BAB III

PROTEIN
 A. PENDAHULUAN
Protein berasal dari bahasa Yunani Proteios
berarti Utama.
Protein merupakan makromolekul penyusun
lebih dari 50% berat kering seluruh organisme.
E. coli mempunyai sekitar 5000 senyawa organik,
3000 berupa protein.
Manusia diperkirakan mempunyai sekitar
5.000.000 protein
Di alam diperkirakan ada 1010-1012 jenis protein
Protein mempunyai berbagai fungsi dari sifat
katalitik sampai tanggap toksik, Tabel 1.
Contoh struktur protein struktural dan fungsional
pada Gambar 1.
 Tabel 1. Penggolongan protein berdasarkan fungsi biologinya
FUNGSI JENIS CONTOH
Katalitik Enzim Lipase, Protease, Isomerase, Papain
Struktural Protein struktural Kolagen (pengikat jaringan dan tulang);
a-Keratin (rambut, kulit); Elastin, Fibroin
(serat sutra), Proteoglikan.
Penyimpanan Protein transport Kasein (susu); Ovalbumin (telor); Feritin
(zat makanan) (penyimpan besi); Gliadin (gandum), dll
Pengangkutan Protein transport Serum Albumin (asam lemak), Hemoglobin
(zat makanan) (oksigen), Lipoprotein (lipid)
Motil (mekanik) Protein Kontraktil Aktin, Miosin (otot), Tubulin, Kinesin
Pengatur/ Protein Hormon Insulin; Hormon tumbuh; Represor
regulator (mengatur biosintesis enzim); Hormon
(metabolisme) Paratiroid ( mengatur transport Ca2+)
Perlindungan Antibodi Imunoglobulin, vaksin
(kekebalan, Protein Fibrinogen, Trombin
darah) Penggumpal
Tanggap toksik Protein Toksin Bisa ular, toksin bakteri (bortulisme, difteri);
Risin (tumbuhan beracun)
Gambar 1. (a) Protein struktural umumnya berupa serat dan tidak larut dalam
air, contoh kolagen yang tersusun dari 3 rantai polipeptida. (b) Protein dengan
fungsi metabolik, strukturnya kompak benrbentuk globular, contoh Myoglobulin.
Bentuk foding menyebabkan rantai samping hidrofilik terletak di luar sehingga
mudah larut dalam air.
 B. STRUKTUR PROTEIN
Protein tersusun oleh 20 asam amino, membentuk
ikatan peptida. Bila terdapat beberapa peptida
disebut Oligopeptida, bila banyak disebut
Polipeptida atau Protein. Gambar 2.
Protein bisa merupakan satu rantai polipeptida
maupun beberapa rantai polipeptida yang satu
dengan lainnya membentuk ikatan atau interaksi
tertentu.
Perbedaan komposisi dan urutan asam amino
penyusunnya membuat perbedaan sifat protein satu
dengan lainnya. Tabel 2.
Residu asam amino sekitar 100 sampai 1800 lebih,
dengan kisaran Mr antara 12.000 sampai lebih dari
106, Tabel 3.
Gambar 2.
(a). Reaksi pembentukkan ikatan
peptida.
(b) Rantai polipeptida dengan rantai (a)
utama berbentuk planar, lainnya berupa
rantai samping asam amino (R).

(b)
 Tabel 2.
Komposisi asam
amino beberapa
protein (%)

Catatan :
RNase : Ribonuklease A
sapi, 124 aa, tanpa
triptopan.
ADH : Alkohol
Dehidrogenase hati
kuda, 374 aa.
Mb : Myoglobulin,
sperma ikan paus, 153
aa, tanpa sistein
Histon H3 : DNA binding
protein di kromosom,
135 aa. Banyak Arg &
Lys, tanpa trp.
Kolagen : protein
struktural ekstraseluler,
ada aa tidak umum,
banyak Gly & Pro,
tanpa Cys & Trp,
kurang aa aromatik.
 Tabel 3. Data molekuler beberapa protein

Jenis Protein Mr Jumlah Jumlah

Residu Rantai
Insulin (sapi) 5.733 51 2
Sitokrom C (manusia) 13.000 104 1
Ribonuklease A (pankreas sapi) 13.700 124 1
Lisozim (putih telur) 13.930 129 1
Mioglobulin (jantung kuda) 16.890 153 1
Kemotripsin (pankreas sapi) 22.600 241 3
Hemoglobin (manusia) 64.500 574 4
Serum Albumin (manusia) 68.500 550 1
Heksokinase (ragi) 102.000 800 2
g-Globulin (kuda) 149.900 1250 4
RNA polimerase (E.coli) 450.000 4.158 5
Glutamin sintase (E. coli) 619.000 5.628 12
Glutamat dehidrogenase (hati sapi) 1.000.000 8.300 40
B.1. STRUKTUR PRIMER
Struktur primer protein merupakan polipeptida
menggambarkan
urutan asam amino penyusunnya
Serta jembatan disulfida (bila ada)
Penulisan dapat berupa urutan struktur kimianya
atau singkatan nama asam aminonya, contoh
penulisan pada Gambar 3.
Asam amino dengan a-amino bebas disebut
sebagai N-ujung atau N-terminal atau amino
ujung
Asam amino dengan karboksilat bebas disebut
sebagai C-ujung atau C-terminal atau
karboksilat ujung
(a)

Ala-Phe-Cys-Leu-Glu-Gly-Val

(b)

Gambar 3. Struktur
primer protein
(a) Urutan asam amino,
(b) urutan asam amino
dengan 4 ikatan
disulfida dari RNA sapi
B.2. STRUKTUR SEKUNDER
Struktur sekunder (Gambar 4) merupakan
struktur primer ditambah dengan
Ikatan hidrogen antar residu asam amino
berdekatan
Ikatan H membentuk folding untuk meminimumkan
driving force gugus hidrofobik dengan pelarut.
Struktur a-Heliks, ikatan H pada satu rantai
polipeptida. Merupakan penyusun utama protein
serat seperti a-Keratin dalam rambut, wol dan kuku.
Struktur lembaran b-berlipat ikatan H terjadi antar
rantai polipeptida, contoh struktur ini terdapat pada
sutera.
Protein serat (Fibrous) merupakan pengulangan
struktur sekunder, biasanya tidak larut dalam air.
 Gambar 4.
Struktur sekunder protein
berupa a-Heliks dan
lembaran b-berlipat (b-
pleted sheet)

a-Heliks b-Sheet
B.3. STRUKTUR TERSIER
Struktur tersier terjadi karena beberapa interaksi
rantai samping, menyebabkan struktur
polipeptida yang lebih stabil, Gambar 5,
Interaksi yang terjadi :
Ikatan disulfida,
Ikatan Hidrogen
Interaksi Hidrofobik dan
Interaksi Ionik
Struktur tersier tersusun oleh satu rantai
polipeptida
Struktur tersier terdapat pada Protein Globular,
dengan konformasi yang fleksibel untuk
menjalankan fungsi biologinya.
 (a) (b)

Gambar 5. Struktur Tersier Protein. (a) Interaksi antar gugus rantai

samping residu asam amino. (b) Contoh struktur tersier protein
B.4. STRUKTUR KUARTERNER
Struktur kuarterner merupakan interaksi antara beberapa
polipeptida tersier, membentuk Protein Globular.
Protein tersier bisa tersusun dari beberapa sub-unit
polipeptida yang sama disebut sebagai protomer
sedangkan oleh sub-unit berbeda disebut oligomer.
Contoh Hemoglobin tersusun dari 4 polipeptida dengan
2 sub-unit berbeda a dan b, Gambar 6. Struktur globular
Hb yang fleksibel memungkinkan pengikatan oksigen.
Struktur tiga dimensi Ribonuklease (a), hasil analisis
diffraksi sinar-X (b) dan penggambaran abstraksi rantai
polipeptida bentuk b-strand (panah datar) dan a-heliks
(pita spiral), Gambar 7.
Hubungan antara struktur primer, sekunder, tertier dan
kuartener ditampilkan pada Gambar 8, ilustrasi lengkap
pada Gambar 9.
Gambar 6. Struktur kuartener Hemoglobin yang tersusun dari 4
polipeptida dengan 2 sub-unit berbeda a dan b,
(a) (b)

(c)
Gambar 7.
Struktur tiga dimensi
Ribonuklease (a), hasil analisis
diffraksi sinar-X (b) dan
penggambaran abstraksi rantai
polipeptida bentuk b-strand
(panah datar) dan a-heliks (pita
spiral)(c).
Gambar 8. Hubungan antara struktur primer, sekunder, tertier
dan kuartener
Gambar 9.
Ilustrasi bentuk struktur
primer, sekunder, tersier
dan kuartener
 C. PROTEIN KONJUGASI
Protein Konjugasi adalah protein yang mempunyai
atau terikat secara permanen dengan senyawa bukan
asam amino.
Gugus Prostetik adalah senyawa non asam
mainonya.
Pengelompokkan dilakukan berdasarkan sifat gugus
prostetiknya, Tabel 4.
Lipoprotein adalah protein yang berkonjugasi dengan
lipid, merupakan komponen plasma darah yang
berfungsi sebagai transport lipid ke bagian tenpat
sintesis membran.
Glikoprotein adalah protein yang mempunyai bagian
karbohidrat, biasanya merupakan ekstraseluler protein,
seperti Fibronektin dan Proteoglikan merpakan kulit sel
serta membran sel. Imunoglobulin G merupakan
antibodi glikoprotein yang terdapat di darah.
Tabel 4
Nukleoprotein mempunyai gugus prostetik RNA
atau DNA, berperan dalam penyimpanan dan
transmisi informasi genetik. Ribosom merupakan
tempat sintesis protein. Partikel Virus dan
kromosom protein dengan asam nukleat.
Fosfoprotein adalah protein yang mempunyai
gugus fosfat yang teresterifikasi pada gugus OH
dari serin, treonin atau tirosin. Kasein merupakan
protein yang banyak mengandung fosfat, berfungsi
untuk pertumbuhan anak.
Metaloprotein bisa sebagai penyimpan metal
(contoh feritin), maupun sebagai kofaktor enzim
yang berperan pada aktifitas katalitik.
Hemoprotein, merupakan subklas dari
metaloprotein, karena heme merupakan senyawa
Fe-protoforpirin.
Flavoprotein mengandung gugus flavin yang
penting dalam oksidoreduktase.
D. SIFAT ASAM BASA PROTEIN

Sifat keasaman residu asam amino sangat

mempengaruhi sifat protein yang dibentuk,
dapat dilihat pada harga pI-nya, Tabel 5.
Harga pI < 7,0 peptida bersifat asam sedangkan
pI > 7,0 bersifat basa.
Harga pI tidak dipengaruhi oleh Mr atau jumlah
residu asam amino maupun jumlah polipeptida
penyusun proteinnya, Tabel 6.
Tabel 5. Pengaruh komposisi asam amino terhadap harga pI

Peptida pK1 pK2 pKR pI

(a-COOH) (a-NH4+) (gugus R)
Glisin (Gly) 2,34 9,60 - 5,97
Alanin (Ala) 2,34 9,69 - 6,02
Lisin (Lis) 2,18 8,95 10,53 9,74
Asam Aspartat (Asp) 2,09 9,82 3,86 3,01
Gly-Gly 3,06 8,13 - 5,59
Gly-Gly-Gly 3,26 7,91 - 5,58
Gly-Ala 3,17 8,23 - 5,70
Ala-Gly 3,16 8,24 - 5,70
Ala-Ala-Ala-Ala 3,42 7,94 - 5,68
Ala-Ala-Lis-Ala 3,58 8,01 10,58 9,3
Gly-Asp 2,81 8,60 4,45 3,6
 Tabel 6. Konstanta fisik dan pI beberapa protein
Konstanta Konstanta
Protein Mr Difusi Sedimen pI
(Dx107) tasi (S)

Sitokrom C (hati sapi) 13.370 11,40 1,17 10,6

Mioglobin (hati kuda) 16.900 11,30 2,04 7,0
Kimotripsinogen (pankreas sapi) 23.240 9,50 2,54 9,5
b-Laktalbumin (susu kambing) 37.100 7,50 2,90 5,2
Hemoglogin (manusia) 64.500 6,90 4,50 6,9
Serum Albumin (manusia) 68.500 6,10 4,60 4,9
Katalase (liver kuda) 247.500 4,10 6,40 5,6
Fibrinogen (manusia) 339.700 3,40 7,60 5,1
Urease (buah nangka) 482.700 1,98 11,30 5,5
Miosin (cod) 524.800 1,10 18,60 -
Virus mozaik tembakau 40.590.000 0,46 198,00 -
 E. REAKSI PROTEIN
Reaksi protein berlangsung pada gugus amino
bebas, karboksilat bebas dan beberapa gugus
samping asam amino.
Penentuan Asam Amino Bebas (N-terminal)
a. Pereaksi Sanger. Reaksi antara gugus amino bebas
dengan Dinitroflourobenzen (DNFB) membentuk
polipeptida-DNP (dinitrofenil). Hidrolisis polipeptida
akan menghasilkan DNP-asam amino. Gambar 10.
DNP-asam amino ditentukan dengan kromatografi.
b. Dansyl Klorida. Reaksi antara gugus amino bebas
dengan Danzyl (Diaminonaftilensulfonil) membentuk
turunan polipeptida-Danzyl. Hidrolisis polipeptida akan
menghasilkan Danzyl-asam amino yang berfluorosensi
sehingga dapat ditentukan dengan spektrofluorometri,
lebih teliti dari pereaksi Sanger. Gambar 11.
 DNFB

Derivat DNP-peptida

Gambar 10. Pereaksi Sanger (Dinitroflourobenzen, DNFB) dengan

asam amino bebas, menghasilkan derivat DNP-aa.
 (berfluorosensi)
+

Gambar 11. Pereaksi Danzyl (Diaminonaftilensulfonil) dengan asam

amino bebas, menghasilkan derivat danzyl.
c. Degradasi Edman. Peraksi Edman
(fenilisotiosianat, fenil-N=C=S) dalam
suasana basa lemah bereaksi dengan asam
amino bebas setelah dihidolisis dengan asam
lemah menghasilkan derivat feniltiohidantoin
(PTH), Gambar 12.
Penentuan Karboksilat Bebas (C-terminal)

– Reduksi dengan LiAlH4. Karboksilat bebas

akan direduksi dengan pereduksi kuat
membentuk alkohol. Hidrolisis peptida akan
menghsilkan amino alkohol. Gambar 13.
Gambar 12. Degradasi Edman, perekasi Edman (fenilisotiosianat)
dengan asam amino bebas, menghasilkan derivat
PTH.
Gambar 13. Reduksi C-terminal menghasilkan amino alkohol.
F. ASAM AMINO SEQUENCING
Sequencing asam amino dari polipeptida
pertama kali dilakukan oleh Sanger dari
Universitas Cambridge tahun 1958.
Sekarang sudah ditentukan sequence lebih
dari 20000 protein.
Protein Sequencing Strategy.
1. Pemisahan polipeptida dari protein yang
tersusun lebih dari satu polipeptida
2. Pemutusan ikatan disulfida (S-S)
intrapolipeptida
3. Penentuan komposisi asam amino masing-
masing polipeptida
4. Identifikasi C-terminal dan N-terminal
5. Pemutusan polipeptida menjadi fragmen
lebih kecil, dilanjutkan dengan penentuan
komposisi dan sequence masing-masing
fragmen.
6. Pengulangan step 5 dengan prosedur
pemutusan berbeda, menghasilkan
overlaping fragmen polipeptida
7. Rekonstruksi keseluruhan asam amino dari
overlaping fragmen
8. Pembentukan jembatan sulfida S-S dari
lokasi residu sistein
F.1. Pemutusan rantai polipeptida

Ikatan nonkovalen antar polipeptida multimerik

protein dipisahkan dengan pH ekstrim, 8 M urea,
6 M guanidium hidroklorida atau dengan larutan
garam pekat.
Perlakuan tersebut ditujukan untuk memutus
interaksi polar seperti ikatan H antar polipeptida
dan dengan pelarut air.
Masing-masing fraksi polipeptida dipisahkan dan
ditentukan urutan asam aminonya.
Ikatan silang S-S antar polipeptida diputuskan
dengan metode pada F2.
F.2. Pemutusan jembatan disulfida (S-S)

Banyak metode pemutusan ikatan S-S seperti

pada Gambar 14, antara lain :
 Oksidasi Asam Performat, membentuk 2 asam
sisteat
 Reduksi dan Alkilasi Disulfida, senyawa
sulfhidril seperti 2-merkaptoetanol akan segera
mereduksi S-S menjadi 2 sistein-SH. Untuk
menjaga pembentukan ikatan S-S kembali, perlu
dilakukan proteksi dengan alkilasi menggunakan
iodoasetat atau asetonitril.
Gambar 14.
Pemutusan ikatan
S-S protein.
(a) pemutusan
secara oksidasi dan
(b) secara reduksi.
Proteksi SH dengan
iodoasetat (1) atau
asetonitril (2)
F.3. Analisis komposisi dan identifikasi
residu N- dan C-terminal
Komposisi asam amino dilakukan dengan cara
menghidrolisis dan menganalisisnya dengan
teknik kromatografi
Analisis N-terminal dilakukan dengan metode
a. Sanger, Gambar 10.
b. Danzyl Klorida, Gambar 11.
c. Degradasi Edman, Gambar 12.
d. Leucine Peptidase yang memutus rantai
peptida pada N-terminal, yang nonpolar
seperti Leusin, tidak memutus residu prolin.
 Analisis C-terminal, metode yang digunakan :
a. Hidrazinolisis atau Reaksi Akabori. Polipeptida
ditreatmen dengan hidrazin (H2N-NH2) pada
100oC, seluruh ikatan peptida akan terputus
membentuk derivat hidrazidanya kecuali untuk
asam amino pada C-terminal, Gambar 15.
b. Reduksi C-terminal dengan LiAlH4, Gambar 13.
c. Analisis dengan Karboksipeptidase, memutus
ikatan peptida pada C-terminal.
 Karboksipeptidase A (hog pankreas),
memutus C-terminal kecuali dengan residu
prolin, arginin dan lisin
 Karboksipeptidase B (hog pankreas),
memutus C-terminal arginin dan lisin.
 Gabungan Karboksipeptidase A dan B,
memutus semua C-terminal kecuali prolin
 Karboksipeptidase C dan Y (ragi) memutus
semua C-terminal
Gambar 15. Hidrazinolisis dengan pereaksi Akabori menghasilkan
asam amino terhidrazi dan asam amino bebas dari C-
terminal.
F.4. FRAGMENTASI RANTAI POLIPEPTIDA

Tujuan Fragmentasi adalah didapatkannya produk

fragmen yang spesifik dan sekecil mungkin .
Umumnya dilakukan secara enzimatik.
Fragmen yang sudah dipisahkan ditentukan dengan
degradasi Edman.
Tripsin. Tripsin banyak digunakan untuk proteolisis
spesifik pada gugus karbonil dari Arginin dan Lisin,
dihasilkan fragmen dengan C-terminal Arginin dan
Lisin. Jumlah fragmen akan sama dengan jumlah
residu arginin dan lisin dalam protein, Gambar 16.
Kimotripsin. Kimotripsin menghidrolisis peptida
pada gugus karbonil asam amino aromatik seperti
Fenilalanin, Tirosin dan Triptopan.
Gambar 16.
Hidrolisis
tripsin,
spesifik
untuk C-
terminal dari
residu Arg &
Lys.
Clostripain. Clostripain enzim dengan spesifitas mirip
dengan tripsin, menghidrolisis gugus C dari Arg jauh
lebih besar daripada Lys.
Protease stapilococcal, menghidrolisis residu gugus
C Asp dan Glu pada buffer fosfat. Bila digunakan
buffer asetat atau karbonat, maka yang terhidrolisis
adalah Glu.
Endopeptidase non-spesifik seperti Papain, Pepsin,
Subtilisin, Termilisin dan Elastase.
Sianogen Bromida. CNBr merupakan reagen spesifik
untuk memutus atom S dari Met, Gambar 17.
Metode Fragmentasi lain. Metode kimia yang
digunakan antara lain untuk memotong ikatan
Asparagin-Glisin dengan hidroksilamin (NH2OH),
ikatan Aspartil-Prolil dengan asam.
Rangkuman metode hidrolisis pada Tabel 7.
Gambar 17. Hidrolisis dengan reagen Ciano bromida (CNBr) selektif
terhadap residu Metionin menghasilkan peptida denga C-terminal
berupa homoserin lakton.
Tabel 7.
F.5. REKONSTRUKSI URUTAN ASAM AMINO
Sequence dari berbagai fragmen dari dua atau lebih
metode fragmenasi dicari overlap-nya, Gambar 18.
Lokasi S-S ditentukan dari residu sisteinnya.
Sequence Database, telah dirangkum dalam :
 Atlas of Protein Sequence and Structure.
 PIR (Protein Indentification Resource Protein Database),
eletronic file.
 EMBL (European Molecular Biology Laboratory Data
Library), elektronic file.
Sifat dari Asam Amino Sequence. List frekuensi relatif
komposisi asam amino pada berbagai protein seperti pada
Tabel 8.
 Protein membran lebih banyak mempunyai asam amino
hidrofobik dan sedikit ionik.
 Protein globular mempunyai komposisi yang sangat
mirip dengan tabel tersebut. Protein serat tidak mengikuti
pola tersebut.
Gambar 18. Asam amino sequencing polipeptida dengan
mengelusidasi fragmen yang overlap, dihasilkan “Inferred
sequence”.
Tabel 8.