropis (Antheraea mylitta), ulat sutra muga (Antheraea assamensis), dan ulat sutra eri
(Philosamia ricini/Samia ricini); (ii) ulat sutra tasar ek sedang (Antheraea pernyi); dan (iii) ulat sutra
ek Jepang (Antheraea yamamai).

Sutra laba-laba ringan dan memiliki sifat mekanik yang kuat, tetapi penggunaannya terbatas karena
ketersediaannya yang sedikit. Sementara ulat sutra telah didomestikasi sejak berabad-abad, sifat
predator dan territorial dari laba-laba membuat pemanenannya sulit. Dari berbagai varietas sutra
tersebut, yang paling banyak dimanfaatkan dalam penelitian biomedis adalah yang berasal dari B.
mori untuk ulat sutra dan genus Nephila (penenun bola emas) di antara laba-laba.

Serat ulat sutra memiliki dua komponen protein utama: fibroin dan serisin. Fibroin membentuk
bagian berserat dari filamen, sedangkan serisin adalah protein seperti lem yang larut dalam air yang
Menyusun sekitar 25-30% dari berat. Serisin, berdasarkan sifat perlekatannya, menahan serat fibroin
di dalam kepompong. Domain kristal asli B. mori fibroin mengandung urutan (GAGAGS)n bersama
dengan TGRGDSPA dari fibronektin, yang menyerupai motif RGD tetapi tidak secara structural sama.
Fibroin sutra nonmulberi dari Antheraea mylitta memiliki motif RGD tripeptida (Arg-Gly-Asp) yang
membantu respons selulernya yang lebih baik dibandingkan dengan firoin sutra fibroin asli. Dalam
fibroin ulat sutra, dua heksapeptida berulang secara teratur di seluruh struktur protein
(heksapeptida GAGAGS diulang 433 kali, sedangkan GAGAGY diulang 120 kali). Struktur fibroin sutra
A. mylitta tidak diketahui, sehingga jumlah pengulangan yang tepat dari urutan RGD tidak diketahui.

2.1. Sutra mulberi

Fibroin sutra kasar dari kelenjar sutra larva B. mori dewasa terdiri dari rantai besar (H, 325–395 kDa),
rantai ringan (L, 25–26 kDa), dan fibroheksamerin atau P25 (30 kDa). Subunit P25 B. mori adalah
glikoprotein yang mengandung rantai oligosakarida terikat-Asn, yang bertanggungjawab atas
kelarutan fibroin dengan membentuk kompleks kuarterner. Setiap subunit polipeptida P25 mengikat
enam unit rantai H dan L (menghasilkan rasio P25:H:L 1:6:6). Gen yang mengkode ketiga polipeptida
ini berada pada kromosom yang berbeda, dan interaksinya sangat penting untuk sekresi fibroin.
Rantai H terdiri dari dua ekson (67 dan 15.750 bp) dan satu intron (971 bp). Rantai L B. mori
panjangnya 13,4 kb, terdiri dari tujuh ekson. Ekson pertama menempati 60% dari gen. Rantai
panjang bersifat hidrofobik, sedangkan rantai pendek relatif hidrofilik. Fibroin ulat sutra
menunjukkan konformasi sekunder yang beragam, yaitu struktur yang didominasi koil dan a-heliks
yang acak (disebut Sutra 1) dan struktur yang didominasi lembar-b (disebut Sutra 2). Urutan
berulang alanin dan glisin dalam serat ulat sutra tersusun menjadi lembaran-b anti-paralel yang
memberikan kekuatan mekanis pada serat sutra. Lipatan-b memfasilitasi ikatan silang dalam protein
melalui ikatan hydrogen yang kuat dan interaksi van der Waals, yang secara dramatis meningkatkan
kekuatan serat. Spacer amorf yang bersifat asam yang berada diantara dua anti-paralel lembar-b
bertanggungjawab atas resistensi UV. Struktur fibroin sutra homolog dengan kolagen tipe I asli.

Rantai panjang terdiri dari glisin (46%), alanin (30%) dan serin (12%); motif berulang (Tipe b)
mengandung 12 dipeptida, (12 GX)n, X sebesar 65% Ala, 23% Ser, dan 10% Tyr, sedangkan rantai L
nonfiber terutama mengandung valin, isoleusin dan leusin. Selama pemrosesan fibroin sutra,
perubahan konformasi dicatat. Urutan polimorfik sutra I, sutra II (lipatan-b) dan sutra III (pliglisin II
seperti heliks tiga kali lipat) telah diidentifikasi untuk fibroin C [(–GAGAGS–)n]. Fibroin A (GAGAGY)
dan fibroin V (GDVGGA GATGGS) adalah peptida amorf dan sebagian besar berkontribusi pada sutra
I.

Perlakuan fibroin A dengan metanol secara bertahap mengubah sutra I menjadi sutra II, dengan
proporsi b-turn menengah yang tinggi. Transformasi seperti ini tidak terjadi pada fibroin V. fibroin C
(GAGAGS) menunjukkan struktur untai-b dalam larutan. Setelah adsorpsi, fibroin A Kembali menjadi
sutra I. Tidak seperti fibroin A dan V, fibroin C memiliki urutan sutra fibroin yang dapat dikristalkan.

Fibroin sutra telah digunakan untuk benang operasi sejak awal abad terakhir. Penggunaan tersebut
telah menunjukkan bahwa bahan sutra memiliki biokompatibilitas yang sangat baik dan reaksi
imunogenik minimal. FDA telah menyetujui benang sutra untuk aplikasi peraikan jaringan lunak,
mengklasifikannya sebagai implan yang tidak dapat diserap dan tidak dapat terurai. Biomaterial
berbasis sutra berhasil digunakan untuk regenerasi berbagai jaringan, termasuk jaringan
musculoskeletal.

2.2. Sutra nonmulberi

Varietas sutra nonmulberi dari tasar, eri, dan muga disebut sebagai sutra liar dan endemic di wilayah
tertentu di dunia. Namun, tidak satu pun varietas ini yang dibudidayakan secara ekstensif seperti
sutra murbei. Beberapa tahun terakhir varietas sutra nonmulberi telah berkembang karena urutan
tripeptida bawaannya yaitu RGD. RGD dianggap memediasi adhesi sel dan membantu diferensiasi sel
menjadi jaringan rangka. Fibroin sutra asli B. mori tidak memiliki peptida RGD, meskipun
mengandung sekuens TGRGDSPA dari fibronektin yang mengandung triplet mirip RGD. Kehadiran
dari urutan RGD merupakan keunggulan sutra nonmurbei, khususnya A. mylitta, dibandingkan sutra
murbei.

Fibroin sutra A. mylatta, diperoleh dari kelenjar sutra, adalah dimer 395-kDa dari dua subunit protein
homogen masing-masing 197 kDa. Dari fibroin Saturniidae lainnya, A. assama memiliki subunit 220-
dan 20-kDa, sedangkan fibroin sutra P. ricini memiliki subunit 97- dan 45-kDa. Semua fibroin ini tidak
memiliki rantai ringan atau polipeptida P25. Struktur kristal fibroin nonmulberi sebagian besar terdiri
dari lipatan-b antiparallel (tipe b3 a, mengandung polialanin [–(Ala)n–] urutan berulang) dan hanya
sejumlah kecil heliks-a. Polialanin [–(Ala)n–] bersifat hidrofobik tidak seperti –(Gly-Ala)n– yang
ditemukan pada serat sutra murbei, yang memberikan lebih banyak hidrofobisitas pada sutra
nonmurbei daripada varian murbei.

2.3. Sutra laba-laba

Sutra laba-laba, seperti dari ulat sutra, terutama mengandung asam amino seperti glisin dan alanin
tetapi kekurangan protein serisin. Laba-laba menghasilkan berbagai sutra dengan beragam fungsi
-dari membangun jaring hingga menangkap mangsa- masing-masing dengan urutan asam amino
yang berbeda. Berat molekul sutra laba-laba berkisar antara 70-700 kDa. Salah satu sutra laba-laba
yang paling banyak dipelajari adalah protein spidroin ampullat utama (sutra dragline) dari spesies
Nephila clavipes, dengan BM 250-350 kDa; dengan susunan yang sama seperti fibroin B. mori,
dengan nanokristal terorganisir sepanjang sumbu panjang dan domain menengah amorf.

Sutra dragline N. clavipes memiliki kepadatan rendah, kekuatan tinggi, dan perpanjangan putus yang
besar yang besar. Dua jenis protein sutra dragline telah diidentifikasi sejauh ini: spiroin 1 ampulla
utama (MaSp1) dan spidroin 2 ampulla utama (MaSp2); mereka dibuat dari urutan berulang
polialanin (4-10 pengulangan) yang diapit di antara urutan kaya glisin. Protein serat memiliki struktur
lembaran-b yang dominan dan tiga motif: (i) b-spiral elastis yang mengandung banyak motif GPG-XX
(XX adalah variabel); (ii) lembaran-b kristal, kaya akan alanin; dan (iii) pengulangan ketat (GGX) asam
amino, mungkin dalam bentuk heliks. Motif keempat dicadangkan untuk daerah perantara yang
strukturnya saat ini tidak diketahui.

3. Influence of fabrication techniques on silk bone scaffold properties

3.1. Mechanical strength

The natural strength of silk fibers makes them materials of interest in bone tissue engineering. Silk is
among the strongest natural fibers with 0.6 GPa strength, 0.8 extensibility and 70 MJ m3 toughness
[58]. The robust mechanical strength of the bone is imparted by the hierarchical assembly of
collagen fibers.

This hierarchy can be mimicked by nanofibrous silk scaffolds. Cells deposit neo-matrix along the
fibers, contributing to the overall mechanical robustness of the engineered tissue construct.
Biomaterials fabricated from regenerated silk protein fibroin fail to exhibit the same strength as the
native silk fibers because of the absence of compact hydrogen bonding at the inter-molecular level.

Use of chaotropic agents (e.g., lithium bromide) during silk cocoon dissolution results in irreversible
disruption of intermolecular Hbonds [59]. However, this may be overcome by modifications in the
processing of silk solution such as the use of protic-ionic liquid systems [60,61]. The processing
methods also control the degradation rate of silk-based scaffolds; annealing using water produces
more flexible and fast degradable silk films than those produced using methanol annealing. Addition
of temperature control to water vapor annealing fine-tunes the crystallinity of silk, thus, in turn,
regulating the thermal, mechanical and biodegradation properties [62].

The ease of processing of silk facilitates its designing into different physical forms with adjusted
mechanical characteristics [63]. In cell or functional biomolecule encapsulation, silk is processed
entirely in mild aqueous solutions, avoiding the effect of any harsh technique or chemicals [64]. The
mechanical strength of different silk biomaterials and typical skeletal tissues is summarized in Fig. 1
and Table 1.

3.2. Controllable degradation and biocompatibility

Scaffold degradation rate should be complementary with the rate of bone regeneration, while the
degradation by-products should not adversely affect the body tissue [71–73]. By controlling the
amount of b-sheet and the secondary structure, the rate of biodegradation can be controlled [74]
from weeks to a year [75].
Silk cocoon fiber processing solvents imprint effects on the secondary structure of the regenerated
silk fibroin: organic solventprocessed biomaterials take a year or more to get completely absorbed in
vivo [24,31,75,76], while aqueous solvent-based scaffolds do not last beyond 6 months in vivo [75].
Slow degradation of silk scaffolds is helpful in repairing critical bone defects as the scaffold can
support the structure until native tissue is completely functional [77]. Further, the primary amino
acid composition of silk fibroin is glycine and alanine, which are the by-products of silk degradation.
These by-products can be reused in vivo as templates for neo-protein synthesis [78], preventing the
accumulation of degraded products at any local site. Hence, silk biomaterials do not commonly
trigger hyperinflammation or immunogenic reactions [79]. The low–molecular-weight degraded
products of silk are not completely congenial to surrounding tissue [24] and may lead to the
activation of macrophages and immune cells. The degree of immune response evoked by silk
biomaterials is comparable to that by well-established medical implants, under both in vitro and in
vivo conditions [21,80-82]. This indicates the suitability of silk to create functional tissue analogs. Silk
fibroin, as a protein, is susceptible to proteolytic degradation caused by enzymes such as protease
XIV, alpha-chymotrypsin and collagenase IA [83,84]. Since amyloid b-fibrils are associated with
Alzheimer’s disease, degradation of the b-sheet structure of fibroin raises a concern. However, in
vitro assays confirm the noncytotoxic nature of degradation products form silk fibroin toward
neuronal cells [85]. Peptides released from silk fibroin during degradation also contribute to
inflammation control and collagen production by osteoblasts—both features that are again useful
for bone regrowth.

Silk I is water soluble, while silk II is not, silk fibroin degradation rate is affected by the relative
proportions of silk I and II. Greater silk II proportion, i.e., more b-sheet structures, lengthens
degradation time [86]. Silk films with lower proportion of b-sheet content degrade faster [86,87].
Films produced by slow drying of concentrated aqueous fibroin solution yield the lowest b-sheet
content [87].

3.3. Ease in handling

Versatile stable silk frameworks, such as hydrogels, coatings, films, porous structures, and
nano/microfibrous matrices, are easily generated from silk solution by imparting conformational
changes from a-helix to b- sheet, with good permeability to oxygen and nutrients [79,88,89]. Silk
biomaterials can be sterilized by autoclaving or by ethylene oxide, c-radiation or 70% ethanol
treatment [43], leaving no effect on the visible structural stability of silk biomaterials; however,
these processes trigger some conformational changes, which further affect the rate of degradation
[90].

Therefore, the method of sterilization should be selected carefully, considering the goal of the study,
especially if the biomaterial is loaded with bioactive molecules. Further, the large-scale production
of silk by sericulture practice presents an economical source of silk for its use in biomedical research.
One silkworm cocoon provides a good amount of pure silk protein fibroin and sericin, depending
upon the source/variety (mulberry or nonmulberry), size, and weight of the cocoon. For example, a
typical B. mori silkworm cocoon can weigh between 120–160 mg, of which, about 20–30% is sericin
and 70–80% is fibroin, with traces of waxes and carbohydrates [91].

3.4. Biomineralization

The fibroin template can regulate the morphology and structure of HAp crystals, orienting their
growth along the c-axis [92,93]. The tripeptide sequence of RGD serves as cell adhesion motif,
facilitating crosstalk between cells and biomaterials. The natural presence of RGD in nonmulberry
silk fibroin [94] results in less crystalline HAp formation with calcium deficiency, similar to that of
biological apatite (calcium deficiency, with a Ca to P ratio close to 1.67).

Treatment of fibroin with methanol induces b-sheet formation, while exposure to calcium chloride
further stabilizes the b-sheet, resulting in faster HAp crystal formation [95,96]. Fibroin in the
presence of simulated body fluid self-assembles from random coil to b-sheet, along with the
nucleation of HAp [97]. The incorporation of the RGD sequence in the mulberry B. mori silk fibroin
through chemical modification [42,98], by blending (with spidroin in an optimal proportion of 9 to 1;
90% fibroin, 10% spidroin) [37] or by recombinant technology using Escherichia coli [99], leads to
effective HAp nucleation [99], which eventually results in bone formation. Dragline spider silk itself
serves as a natural template for HAp mineralization [56].

3.5. Silk: limitations

The peptides formed as a part of silk degradation have a positive impact on cellular activity [100].
The co-existence of sericin with fibroin in the native silk fiber, when used together as a suture, may
trigger antigenic reaction [80]. These limitations of silk biomaterials, however, can be overcome by
adjusting the processing steps, using physical and/or chemical modifications, or by adding other
polymers/minerals. Follow-up discussions in the next section include the strategies applied so far in
processing silk biomaterials for bone tissue engineering to overcome these limitations.