IDENTIFIKASI SENYAWA, PENENTUAN KADAR FENOL,

DAN UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN EKSTRAK ETANOL

BATANG KECOMBRANG (Etlingera elatior) DENGAN
VARIASI WAKTU MASERASI

SKRIPSI

Oleh:
I PUTU BAYU KENANDA
NIM. 1308105003

PROGRAM STUDI KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS UDAYANA
BUKIT JIMBARAN
2021
 IDENTIFIKASI SENYAWA, PENENTUAN KADAR FENOL, DAN UJI
AKTIVITAS ANTIOKSIDAN EKSTRAK ETANOL BATANG
KECOMBRANG (Etlingera elatior) DENGAN VARIASI WAKTU
MASERASI

SKRIPSI

Skripsi ini diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains (S.Si.) di Program Studi Kimia
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Universitas Udayana

Oleh:
I Putu Bayu Kenanda
NIM. 1308105003

Menyetujui:
Pembimbing I Pembimbing II

Dr. Dra. Ni Wayan Bogoriani, M.Si. Dr. Drs. K. G. Dharma Putra, M.Sc.
NIP. 19661231199303 2 006 NIP. 19601007198601 1 001

Mengesahkan
Koordinator Program Studi Kimia
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Universitas Udayana

Dr.Drs. Made Siaka, M.Sc (Hons)

NIP. 19641231199103 1 027

ii
 KATA PENGANTAR

Puji syukur penulis panjatkan ke hadirat Tuhan Yang Maha Esa atas
rahmat dan perlindungan-Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan Skripsi
yang berjudul “Identifikasi Senyawa, Penentuan Kadar Fenol, Dan Uji Aktivitas
Antioksidan Ekstrak Etanol Batang Kecombrang (Etlingera elatior) dengan
Variasi Waktu Maserasi” dengan baik. Skripsi ini dibuat sebagai salah satu syarat
untuk menyelesaikan Program Sarjana di Program Studi Kimia Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana.
Penulisan Skripsi ini tidak terlepas dari bantuan dan bimbingan dari
berbagai pihak, oleh karena itu pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima
kasih kepada:
1. Ibu Dr. Dra. Ni Wayan Bogoriani, M.Si. selaku Pembimbing I yang senantiasa
memberikan bimbingan, arahan, dan saran dalam menyelesaikan penulisan
Skripsi ini.
2. Bapak Dr. Drs. Ketut Gede Dharma Putra, M.Sc. selaku Pembimbing II yang
telah memberikan bimbingan dan saran dalam menyelesaikan Skripsi ini.
3. Bapak Dr. Drs. I Made Siaka, M.Sc (Hons) selaku Koordinator Program Studi
Kimia FMIPA Universitas Udayana.
4. Keluarga, teman-teman, dan semua pihak yang telah memberikan bantuan dan
dukungan selama penulisan Skripsi ini.
Penulis menyadari bahwa Skripsi ini masih jauh dari sempurna. Oleh
sebab itu penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun dari pembaca
sehingga Skripsi ini dapat diteruskan untuk dilaksanakan penelitian.

Jimbaran, Mei 2021

Penulis

iii
 DAFTAR ISI

Halaman
PENGESAHAN................................................................................................... ii
KATA PENGANTAR.......................................................................................... iii
ABSTRAK........................................................................................................... v
DAFTAR ISI........................................................................................................ vii
DAFTAR TABEL................................................................................................ x
DAFTAR GAMBAR............................................................................................ xi
DAFTAR LAMPIRAN........................................................................................ xii
BAB I PENDAHULUAN.................................................................................... 1
1.1 Latar Belakang Penelitian........................................................................
............................................................................................................................1
1.2 Rumusan Masalah................................................................................... 5
1.3 Tujuan Penelitian.................................................................................... 5
1.4 Manfaat Penelitian...................................................................................
............................................................................................................................5
BAB II TINJAUAN PUSTAKA.......................................................................... 6
2.1 Kecombrang............................................................................................
............................................................................................................................6
2.1.1 Nama lain kecombrang....................................................................
............................................................................................................................7
2.1.2 Senyawa kimia kecombrang............................................................
............................................................................................................................7
2.1.3 Manfaat kecombrang.......................................................................
............................................................................................................................8
2.2 Ekstraksi..................................................................................................
............................................................................................................................9
2.2.1 Jenis pelarut.....................................................................................
............................................................................................................................9
2.2.2 Metode ekstraksi..............................................................................
..........................................................................................................................10
2.3 Senyawa Metabolit Sekunder..................................................................
..........................................................................................................................12
2.4 Radikal Bebas..........................................................................................
..........................................................................................................................16
2.5 Antioksidan.............................................................................................
..........................................................................................................................20
2.5.1 Sumber-sumber antioksidan............................................................
..........................................................................................................................21
2.5.2 Mekanisme kerja antioksidan..........................................................
..........................................................................................................................22

iv
 2.5.3 Pengujian antioksidan......................................................................
..........................................................................................................................24
2.6 Liquid Chromatography–Mass Spectrometry (LC-MS/MS)..................
..........................................................................................................................25
BAB III METODE PENELITIAN....................................................................... 27
3.1 Bahan dan Peralatan Penelitian...............................................................
..........................................................................................................................27
3.1.1 Bahan penelitian..............................................................................
..........................................................................................................................27
3.1.2 Peralatan penelitian.........................................................................
..........................................................................................................................27
3.2 Tempat Penelitian....................................................................................
..........................................................................................................................27
3.3 Tempat Pengambilan Sampel..................................................................
..........................................................................................................................28
3.4 Prosedur Penelitian..................................................................................
..........................................................................................................................28
3.4.1 Penyiapan sampel dan penentuan kadar air.....................................
..........................................................................................................................28
3.4.2 Ekstraksi batang kecombrang .........................................................
..........................................................................................................................29
3.4.3 Uji fitokimia....................................................................................
..........................................................................................................................29
3.4.3.1 Uji polifenol...........................................................................
..........................................................................................................................30
3.4.3.2 Uji flavonoid..........................................................................
..........................................................................................................................30
3.4.3.3 Uji saponin.............................................................................
..........................................................................................................................30
3.4.3.4 Uji alkaloid............................................................................
..........................................................................................................................30
3.4.3.5 Uji steroid dan terpenoid.......................................................
..........................................................................................................................30
3.4.4 Penentuan kadar fenol ....................................................................
..........................................................................................................................31
3.4.4.1 Pembuatan larutan standar.....................................................
..........................................................................................................................31
3.4.4.2 Analisis sampel......................................................................
..........................................................................................................................31
3.4.5 Analisis kapasitas antioksidan ........................................................
..........................................................................................................................32
3.4.6 Analisis ekstrak dengan LC-MS/MS ..............................................
..........................................................................................................................33
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN.............................................................. 34
4.1 Ekstrak Etanol Batang Kecombrang........................................................ 34
4.2 Uji Fitokimia............................................................................................ 34
4.3 Penentuan Kadar Fenol Total................................................................... 38
v
 4.4 Aktivitas Antioksidan............................................................................... 40
4.4.1 Analisis ekstrak dengan LC-MS/MS............................................... 42
BAB V SIMPULAN DAN SARAN.................................................................... 46
DAFTAR PUSTAKA........................................................................................... 47
LAMPIRAN......................................................................................................... 52

vi
 DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel 4.1 Hasil Uji Fitokimia Ekstrak Etanol Batang Kecombrang ................... 34
Tabel 4.2 Hasil Pengukuran Absorbansi Standar Asam Galat ............................ 39

vii
 DAFTAR GAMBAR

Halaman
Gambar 2.1 Tanaman Kecombrang...................................................................... 6
Gambar 2.2 Kerangka C6-C3-C6 Flavonoid.......................................................... 15
Gambar 3.1 Lokasi Pengambilan Sampel Batang Kecombrang........................... 28
Gambar 4.1 Reaksi Antara Polifenol dengan FeCl3............................................. 35
Gambar 4.2 Reaksi Terbentuknya Garam Flavilium ........................................... 36
Gambar 4.3 Reaksi Pembentukan Kalium Alkaloid dengan Pereaksi Wagner ... 37
Gambar 4.4 Reaksi Steroid/Terpenoid dengan Pereaksi Liebermann-Burchard . 38
Gambar 4.5 Hasil kromatogram LC-MS/MS Ekstrak Etanol Batang
Kecombrang ................................................................................................. 43
Gambar 4.6 Spektrum LC-MS/MS Ekstrak Etanol Batang Kecombrang Waktu
Retensi 2,121 Menit ..................................................................................... 43
Gambar 4.7 Struktur Maklurin ............................................................................ 44
Gambar 4.8 Spektrum LC-MS/MS Ekstrak Etanol Batang Kecombrang Waktu
Retensi 7,961 Menit ..................................................................................... 44
Gambar 4.9 Struktur Cosmosiin .......................................................................... 45

viii
 DAFTAR LAMPIRAN

Halaman
Lampiran 1 Bagan Alur Penelitian....................................................................... 52
Lampiran 2 Skema Pembuatan Ekstrak Etanol Batang Kecombrang.................. 53
Lampiran 3 Perhitungan Rendamen Ekstrak........................................................ 54
Lampiran 4 Perhitungan Kadar Air...................................................................... 55
Lampiran 5 Penentuan Persamaan Regresi Standar Asam Galat......................... 57
Lampiran 6 Perhitungan Persen Inhibisi dan IC50................................................ 60
Lampiran 7 Spektrum LC-MS/MS Pada Waktu Retensi..................................... 64
Lampiran 8 Surat Keterangan Determinasi Tanaman Kecombrang..................... 65

ix
 ABSTRAK

Tanaman kecombrang merupakan salah satu tanaman yang memiliki potensi

antioksidan alami. Aktivitas antioksidan dari suatu tanaman tergantung pada jumlah
senyawa aktif terekstraksi dan metode ekstraksinya. Penelitian ini bertujuan untuk
mengetahui rendamen, kadar fenol total dan nilai IC50 ekstrak etanol batang
kecombrang dengan variasi waktu maserasi, dan untuk mengetahui jenis senyawa
yang terkandung pada ekstrak batang kecombrang yang memiliki aktivitas
antioksidan. Pengujian aktivitas antioksidan menggunakan DPPH. Hasil uji
fitokimia ekstrak etanol batang kecombrang menunjukkan hasil positif untuk
senyawa polifenol, flavonoid, saponin, alkaloid, dan steroid. Waktu maserasi 6, 12,
18, dan 24 jam menghasilkan rendamen masing-masing sebesar 8,03; 10,27; 11,71;
dan 14,04%. Hasil pengukuran kadar fenol total ekstrak etanol batang kecombrang
tiap waktu maserasi yaitu 2,44; 3,87; 6,94; dan 6,56 mg Gallic Acid Equivalent per
gram (GAE/g). Nilai IC50 tiap waktu maserasi sebesar 196,37; 184,19; 170,96; dan
181,49 mg/L. Ekstrak etanol batang kecombrang yang memiliki kadar fenol total
dan aktivitas antioksidan tertinggi yaitu pada waktu maserasi selama 18 jam.
Senyawa yang terkandung pada ekstrak batang kecombrang yang kemungkinan
memiliki aktivitas antioksidan yaitu maklurin dan kosmosin.

Kata kunci : antioksidan, batang kecombrang, fenol, waktu maserasi

x
 ABSTRACT
Torch ginger is one of the plants that has natural antioxidant potential. The
antioxidant activity of a plant depends on the amount of active compounds
extracted and their extraction methods. This study aims to determine the yield,
find out the effect of maceration time on total phenol levels, IC50, and to determine
the types compounds contained in the extract of torch ginger stems that have
antioxidant activity. DPPH was used to measure antioxidant activity.
Phytochemical test results of torch ginger stem ethanol extract showed positive
results for polyphenols, flavonoids, saponins, alkaloids, and steroids. Maceration
time is 6, 12, 18, and 24 hours. Yields per maceration time is 8.03; 10.27; 11.71;
and 14.04%, respectively. The measurement of total phenol from ethanol extract
of torch ginger stem per maceration time is 2.44; 3,87; 6,94; and 6.56 mg Gallic
Acid Equivalent per gram (GAE/g). IC50 values per maceration time are 196.37;
184.19; 170.96; and 181.49 mg/L. Ethanol extract of torch ginger stem that has
the highest total phenol content is at maceration time for 18 hours. The highest
antioxidant activity of torch ginger stems is at the time of maceration for 18 hours.
The compound contained in the extract of torch ginger stem that is likely to have
an antioxidant activity are maclurin and cosmosiin.

Keywords: antioxidants, torch ginger stem, phenol, maceration time

xi
 BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang Penelitian

Pengetahuan akan efek radikal bebas terhadap munculnya penyakit

degeneratif yang terus berkembang mendorong semakin bertambahnya

penggunaan senyawa antioksidan (Boer, 2000). Radikal bebas merupakan suatu

molekul yang memiliki elektron tidak berpasangan dalam orbital terluarnya

sehingga bersifat reaktif. Radikal ini cenderung mengadakan reaksi berantai yang

apabila terjadi di dalam tubuh akan dapat menimbulkan kerusakan-kerusakan

yang berlanjut dan terus menerus. Tubuh manusia memiliki sistem pertahanan

endogen terhadap serangan radikal bebas terutama dalam proses metabolisme sel

normal dan peradangan. Jumlah radikal bebas dapat mengalami peningkatan yang

diakibatkan faktor stress, radiasi, asap rokok dan polusi lingkungan yang dapat

menyebabkan sistem pertahanan tubuh tidak memadai, sehingga tubuh

memerlukan tambahan antioksidan dari luar yang dapat melindungi dari serangan

radikal bebas. Reaksi autooksidasi senyawa radikal bebas dalam oksidasi lipid

dapat dihambat dengan menggunakan antioksidan alami. Antioksidan bekerja

dengan mendonorkan elektronnya kepada molekul radikal bebas, sehingga dapat

menstabilkan radikal bebas dan menghentikan reaksi berantai (Sies, 1997).

Senyawa antioksidan dapat diperoleh dari berbagai sumber, salah satunya

adalah dari tanaman. Tanaman kecombrang (Etlingera elatior) adalah satu dari

sekian banyak jenis tanaman yang memiliki potensi sebagai antioksidan alami.

Hampir seluruh bagian tanaman kecombrang mulai dari rimpang, batang, daun,
1
 2

hingga bunga mengandung senyawa metabolit sekunder yang berpotensi sebagai

antioksidan, seperti fenolik, flavonoid, triterpen, saponin, tanin, steroid, alkaloid,

dan glikosida (Naufalin, 2005).

Penelitian pada berbagai tanaman obat telah dilaporkan oleh beberapa

peneliti, dan menyatakan bahwa banyak tanaman obat yang mengandung

antioksidan dalam jumlah besar. Efek antioksidan terutama disebabkan karena

adanya senyawa fenol seperti flavonoid dan asam fenolat. Berdasarkan penelitian

Gazali et al., (2019), ekstrak etil asetat daun nipah (N. fruticans) asal Pesisir Barat

Aceh memiliki aktivitas antioksidan yang sangat kuat dengan nilai IC 50 8,81

µg/mL. Kandungan senyawa bioaktif yang dominan mempengaruhi aktivitas

antioksidan dan berperan sebagai obat penyakit degeneratif adalah flavonoid,

fenolik, tanin dan saponin (Bogoriani et al., 2019). Senyawa-senyawa yang

memiliki aktivitas antioksidan adalah senyawa fenol yang mempunyai gugus

hidroksi yang tersubstitusi pada posisi ortho dan para terhadap gugus –OH dan –

OR (Andayani et al., 2008). Menurut Tamat et al., (2007) menyatakan bahwa

senyawa fenol dengan gugus hidroksil yang terikat pada cincin aromatik

merupakaan senyawa yang efektif sebagai antioksidan karena senyawa tersebut

mampu meredam radikal bebas dengan cara memberikan atom hidrogen (donor

proton) dari gugus hidroksil kepada radikal bebas.

Ekstraksi adalah proses pemisahan komponen-komponen dalam larutan

berdasarkan perbedaan kelarutannya. Ekstrak batang, rimpang, daun, dan bunga

kecombrang dapat diperoleh dengan cara ekstraksi. Aktivitas antioksidan dari

suatu tanaman tergantung pada jumlah senyawa aktif yang terekstraksi dan

metode ekstraksinya. Faktor-faktor yang mempengaruhi laju ekstraksi adalah tipe

 3

persiapan sampel, waktu ekstraksi, jumlah sampel, suhu, dan jenis pelarut (Utami,

2009). Selama proses ekstraksi, bahan aktif akan terlarut oleh pelarut yang sesuai

sifat kepolarannya. Ekstraksi dapat dilakukan dengan metode maserasi. Maserasi

merupakan metode sederhana yang paling banyak digunakan. Cara ini sesuai, baik

untuk skala kecil maupun skala industri (Agoes, 2007). Metode maserasi dapat

menghindari rusaknya senyawa-senyawa yang bersifat termolabil (Mukhriani,

2014).

Waktu ekstraksi juga sangat berpengaruh terhadap senyawa yang

dihasilkan (Budiyanto dan Yulianingsih, 2008). Waktu maserasi yang tepat akan

menghasilkan senyawa yang optimal. Ramdja et al. (2009) menyatakan bahwa

waktu maserasi yang terlalu lama tidak akan berpengaruh lagi karena jumlah

pelarut dalam zat terlarut telah jenuh dan dapat merusak senyawa bioaktif yang

terlarut. Fauzana (2010) melaporkan bahwa hasil rendamen ekstrak rimpang

temulawak dengan waktu maserasi kurang dari 18 jam menghasilkan rendamen

yang rendah yaitu dibawah 12,60%. Lebih lanjut dilaporkan bahwa semakin lama

waktu maserasi yaitu dari 4 jam hingga 24 jam, hasil rendamen ekstrak semakin

meningkat. Lamanya ekstraksi mempengaruhi aktivitas antioksidan yang

dihasilkan. Pengaruh waktu maserasi ekstrak etanol batang kecombrang hingga

saat ini belum dilaporkan.

Ekstraksi senyawa antioksidan dari tanaman umumnya menggunakan jenis

pelarut dengan tingkat kepolaran yang berbeda, seperti etanol, etil asetat, dan n-

heksan. Pemilihan pelarut berdasarkan tingkat kepolaran sangat bermanfaat untuk

mendapatkan ekstrak dengan rendamen yang lebih besar dan senyawa antioksidan

yang memiliki aktivitas tertinggi dapat terekstrak (Lestario et al., 2001). Aktivitas
 4

antioksidan batang kecombrang dari ekstrak air dan ekstrak etanol yang diperoleh

melalui metode pengujian dengan 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) dengan nilai

IC50 180,75 mg/L memiliki kemampuan antioksidan lemah; dan 44,58 mg/L

memiliki kemampuan antioksidan sangat kuat (Silvany et al., 2016). Pengujian

aktivitas antioksidan ekstrak batang kecombrang dengan menggunakan metode

DPPH pada masing–masing ekstrak hasil fraksinasi dengan pelarut n-heksan, etil

asetat dan etanol menunjukkan nilai IC50 secara berturut–turut 711,6758; 760,7322

dan 535,7828 ppm (Susana et al., 2018). Perbandingan nilai IC50 pada ketiga jenis

pelarut yang berbeda-beda menurut tingkat kepolarannya menunjukkan bahwa

pelarut etanol memiliki aktivitas antioksidan tertinggi karena memiliki nilai IC50

yang paling kecil jika dibandingkan dengan pelarut etil asetat serta n-heksan. Hal

ini diduga karena di dalam sampel batang kecombrang banyak terdapat senyawa

bioaktif yang bersifat polar jika dibandingkan dengan senyawa bioaktif yang

bersifat nonpolar dan semi polar sehingga pelarut polar (etanol) lebih banyak

menarik komponen bioaktif yang ada pada batang kecombrang tersebut. Oleh

karena itu, pada penelitian ini akan digunakan pelarut etanol.

Pengujian aktivitas antioksidan menggunakan DPPH karena sangat sesuai

untuk mengukur aktivitas total antioksidan dalam pelarut polar atau larut air

maupun dalam pelarut nonpolar atau larut minyak (Prakash et al., 2001). Alasan

lain dari penggunaan DPPH adalah lebih sederhana, cepat, akurat, dan tidak

memerlukan banyak sampel. Pada pengujian aktivitas antioksidan menggunakan

DPPH, parameter yang ditentukan adalah nilai Inhibitory Concentration

(IC50). Definisi nilai IC50 adalah konsentrasi ekstrak yang dapat menyebabkan

 5

50% DPPH kehilangan karakter radikal atau konsentrasi suatu zat antioksidan

yang memberikan persentase penghambatan 50% (Mulja dan Suharman, 1995).

1.2 Rumusan Masalah

Berdasarkan paparan latar belakang di atas, dapat dirumuskan permasalahan

sebagai berikut:

1. Berapakah rendamen, kadar fenol total dan nilai IC50 ekstrak etanol batang

kecombrang untuk waktu maserasi 6, 12, 18, dan 24 jam?

2. Senyawa apakah yang terkandung pada ekstrak batang kecombrang yang

memiliki aktivitas antioksidan?

1.3 Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk:

1. Mengetahui rendamen, kadar fenol total dan nilai IC50 ekstrak etanol batang

kecombrang untuk waktu maserasi 6, 12, 18, dan 24 jam.

2. Mengetahui senyawa yang terkandung pada ekstrak batang kecombrang yang

memiliki aktivitas antioksidan.

1.4 Manfaat Penelitian

Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi ilmiah mengenai

pengaruh waktu maserasi batang kecombrang terhadap kadar fenol, aktivitas

antioksidan tertinggi, rendamen ekstrak batang kecombrang, dan senyawa yang

terkandung pada ekstrak batang kecombrang yang memiliki aktivitas antioksidan.

 BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

1.1 Kecombrang

Kecombrang merupakan tanaman yang hidupnya tahunan dengan

ketinggian 1-3 meter (Gambar 2.1). Tanaman ini banyak ditemukan di daerah

pegunungan atau daerah-daerah rindang dekat air dengan ketinggian 800 meter di

atas permukaan air laut. Kecombrang memiliki beberapa nama latin, seperti

Etlingera elatior, Nicolaia speciosa Horan, Nicolaia elatior Horan, Phaeomeria

magnifica, Phaeomeria speciosa, Phaeomeria intermedia Valet (Tampubolon et

al., 1983).

Gambar 2.1 Tanaman Kecombrang

Menurut Hidayat dan Hutapea (1991), tanaman honje (E. elatior) memiliki

taksonomi sebagai berikut:

Kingdom : Plantae

6
 7

Divisi : Magnoliophyta

Kelas : Liliopsida

Ordo : Zingiberales

Famili : Zingiberaceae

Genus : Etlingera

Spesies : Etlingera elatior

Nama-nama daerah tempat tanaman kecombrang tumbuh yaitu kalo (Gayo),

puwa kijung (Minangkabau), katinbung (Makassar), salahawa (Seram), petikala

(Ternate). Di luar negeri, kecombrang dikenal dengan nama ginger bud (Inggris),

xiang bao jiang (Cina), gingembre aromatique (Perancis), kantan (Malaysia),

boca de dragon (Spanyol) dan kaa laa (Thailand) (Hidayat dan Hutapea, 1991).

2.1.1 Senyawa kimia kecombrang

Hasil penelitian oleh Jaffar et al. (2007) pada daun, batang, bunga dan

rimpang tanaman kecombrang menunjukkan adanya beberapa jenis minyak

esensial yang kemungkinan bersifat bioaktif. Ekstraksi minyak esensial dilakukan

dengan metode hidrodistilasi, sedangkan analisanya dilakukan dengan alat Gas

Chromatography Mass Spectrometer (GC-MS). Dari hasil penelitian ini diperoleh

kandungan minyak esensial tertinggi pada daun sebesar 0,0735%, pada bunga

sebesar 0,0334%, pada batang sebesar 0,0029% dan pada rimpang sebesar

0,0021%. Komponen utama minyak esensial pada daun adalah β-pinene (19,7%),

caryophyllene (15,36%) dan β-farnesene (27,9%).

2.1.2 Manfaat kecombrang

Kecombrang merupakan salah satu jenis tanaman rempah yang sejak lama

dikenal dan dimanfaatkan oleh manusia sebagai obat-obatan. Bagian tanaman

 8

yang umum digunakan adalah bunga dan batangnya. Kecombrang digunakan

sebagai pemberi citarasa pada masakan, seperti urab, pecel, sambal dan masakan

lain. Batang kecombrang digunakan sebagai pemberi citarasa pada masakan

daging. Kecombrang juga dimanfaatkan sebagai obat-obatan berkaitan dengan

khasiatnya, yaitu sebagai penghilang bau badan dan bau mulut (Hidayat dan

Hutapea, 1991).

Dalam literatur kuno disebutkan juga kegunaan dari tanaman ini sebagai

bahan kosmetik alami. Bunga kecombrang digunakan untuk campuran cairan

pencuci rambut dan daun serta rimpang dipakai untuk bahan campuran bedak oleh

penduduk lokal. Penggunaan kecombrang untuk tujuan tersebut ternyata

mempunyai basis ilmiah karena hasil penelitian membuktikan bahwa daun dan

rimpang tanaman ini mempunyai aktivitas antibakteri sehingga dapat

membersihkan rambut sekaligus memberikan wangi tertentu. Selain itu, ekstrak

tanaman ini ternyata mampu menghambat enzim tyrosinase (Chan et al., 2007).

Hasil studi lain menunjukkan bahwa tanaman kecombrang juga dapat

dipakai untuk mengobati penyakit-penyakit yang tergolong berat yaitu kanker dan

tumor. Senyawa kimia stigmast-4-en-3-one dan stigmast-4-en-6b-ol-3-one dari

rimpang terbukti mempunyai sifat menghambat pertumbuhan tumor berdasarkan

Epstein Barr Virus-Early Antigens (EBV-EA) assay. Senyawa-senyawa tersebut

juga bersifat sitotoksik terhadap kultur sel kanker CEM-SS (LC50 4 μg/ml) dan

MCF-7 (LC50 6.25 μg/ml) berdasarkan Methyl Thiazole Tetrazolium (MTT) assay

sehingga direkomendasikan untuk dapat dipakai sebagai obat atau campuran obat

anti kanker (Habsah et al., 2005).

 9

2.2 Ekstraksi

Ekstraksi adalah kegiatan penarikan kandungan kimia yang dapat larut

sehingga terpisah dari bahan yang tidak dapat larut dengan pelarut cair. Hasil dari

proses ekstraksi adalah ekstrak. Ekstrak adalah sediaan kental yang diperoleh

dengan mengekstraksi senyawa aktif dari simplisia nabati atau hewani

menggunakan pelarut yang sesuai, kemudian semua atau hampir semua pelarut

diuapkan dan massa atau serbuk yang tersisa diperlakukan sedemikian hingga

memenuhi baku yang telah ditetapkan (Sampurno, 2000).

Ekstraksi adalah penyarian zat-zat berkhasiat atau zat-zat aktif dari bagian

tanaman obat, hewan dan beberapa jenis ikan termasuk biota laut. Zat-zat aktif

terdapat di dalam sel. Sel dalam tanaman dan hewan berbeda, demikian pula

ketebalannya, sehingga diperlukan metode ekstraksi dengan pelarut yang sesuai.

Tujuan ekstraksi bahan alam adalah untuk menarik komponen kimia yang terdapat

pada bahan alam. Ekstraksi ini didasarkan pada prinsip perpindahan massa

komponen zat ke dalam pelarut. Perpindahan massa mulai terjadi pada lapisan

antar muka kemudian berdifusi masuk ke dalam sel (Harborne, 1987).

2.2.1 Jenis pelarut

Pelarut yang banyak digunakan adalah air. Air adalah pelarut yang kuat,

melarutkan banyak jenis zat kimia. Zat-zat yang bercampur dan larut dengan baik

dalam air (misalnya garam-garam) disebut sebagai zat-zat "hidrofilik" (pencinta

air), dan zat-zat yang tidak mudah tercampur dengan air (misalnya lemak dan

minyak), disebut sebagai zat-zat "hidrofobik" (takut-air). Kelarutan suatu zat

dalam air ditentukan oleh kemampuan zat tersebut menandingi kekuatan gaya
 10

tarik-menarik listrik (gaya intermolekul dipol-dipol) antara molekul-molekul air.

Jika suatu zat tidak mampu menandingi gaya tarik-menarik antar molekul air,

molekul-molekul zat tersebut tidak larut dan akan mengendap dalam air (Azis,

2009).

2.2.2 Metode Ekstraksi (Harborne, 1987)

A. Ekstraksi secara soxhletasi

Sokhletasi merupakan metode ekstraksi secara berkesinambungan. Cairan

penyari (pelarut) dipanaskan sampai mendidih. Uap penyari akan naik melalui

pipa samping, kemudian diembunkan lagi oleh pendingin tegak. Cairan penyari

turun untuk menyari zat aktif dalam simplisia. Selanjutnya bila cairan penyari

mencapai sifon, maka seluruh cairan akan turun ke labu alas bulat dan terjadi

proses sirkulasi. Demikian seterusnya sampai zat aktif yang terdapat dalam

simplisia tersari seluruhnya yang ditandai jernihnya cairan yang lewat pada

tabung sifon.

B. Ekstraksi secara perkolasi

Perkolasi dilakukan dengan cara dibasahkan 10 bagian simplisia dengan

derajat halus yang cocok, menggunakan 2,5 sampai 5 bagian cairan penyari yang

dimasukkan dalam bejana tertutup sekurang-kurangnya 3 jam. Massa dipindahkan

sedikit demi sedikit ke dalam perkolator, ditambahkan cairan penyari. Perkolator

ditutup dibiarkan selama 24 jam, kemudian kran dibuka dengan laju alir 1

mL/menit, sehingga simplisia tetap terendam. Filtrat dipindahkan ke dalam

bejana, ditutup dan dibiarkan selama 2 hari pada tempat terlindung dari cahaya.

C. Ekstraksi secara maserasi

 11

Maserasi merupakan cara ekstraksi yang paling sederhana. Bahan simplisia

yang dihaluskan sesuai dengan syarat farmakope (umumnya terpotong-potong

atau berupa serbuk kasar) disatukan dengan bahan pengekstraksi. Selanjutnya

rendaman tersebut disimpan terlindung dari cahaya langsung (mencegah reaksi

yang dikatalisis cahaya atau perubahan warna) dan diaduk. Waktu lamanya

maserasi berbeda-beda. Secara teoritis pada suatu proses maserasi tidak

memungkinkan terjadinya ekstraksi absolut. Semakin besar perbandingan cairan

pengekstraksi terhadap simplisia, akan semakin banyak hasil yang diperoleh

(Voigt, 1994).

Maserasi digunakan untuk penyarian simplisia yang mengandung zat aktif

yang mudah larut dalam cairan penyari, tidak mengandung zat yang mudah

mengembang dalam cairan penyari, tidak mengandung benzoin dan sitrat.

Maserasi dilakukan dengan merendam serbuk simplisia dalam cairan penyari.

Cairan penyari atau pelarut yang digunakan dapat berupa air, etanol, air-etanol,

atau pelarut lain. Pelarut-pelarut tersebut dapat bersifat polar contohnya air dan

ada bersifat nonpolar atau pelarut organik seperti aseton, etil asetat, etanol, dan

lainnya. Ketika simplisia yang akan dimaserasi direndam dalam pelarut yang

dipilih, maka cairan penyari akan menembus dinding sel dan masuk ke dalam sel

yang banyak mengandung zat aktif dan zat aktif tersebut akan larut dalam cairan

penyari. Sementara itu, penyari yang berada di luar sel tidak mengandung zat aktif

sehingga menimbulkan perbedaan konsentrasi zat aktif di dalam dan di luar sel

yang akan menimbulkan gaya difusi. Larutan paling pekat akan keluar untuk

mencapai kesetimbangan konsentrasi antara zat aktif di dalam dan di luar sel.

Proses kesetimbangan ini akan berhenti, setelah terjadi kesetimbangan konsentrasi

 12

atau telah mencapai kondisi jenuh. Dalam kondisi ini zat aktif di dalam dan di luar

sel akan memiliki konsentrasi yang sama (Voigt, 1994).

D. Ekstraksi secara refluks

Proses ekstraksi dengan cara refluks hampir sama dengan sokhletasi. Bahan

yang akan diekstraksi direndam dengan cairan penyari dalam labu alas bulat yang

dilengkapi dengan alat pendingin tegak, lalu dipanaskan sampai mendidih. Cairan

penyari akan menguap, uap tersebut akan diembunkan dengan pendingin tegak

dan akan kembali menyari zat aktif dalam simplisia tersebut, demikian seterusnya.

Ekstraksi ini biasanya dilakukan 3 kali dan setiap kali ekstraksi selama 4 jam.

E. Ekstraksi secara penyulingan uap

Penyulingan dapat digunakan untuk menyari serbuk simplisia yang

mengandung komponen kimia yang mempunyai titik didih yang tinggi pada

tekanan udara normal, yang pada pemanasan biasanya terjadi kerusakan zat

aktifnya. Untuk mencegah hal tersebut, maka penyari dilakukan dengan

penyulingan.

2.3 Senyawa Metabolit Sekunder

Senyawa metabolit sekunder adalah senyawa metabolit yang tidak esensial

bagi pertumbuhan organisme dan ditemukan dalam bentuk yang unik atau

berbeda- beda antara spesies yang satu dan lainnya. Setiap organisme biasanya

menghasilkan senyawa metabolit sekunder yang berbeda-beda, bahkan satu jenis

senyawa metabolit sekunder ada yang hanya ditemukan pada satu spesies dalam

suatu kingdom. Senyawa metabolit sekunder merupakan molekul kecil yang

dihasilkan oleh suatu organisme tetapi tidak secara langsung dibutuhkan dalam
 13

mempertahankan hidupnya, tidak seperti protein, asam nukleat, dan polisakarida

yang merupakan komponen dasar untuk proses kehidupan (Saifudin, 2014).

Beberapa contoh dari senyawa metabolit sekunder antara lain saponin,

terpenoid, steroid, alkaloid, flavonoid, polifenol.

a. Saponin

Saponin adalah suatu glikosida alami yang berasal dari tanaman. Berdasarkan

penelitian Lakshmi et al. (2012) efek yang paling menonjol setelah pemberian diet

saponin pada tikus yang mengalami aterosklerosis adalah penurunan jumlah

kolesterol VLDL, LDL, dan peningkatan kolesterol HDL. Hal ini diduga karena

adanya hambatan penyerapan kolesterol dan asam empedu di usus, sehingga

memacu sintesis kolesterol di hati yang dikonversi menjadi asam empedu lalu

disekresikan ke usus dan feses.

b. Terpenoid

Terpenoid yang dikenal juga sebagai minyak atsiri merupakan komponen

tumbuhan yang memiliki bau khas dan dapat diisolasi dengan metode

penyulingan. Sebagian besar terpenoid mempunyai kerangka karbon yang

dibangun oleh dua atau lebih unit C-5 yang disebut unit isopren. Senyawa

terpenoid diketahui memiliki aktivitas sebagai antifungi. Mekanisme kerja

terpenoid sebagai antifungi yaitu senyawa ini dapat larut dalam lemak sehingga

mampu menembus membran sel fungi dan mempengaruhi permiabilitasnya

sehingga menimbulkan gangguan pada struktur dan fungsi membran sel fungi

(Dewick, 1999).

c. Steroid
 14

Steroid merupakan senyawa metabolit sekunder dengan berbagai fungsi

biologis yang penting dan tersebar luas dalam jaringan tumbuhan maupun hewan.

Steroid terdiri atas beberapa kelompok senyawa berdasarkan pada efek fisiologis

yang diberikan oleh masing-masing senyawa. Kelompok tersebut adalah sterol,

asam- asam empedu, hormon seksual, hormon adrenokortikoid, aglikon kardiak

dan sapogenin (Dewick, 1999). Senyawa golongan steroid yang digunakan luas

dalam dunia pengobatan dan kontrasepsi diantaranya adalah androgen yang

merupakan hormon steroid yang dapat menstimulasi organ seksual jantan,

estrogen dapat menstimulasi organ seksual betina, dan adrenokortikonoid dapat

mencegah peradangan dan rematik (Etika dan Suryelita, 2014). Hormon estrogen

diketahui dapat meningkatkan high density lipoprotein (HDL) kolesterol,

menurunkan low density lipoprotein (LDL) kolesterol, dan sebagai antioksidan

dalam mencegah proses oksidasi LDL (Shintawati et al., 2011).

d. Alkaloid

Alkaloid adalah suatu golongan senyawa organik yang terbanyak ditemukan

di alam. Hampir semua alkaloida yang ditemukan di alam mempunyai aktivitas

biologis tertentu, ada yang bersifat racun, namun ada pula yang digunakan dalam

pengobatan. Misalnya kuinin, morfin dan stiknin adalah alkaloida yang terkenal

mempunyai efek fisiologis dan psikologis. Kebanyakan alkaloid dengan aktivitas

biologis pada manusia mempengaruhi sistem saraf, terutama sebagai

neurotransmiter kimia misalnya asetilkolin, epinefrin, norepinefrin, asam gamma

aminobutirat (GABA), dopamin dan serotonin. Alkaloid dapat berfungsi sebagai

zat antioksidan, sebagai bioaktif penolak (repellent) nyamuk serta alkaloid indol

memilki aktifitas antibakteri dari Aspidosperma ramiflorum (Dewick, 1999).

 15

e. Flavonoid

Senyawa flavonoid adalah suatu kelompok senyawa fenol yang terbesar yang

ditemukan di alam. Senyawa-senyawa ini merupakan zat warna merah, ungu dan

biru serta sebagai zat warna kuning yang ditemukan dalam tumbuh-

tumbuhan. Flavonoid mempunyai kerangka dasar karbon yang terdiri dari 15 atom

karbon, dengan dua cincin benzen (C6) terikat pada suatu rantai propana (C3)

sehingga membentuk suatu susunan C6 – C3 – C6. Flavonoid dapat menurunkan

kadar glukosa darah karena sifatnya sebagai zat anti oksidan. Flavonoid bersifat

protektif terhadap kerusakan sel β sebagai penghasil insulin serta dapat

meningkatkan sensitivitas insulin. Antioksidan dapat menekan apoptosis sel beta

tanpa mengubah proliferasi dari sel beta pankreas. Antioksidan dapat mengikat

radikal bebas sehingga dapat mengurangi resistensi insulin (Redha, 2010).

Flavonoid berperan sebagai antioksidan dengan cara mendonasikan atom

hidrogennya atau melalui kemampuannya mengkelat logam, berada dalam bentuk

glukosida (mengandung rantai samping glukosa) atau dalam bentuk bebas yang

disebut aglikon (Cuppett et al., 1954).

Gambar 2.2 Kerangka C6-C3-C6 Flavonoid

 16

Metode Kuantifikasi Flavonoid

Metode kuantifikasi flavonoid klasik yang paling banyak digunakan adalah

kolorimetri atau spektrofotometri dengan menggunakan pereaksi AlCl3.

Alumunium klorida digunakan sebagai pereaksi pengompleks dengan gugus orto-

dihidroksi dan menimbulkan pergeseran khas menuju pita panjang gelombang

tinggi yang berguna pada analisis beberapa golongan flavonoid. Reaksi AlCl3 dan

flavonoid akan membentuk kompleks tahan asam antara gugus hidroksi dan keton

yang bertetangga sedangkan dengan gugus hidroksi pada kedudukan orto,

kompleks yang terjadi tidak tahan asam. Penetapan kadar secara kolorimetri harus

memenuhi beberapa kriteria, antara lain: selektivitas reaksi warna, kesebandingan

antara warna dan kadar, kestabilan warna, reprodusibilitas, kejernihan larutan, dan

sensitivitas.

f. Polifenol

Polifenol adalah kelompok senyawa kimia yang ditemukan pada tumbuhan

yang memiliki banyak gugus fenol dalam molekulnya. Senyawa fenol merupakan

suatu senyawa yang mengandung gugus hidroksil (-OH) yang terikat langsung

pada gugus cincin hidrokarbon aromatik. Klasifikasi senyawa fenol yang

terkandung dalam tumbuhan yaitu fenol sederhana, benzokuinon, asam fenolat,

asetofenon, naftokuinon, xanton, bioflavonoid kumarin, stilben, turunan tirosin,

asam hidroksi sinamat, flavonoid, lignan, dan tanin (Dewick, 1999). Aktivitas

antioksidan dari fenol disebabkan karena senyawa fenol membentuk ion fenoksida

yang dapat memberikan satu elektronnya kepada radikal bebas. Polifenol berperan

dalam memberi warna pada suatu tumbuhan seperti warna daun saat musim

gugur.
 17

2.4 Radikal Bebas

Menurut Soeatmaji (1998), yang dimaksud radikal bebas (free radical)

adalah suatu senyawa atau molekul yang mengandung satu atau lebih elektron

tidak berpasangan pada orbital luarnya. Adanya elektron yang tidak berpasangan

menyebabkan senyawa tersebut sangat reaktif mencari pasangan, dengan cara

menyerang dan mengikat elektron molekul yang berada di sekitarnya. Radikal

bebas memiliki reaktivitas yang sangat tinggi. Hal ini ditunjukkan oleh sifatnya

yang segera menarik atau menyerang elektron di sekelilingnya. Senyawa radikal

bebas juga dapat mengubah molekul menjadi radikal. Target utama radikal bebas

adalah protein, asam lemak tak jenuh dan lipoprotein, serta unsur DNA termasuk

karbohidrat. Serangan radikal bebas terhadap molekul sekelilingnya akan

menyebabkan terjadinya reaksi berantai, yang kemudian menghasilkan senyawa

radikal baru.

Menurut Winarsi (2007), tahapan reaksi pembentukan radikal bebas mirip

dengan rancidity oxidative, yaitu melalui 3 tahapan reaksi berikut:

1. Tahap inisiasi, yaitu awal pembentukan radikal bebas.

M++ + H2O → M+++ + OH- + •OH

R1-H + •OH → R1• + H2O

2. Tahap propagasi, yaitu pemanjangan rantai radikal

R2-H + R1• → R2• + R1-H

R3-H + R2• → R3• + R2-H

Panjang rantai dari reaksi ini adalah R3• > R2• > R1• karena telah

mengalami reaksi propagasi.

 18

3. Tahap terminasi, yaitu reaksi senyawa radikal dengan radikal lain atau dengan

penangkap radikal, sehingga potensi propagasinya rendah.

R1• + R1• → R1-R1

R2• + R1• → R2-R1

R2• + R2• → R2-R2

Zat radikal bebas yang terlalu banyak dapat menyebabkan terjadinya

tekanan oksidatif (oxidative stress) di dalam tubuh. Tekanan oksidatif adalah

suatu keadaan dengan tingkat reactive oxygen intermediate (ROI) yang toksik

melebihi pertahanan antioksidan endogen. Kelebihan radikal bebas akan bereaksi

dengan asam nukleat seluler, protein, dan lemak, sehingga terjadi kerusakan lokal

dan disfungsi organ tertentu. Lemak merupakan biomolekul yang rentan terhadap

serangan radikal bebas (Arief, 2006). Beberapa akibat yang ditimbulkan oleh

radikal bebas, antara lain:

1. Kerusakan DNA

Kerusakan sel akibat reaktivitas senyawa radikal mengawali timbulnya

berbagai penyakit degeneratif seperti kanker, infeksi, rheumatoid, liver, dan aging.

Keadaan ini terjadi karena interaksi senyawa oksigen reaktif dengan DNA

membentuk DNA adduct selama proses replikasi, yang berakibat terjadinya

mutasi DNA. Kerusakan DNA ditunjukkan oleh bagian gula dan basa yang mudah

teroksidasi sehingga menyebabkan degradasi dan hancurnya single strand

(Winarsi, 2007).

2. Kerusakan protein

Protein dan asam nukleat lebih tahan terhadap radikal bebas dari pada poly

unsaturated fatty acid (PUFA), sehingga kecil kemungkinan terjadi reaksi

 19

berantai yang cepat. Serangan radikal bebas terhadap protein sangat jarang kecuali

bila sangat ekstensif. Hal ini terjadi hanya jika radikal tersebut mampu

berakumulasi (jarang pada sel normal), atau bila kerusakannya terfokus pada

daerah tertentu dalam protein. Salah satu penyebab kerusakan terfokus adalah jika

protein berikatan dengan ion logam transisi (Droge, 2002).

3. Peroksidasi lemak

Membran sel kaya akan sumber poly unsaturated fatty acid, yang mudah

dirusak oleh bahan-bahan pengoksidasi. Proses tersebut dinamakan peroksidasi

lemak yang sangat merusak karena merupakan suatu proses berkelanjutan. Dari

ketiga biomolekul ini, lemak merupakan biomolekul yang sangat rentan terhadap

serangan radikal bebas karena memiliki ikatan π (rangkap) yang terdelokalisasi.

Proses reaksi radikal dan lemak berlangsung melalui beberapa tahapan, yaitu

secara inisiasi, propagasi, dan terminasi (Droge, 2002).

Salah satu hasil produk degradasi lemak adalah malondialdehid (MDA).

MDA secara luas banyak digunakan sebagai salah satu indikator peroksidasi lipid

yang dapat ditentukan dalam suatu pengukuran dengan menggunakan asam

tiobarbiturat (Winarsi, 2007).

Tidak selamanya radikal bebas berbahaya. Tubuh menghasilkan radikal

bebas yang bermanfaat bagi tubuh, yaitu untuk membunuh bakteri patogen yang

masuk ke dalam tubuh. Radikal bebas menjadi berbahaya jika jumlahnya melebihi

antioksidan yang berada di dalam tubuh, yang akan menyebabkan kerusakan

oksidatif. Tubuh dilengkapi dengan sel-sel inflamasi seperti sel granulosit,

monosit, dan makrofag, yang dapat memproduksi senyawa-senyawa yang bersifat

oksidan (Winarsi, 2007).

 20

Beberapa contoh peranan radikal bebas sebagai senyawa oksigen reaktif

dan senyawa nitrogen reaktif yang secara fisiologis berperan sebagai regulator

dalam metabolisme antara lain:

1. Anion superoksida berperan dalam kemotaksis bakteri.

2. Senyawa oksigen reaktif berperan dalam proses bakterisidal dan bakteriolisis

normal. Senyawa oksigen reaktif juga disintesis oleh sel fagosit melalui jalur

NADP oksidase, seperti radikal O2 dan H2O2 yang berperan sebagai pembunuh

bakteri (bakterisidal). Oleh sebab itu seseorang yang kekurangan NADP

oksidase akan mudah mengalami inflamasi berulang.

3. Radikal O2 memiliki sifat vasokonstriktor pada otot halus atau dalam

fibroblas.

4. Senyawa oksigen reaktif berperan dalam sintesis DNA karena aktivitas

ribonukleotida reduktase (yang mengubah ribosa menjadi deoksiribosa) sangat

bergantung pada senyawa oksigen reaktif.

5. Senyawa oksigen reaktif berperan dalam kapasitasi spermatozoid sehingga

keberadaannya sangat berfungsi dalam fertilisasi.

2.5 Antioksidan

Senyawa antioksidan adalah senyawa pemberi elektron (electron donors).

Secara biologis, pengertian antioksidan adalah senyawa yang mampu menangkal

atau meradam dampak negatif oksidan dalam tubuh. Antioksidan bekerja dengan

cara mendonorkan satu elektronnya kepada senyawa yang bersifat oksidan

sehingga aktivitas senyawa oksidan tersebut bisa dihambat (Winarsi, 2007).

Proses pelepasan elektron dari suatu senyawa disebut oksidasi, sedangkan

proses penangkapan elektron disebut reduksi. Senyawa yang dapat menarik atau
 21

menerima elektron disebut oksidan atau oksidator, sedangkan senyawa yang dapat

melepaskan atau memberikan elektron disebut reduktan atau reduktor.

Antioksidan merupakan senyawa pemberi elektron (electron donor) atau

reduktan. Senyawa ini memiliki berat molekul kecil, tetapi mampu

menginaktivasi berkembangnya reaksi oksidasi, dengan cara mencegah

terbentuknya radikal. Antioksidan juga merupakan senyawa yang dapat

menghambat reaksi oksidasi, dengan mengikat radikal bebas dan molekul yang

sangat reaktif, akibatnya kerusakan sel akan dihambat (Winarsi, 2007).

Status antioksidan merupakan parameter penting untuk memantau

kesehatan seseorang berdasarkan reaksi oksidasi dalam tubuh. Tubuh manusia

memiliki sistem antioksidan untuk menangkal reaktivitas radikal bebas, yang

secara kontinu dibentuk sendiri oleh tubuh. Bila jumlah senyawa oksidan reaktif

melebihi jumlah antioksidan dalam tubuh, kelebihannya akan menyerang

komponen lipid, protein, maupun DNA sehingga mengakibatkan kerusakan yang

disebut stres oksidatif. Namun demikian, reaktivitas radikal bebas dapat dihambat

dengan 3 cara berikut.

1. Mencegah atau menghambat pembentukan radikal bebas baru.

2. Menginaktivasi atau menangkap radikal dan memotong propagasi (pemutusan

rantai).

3. Memperbaiki (repair) kerusakan oleh radikal.

Tidak selamanya senyawa oksidan reaktif yang terdapat di dalam tubuh

dapat merugikan. Pada kondisi-kondisi tertentu keberadaannya sangat dibutuhkan,

misalnya, untuk membunuh bakteri yang masuk ke dalam tubuh. Oleh sebab itu,
 22

keberadaannya harus dikendalikan oleh sistem antioksidan dalam tubuh (Winarsi,

2007).

2.5.1 Sumber-sumber Antioksidan

Sumber-sumber antioksidan dapat berupa antioksidan sintetik maupun

antioksidan alami. Saat ini penggunaan antioksidan sintetik mulai dibatasi karena

dari hasil penelitian diketahui bahwa antioksidan sintetik seperti Butylated

Hydroxy Toluena (BHT) ternyata dapat meracuni binatang percobaan dan bersifat

karsinogenik. Oleh karena itu industri makanan dan obat-obatan beralih

mengembangkan antioksidan alami dan mencari sumber-sumber antioksidan

alami baru.

Ada banyak bahan pangan yang dapat menjadi sumber antioksidan alami,

misalnya rempah-rempah, teh, coklat, dedaunan, biji-biji serealia, sayur-sayuran,

enzim dan protein. Kebanyakan sumber antioksidan alami adalah tumbuhan dan

umumnya merupakan senyawa fenolik yang tersebar di seluruh bagian tumbuhan

yaitu di kayu, biji, daun, buah, akar, bunga, dan serbuk sari (Sarastani et al.,

2002).

A. Antioksidan alami

Antioksidan alami berasal dari tumbuhan dan telah diisolasi. Antioksidan

yang terdapat dalam tumbuhan mengandung vitamin C, vitamin E, poliferol,

karoten bioflavonoid, katekin, dan resveratrol.

B. Antioksidan Sintetik

Antioksidan sintetik diizinkan penggunaannya dalam makanan untuk

menjaga mutu dan dari perubahan sifat kimia makanan akibat proses oksidasi

yang terjadi terutama pada waktu penyimpanan. Contohnya adalah Butylated

 23

Hidroxyanisol (BHA), Butylated Hidroxytoluene (BHT), Tert-Butyl Quinon

(TBHQ), dan propil galat.

2.5.2 Mekanisme Kerja Antioksidan

Antioksidan dalam menghambat jalannya reaksi oksidasi dapat melalui

beberapa cara, yaitu mekanisme donor proton, radical scavenger, oxygen

quencher, inhibisi dengan enzim, dan sinergis (Gordon, 1990). Peranan

antioksidan khususnya antioksidan fenolik dalam peroksida lipid dapat

digambarkan sebagai berikut:

ROO• + AH → ROOH + A•

RO• + AH → ROH + A•

R• + AH → RH + A•

HO• +AH → H2O + A•

Pada reaksi tersebut antioksidan bertindak sebagai donor hidrogen, yang akan

berikatan dengan radikal bebas (ROO•, RO•, R•, dan HO•) dari lemak atau

minyak sehingga membentuk senyawa yang stabil. Pemberian atom hidrogen

merupakan tahap awal dari mekanisme antioksidan melalui radical scavenger

(pemerangkap radikal). Radikal baru yang terbentuk yaitu A• dapat langsung

bergabung dengan radikal-radikal lain membentuk senyawa yang tidak reaktif.

Beberapa contoh radical scavenger adalah vitamin C, β-karoten, vitamin E

(tokoferol), BHA, dan BHT (Winarsi, 2007).

Berdasarkan fungsinya, antioksidan dikelompokkan menjadi antioksidan

primer dan antioksidan sekunder.

1. Antioksidan primer
 24

Antioksidan primer yaitu antioksidan yang dapat bereaksi dengan radikal

lipid lalu mengubahnya ke bentuk yang lebih stabil. Antioksidan primer bekerja

untuk mencegah terbentuknya reaksi berantai radikal bebas dengan melepaskan

hidrogen sehingga tidak mampu lagi untuk bereaksi. Contohnya adalah enzim

Superoxide Dismutase (SOD) yang berfungsi sebagai pelindung sel dalam tubuh

serta mencegah proses peradangan karena radikal bebas. Antioksidan primer

seperti enzim SOD, enzim katalase, dan enzim glutation peroksidase. (Gordon,

1990).

2. Antioksidan sekunder

Antioksidan sekunder berfungsi menangkap senyawa radikal serta

mencegah terjadinya reaksi berantai. Antioksidan sekunder seperti vitamin C,

vitamin E, β-karoten, bilirubin, albumin, asam eritrobat (D-isomer asam askorbat)

dan garam sodiumnya, dilauril tiopropionat (Gordon, 1990).

2.5.3 Pengujian Antioksidan

Pengujian antioksidan dilakukan dengan menggunakan 1,1 Diphenyl-2-

picrylhidrazyl (DPPH). Mekanisme dari pengujian aktivitas antioksidan

menggunakan DPPH, yaitu terjadinya perubahan warna ungu dari senyawa DPPH

menjadi lebih pudar (kuning). Serapan senyawa DPPH yang telah berubah warna

akan terdeteksi pada panjang gelombang 517 nm (Hanani, 2005). Penangkapan

radikal bebas menyebabkan elektron menjadi berpasangan yang kemudian

menyebabkan penghilangan warna yang sebanding dengan jumlah yang diambil.

Hasil pengukuran pada panjang gelombang tersebut akan berakhir pada

perhitungan nilai IC50 melalui persamaan regresi. Nilai ini akan menunjukkan

kemampuan ekstrak sampel uji untuk menghambat radikal bebas sebanyak 50%.
 25

Nilai IC50 yang lebih kecil akan menjadi indikator bahwa suatu ekstrak uji

memiliki aktivitas antioksidan yang tinggi (Rohman dan Riyanto, 2005). Tingkat

kekuatan antioksidan menggunakan DPPH dinyatakan sangat kuat, kuat, sedang,

dan lemah berturut-turut apabila nilai IC50 < 50 mg/L, 50-100 mg/L, 101-150

mg/L, dan > 150 mg/L (Ionita, 2015).

2.6 Liquid Chromatography–Mass Spectrometry/Mass Spectrometry (LC-

MS/MS)

Liquid Chromatography–Mass Spectrometry/Mass Spectrometry (LC-

MS/MS) merupakan perpaduan antara kromatografi cair dan spektroskopi massa.

Analisis senyawa yang telah dipisahkan dengan kromatografi cair akan dideteksi

menggunakan detektor massa sehingga data yang diperoleh dari pemisahan

senyawa dengan LC-MS/MS berupa kromatogram, spektrum, dan berat molekul.

Prinsip kerjanya yaitu pemisahan komponen-komponen sampel dengan cara

melewati sampel pada suatu kolom, yang selanjutnya pemisahan masing-masing

komponen diukur dengan detektor. LC-MS/MS merupakan teknik kromatografi

cair yang lebih unggul dibandingkan teknik kromatografi gas dengan spektrometri

massa atau Gas Chromatography–Mass Spectrometry (GC-MS) dalam bio-

analisis. Penggunaan LC-MS/MS untuk penelitian bio-analisis dimulai pada akhir

1980-an. Kelebihan metode LC-MS/MS antara lain (Vogeser dan Seger, 2008):

a. Hasil analisis khas dan spesifik diperoleh dari penggunaan spektrometer

massa sebagai detektor.

b. Aplikasi luas dengan sistem yang praktis berbeda dengan GC-MS/MS yang

terbatas untuk molekul volatil, LC-MS/MS mampu mengukur analit yang

sangat polar dan tanpa perlu menggunakan teknik derivatisasi sampel.

 26

c. Data yang diperoleh dari LC-MS/MS kaya informasi data kuantitatif maupun

kualitatif karena seleksi ion yang cepat dengan berbagai parameter.

Data yang diperoleh dari hasil LC-MS/MS dibaca dengan menggunakan

software salah satunya adalah program MassLynx. MassLynx merupakan program

yang digunakan untuk membaca dan mengolah data spektrometer massa merk

Waters. Tahapan yang dilakukan untuk meramalkan rumus molekul senyawa yang

ingin diketahui yaitu (Waters Corporation, 2005):

1. Pilih menu File kemudian Open File lalu pilih data yang ingin dibaca

2. Ubah tampilan kromatogram dari TIC menjadi BPI pada menu Display klik

menu TIC lalu centang menu BPI

3. Pilih puncak yang akan diidentifikasi dengan klik dan tahan kursor kanan

kemudian akan muncul spektrum massa

4. Pilih Tool kemudian Elemental Composition dan masukkan nilai m/z dari

puncak yang diidentifikasi, kemudian akan muncul rumus molekul.

 BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Bahan dan Peralatan Penelitian

3.1.1 Bahan Penelitian

Bahan tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah batang

kecombrang. Bahan kimia yang digunakan dalam penelitian ini yaitu:

FeCl3.6H2O, etanol 80%, serbuk Mg, HCl pekat, HCl encer, pereaksi Wagner (I 2 +

KI), asam asetat anhidrat, asam sulfat pekat, asam galat, AlCl3, 2,2-difenil-1-

pikrilhidrazil (DPPH), Folin-Ciocalteu dan aquades. Semua bahan kimia yang

digunakan dibeli dari Merck dengan kualitas pro analisis, tanpa pemurnian

tambahan.

3.1.2 Peralatan Penelitian

Alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu: timbangan analitik Ohaus

Galaxy 400, spektrofotometer UV-Vis Thermo Tipe Genesys 10 UV Single

Beam, Liquid Chromatography–Mass Spectrometry (LC-MS/MS) ACQUITY

UPLC®H-Class System (Waters), oven (Memmert), blender, freeze dryer Virtis :

Benchtop 2K XL, pisau, kertas saring kasar, dan peralatan gelas laboratorium.

3.2 Tempat Penelitian

Determinasi tumbuhan dilakukan di Balai Konservasi Tumbuhan Kebun

Raya Eka Karya Bedugul, Kabupaten Tabanan, Provinsi Bali. Penelitian

selanjutnya dilakukan di UPT Laboratorium Forensik, Sains, dan Kriminalogi

Universitas Udayana, Bukit Jimbaran. Pengukuran menggunakan LC-MS/MS

dilakukan di Pusat Laboratorium Forensik Badan Reserse Kriminal Polri Bogor,

Indonesia.
27
 28

3.3 Tempat Pengambilan Sampel

Sampel batang kecombrang diperoleh dari desa Banjar Tegeha, Kecamatan

Banjar, Singaraja pada bulan Oktober 2019 dan ditunjukkan pada Gambar 3.1.

Lokasi pengambilan sampel batang kecombrang pada posisi geografis

8012’28.4”S 114058’04.1”E.

Skala 1:4500

Gambar 3.1 Lokasi Pengambilan Sampel Batang Kecombrang (Google

Maps, 2019)

3.4 Prosedur Penelitian

Alur penelitian secara umum dimulai dari sampling, penyiapan sampel,

esktraksi batang kecombarang dengan variasi waktu maserasi, uji fitokimia,

penentuan kadar fenol, analisis antioksidan, analisis ekstrak dengan LC-MS/MS.

Selanjutnya dilakukan pengolahan data untuk mendapatkan hasil. Bagan alur

penelitian secara umum ditunjukkan pada Lampiran 1.

3.4.1 Preparasi sampel dan penentuan kadar air

 29

Penyiapan bahan meliputi determinasi tanaman, pengumpulan bahan, dan

pembersihan. Batang kecombrang yang telah dikumpulkan kemudian dibersihkan

dengan cara dicuci dengan air kemudian dipotong dengan ukuran yang lebih kecil.

Batang kecombrang dikeringkan pada suhu ruangan dengan cara diangin-

anginkan selama kurang lebih 1 minggu.

Sampel batang kecombrang yang sudah kering layu ditimbang sebanyak

1,75g. Selanjutnya sampel dikeringkan di dalam oven pengering (80 oC) dan

setelah itu sampel ditimbang lagi massanya hingga diperoleh massa konstan untuk

menentukan kadar air pada sampel batang kecombrang.

3.4.2 Ekstraksi batang kecombrang

Sebanyak 2000 gram sampel dihaluskan dengan cara diblender sehingga

diperoleh serbuk halus lalu diayak dengan ayakan yang berukuran 100 mesh.

Serbuk simplisia sebanyak 100 gram dimaserasi dalam 500 mL pelarut etanol

masing-masing selama 6 jam, 12 jam, 18 jam, 24 jam. Hasil ekstraksi disaring

menggunakan kertas saring, pelarut diuapkan menggunakan freeze dryer dan

selanjutnya digunakan untuk analisis komponen dan pengujian antioksidan.

Ekstrak ditimbang dan dihitung rendamennya terhadap berat simplisia awal

menggunakan rumus:

Rendamen ekstrak =

Skema pembuatan ekstrak etanol batang kecombrang ditunjukkan pada Lampiran

2.

3.4.3 Uji fitokimia

 30

Uji fitokimia dilakukan untuk identifikasi awal keberadaan senyawa

metabolit sekunder pada ekstrak etanol batang kecombrang. Senyawa metabolit

sekunder yang diuji antara lain:

3.4.3.1 Uji polifenol

Ekstrak batang kecombrang dilarutkan dalam akuades lalu ditambahkan

dengan FeCl3 sebanyak beberapa tetes, perubahan warna diamati. Terbentuknya

warna hijau kehitaman atau biru tua pada larutan menunjukkan bahwa pada

larutan tersebut mengandung polifenol.

3.4.3.2 Uji flavonoid

Sebanyak 1-2 mL ekstrak batang kecombrang dimasukkan dalam tabung

reaksi, kemudian ditambahkan serbuk Mg dan beberapa tetes HCl pekat. Larutan

berwarna merah atau jingga yang terbentuk, menunjukkan adanya flavonoid.

3.4.3.3 Uji saponin

Ekstrak batang kecombrang dalam tabung reaksi ditambahkan dengan

akuades selanjutnya dikocok kuat selama 30 detik, larutan kemudian didiamkan

dalam posisi tegak selama beberapa menit. Buih yang konstan dan tidak hilang di

permukaan setelah ditetesi HCl encer menunjukkan adanya saponin.

3.4.3.4 Uji alkaloid

Ekstrak batang kecombrang dilarutkan dalam aquades lalu ditambahkan

beberapa tetes pereaksi Wagner. Endapan cokelat yang terbentuk menunjukkan

adanya alkaloid pada ekstrak batang kecombrang.

3.4.3.5 Uji steroid dan terpenoid

Ekstrak batang kecombrang dilarutkan dalam aquades lalu ditambahkan

dengan asam asetat anhidrat dan asam sulfat pekat. Terjadinya perubahan warna
 31

menjadi hijau atau biru menunjukkan adanya steroid, sedangkan untuk terpenoid

terjadi perubahan warna menjadi merah atau ungu.

3.4.4 Penentuan kadar fenol total

3.4.4.1 Pembuatan larutan standar

Sebanyak 0,01 gram asam galat diencerkan dalam labu ukur 100 mL

dengan aquades sehingga konsentrasi larutan standar menjadi 100 mg/L.

Selanjutnya dibuat larutan seri dalam labu ukur 5 mL dengan variasi konsentrasi

0, 10, 20, 40, 60, 80, dan 100 mg/L. Masing-masing dipipet 0,4 mL lalu

ditempatkan dalam tabung reaksi dan ditambahkan 0,4 mL reagen Folin-Ciocalteu

dan diinkubasi selama 6 menit. Selanjutnya ditambahkan 4,2 mL larutan sodium

karbonat 5%. Larutan dikocok menggunakan vorteks dan diinkubasi selama 90

menit kemudian dimasukkan dalam kuvet dan dibaca nilai absorbansinya pada

panjang gelombang 760 nm. Selanjutnya dibuat persamaan regresi linier (Almey,

et al., 2010).

3.4.4.2 Analisis sampel

Sebanyak 0,1 gram ekstrak kental batang kecombrang dilarutkan dengan 5

mL etanol 50% lalu dihomogenkan dan disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm

selama 15 menit. Larutan disaring lalu 2,5 mL, supernatan diambil dan diencerkan

sampai volume 5 mL. Sebanyak 0,4 mL filtrat dipipet dan ditambah 0,4 mL

reagen Folin-Ciocalteu lalu diinkubasi selama 6 menit. Larutan ditambahkan 4,2

mL larutan sodium karbonat 5%, dikocok menggunakan vorteks dan diinkubasi

selama 90 menit kemudian dimasukkan dalam kuvet dan dibaca nilai

absorbansinya pada panjang gelombang 760 nm. Selanjutnya dihitung nilai

konsentrasi sampel (x) berdasarkan pada nilai absorbansi (y) sampel dengan
 32

persamaan regresi linier yang diperoleh. Kadar fenol ekstrak dinyatakan dalam mg

asam galat/g ekstrak (mg GAE/g ekstrak) dengan rumus:

C = c (V/m)

Keterangan:

C = Fenol total (mg GAE/g)

c = kadar fenol total dari kurva standar (mg/L)

V = volume sampel (L)

m = bobot sampel (g)

3.4.5 Analisis kapasitas antioksidan

Sebanyak 25 mg ekstrak kasar ditimbang kemudian dimasukkan ke dalam

labu ukur 25 mL dan ditambah etanol hingga tanda batas, lalu dikocok hingga

homogen (larutan induk 1000 ppm). Larutan induk dipipet sebanyak 1,25; 2,5;

3,75; 5,0; dan 6,25 mL ke dalam labu ukur 25 mL untuk mendapatkan konsentrasi

larutan uji 50, 100, 150, 200, dan 250 ppm. Ke dalam masing-masing labu ukur

ditambahkan 5 mL larutan DPPH 0,5 mM lalu volumenya dicukupkan dengan

etanol sampai garis tanda. Larutan blanko dibuat dengan cara larutan DPPH 0,5

mM dipipet sebanyak 5 mL kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur 25 mL lalu

volumenya dicukupkan dengan etanol sampai garis tanda. Absorbansi DPPH

diukur dengan spektrometer sinar tampak pada panjang gelombang 515 nm, pada

waktu selang 5 menit mulai 0 menit sampai 30 menit. Pengukuran persentase

hambatan terhadap DPPH dihitung dengan menggunakan rumus:

Inhibisi (%) =
 33

Selanjutnya hasil perhitungan dimasukkan ke dalam persamaan regresi linear

y = bx + a, untuk mengetahui nilai IC50. Nilai IC50 diperoleh dari garis 50% daya

hambat dengan sumbu konsentrasi, dengan y = 50 dan x adalah konsentrasi

larutan uji yang mampu menghambat 50% larutan radikal bebas 1,1-difenil-2-

pikrilhidrazil.

3.4.6 Analisis ekstrak dengan LC-MS/MS

Ekstrak etanol batang kecombrang diidentifikasi dengan LC-MS/MS

menggunakan parameter kerja yang sesuai. Sampel dipreparasi dengan metode

Solid Phase Extraction (SPE) yaitu pemisahan fase padat secara kromatografi

menggunakan fase diam Hydrophilic-Lipophilic-Balanced (HLB) merk Waters

yang terbuat dari N-vinylpyrrolidone untuk hidrofilik dan divinylbenzene untuk

lipofilik. Fase gerak yang mengelusi senyawa polar digunakan larutan etanol dan

untuk mengelusi senyawa non-polar digunakan diklorometan. Sampel yang sudah

dilarutkan dengan etanol dimasukkan ke dalam kolom berupa syringe yang sudah

berisi fase diam lalu dielusi dengan etanol lalu ditampung. Selanjutnya dalam

kolom yang sama sampel dielusi dengan diklorometan lalu ditampung (Waters

Corporation, 2014). Hasil elusi dimasukkan ke dalam LC-MS/MS untuk

dilakukan analisis. Kromatogram yang diperoleh selanjutnya diidentifikasi

menggunakan program MassLynx V4.1 untuk mengetahui spektra massa.

 BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Ekstrak Etanol dan Kadar Air Batang Kecombrang

Hasil maserasi dari batang kecombrang menggunakan pelarut etanol

diperoleh rendamen untuk masing-masing waktu maserasi 6 jam, 12 jam, 18 jam,

dan 24 jam ditunjukkan pada Lampiran 3 yaitu sebesar 8,03; 10,27; 11,71; dan

14,04%. Makin lama waktu maserasi, makin tinggi persentase rendamen yang

diperoleh.

Kadar air rata-rata batang kecombrang yaitu sebesar (8,85±0,37)%.

Perhitungan kadar air dalam batang kecombrang ditunjukkan pada Lampiran 4.

4.2 Uji Fitokimia

Hasil uji fitokimia terhadap ekstrak kental batang kecombrang disajikan

pada Tabel 4.1 sebagai berikut.

Tabel 4.1 Hasil Uji Fitokimia Ekstrak Etanol Batang Kecombrang

No Uji Fitokimia Pereaksi Hasil Keterangan

1 Polifenol FeCl3 Perubahan warna dari Positif
hijau muda menjadi polifenol
hijau kehitaman
2 Flavonoid Serbuk Mg Perubahan warna dari Positif
dan HCl hijau muda menjadi flavonoid
jingga
3 Saponin HCl 1% Buih tidak hilang Positif
setelah ditetesi HCl saponin
4 Alkaloid Mayer Terbentuk endapan Positif
cokelats alkaloid
5 Steroid/Terpenoid Asam asetat Perubahan warna hijau -Positif
anhidrat dan muda menjadi hijau tua steroid
asam sulfat -Negatif
pekat Terpenoid

34
 35

a. Identifikasi Polifenol

Hasil identifikasi senyawa polifenol pada ekstrak etanol batang kecombrang

adalah positif yang ditandai dengan perubahan warna menjadi hijau kehitaman.

Perubahan warna terjadi karena gugus OH- pada senyawa polifenol bereaksi

dengan ion Fe3+ pada pereaksi FeCl3 membentuk senyawa kompleks seperti pada

Gambar 4.1.

OH

O-H
O-H
O-H

+ FeCl3 Fe
O-H H-O
H-O

Cl3

Fenol Kompleks [Fe(Fenol)6]Cl3

Gambar 4.1 Reaksi Antara Polifenol dengan FeCl3 (Tiwari et al., 2011)

b. Identifikasi Flavonoid

Reaksi dari ekstrak etanol batang kecombrang dan pereaksi Wilstater (HCl +

Mg), hasil positif ditunjukkan dengan terbentuknya warna jingga sampai merah.

Gelembung udara yang terbentuk merupakan gas H2. Logam Mg dan HCl pekat

akan mereduksi inti benzopiron pada senyawa flavonoid sehingga terbentuk

garam flavilium yang berwarna jingga atau merah. Reaksinya adalah sebagai

berikut.
 36

O O
HCl + Cl-
OH OH
+
O
Flavonol OH

ö +O
+
- +
Cl Cl-
OH
OH
OH
OH

Garam Flavilium
merah tua

Gambar 4.2 Reaksi Terbentuknya Garam Flavilium (Tiwari et al., 2011)

c. Identifikasi Saponin

Identifikasi saponin dengan metode Forth pada sampel ekstrak etanol batang

kecombrang menunjukkan hasil positif yaitu terbentuknya busa stabil selama 10

menit dan tidak hilang setelah ditetesi HCl 0,2 M. Busa yang terbentuk

diakibatkan karena adanya glikosida. Glikosida dapat terhidrolisis menjadi

aglikon dan glikon (gula) seperti pada reaksi berikut.

d. Identifikasi Alkaloid

Hasil positif alkaloid dengan menggunakan pereaksi Wagner adalah

terbentuknya endapan cokelat pada ekstrak etanol batang kecombrang. Ion K +

pada pereaksi Wagner akan berikatan dengan nitrogen pada senyawa flavonoid

dan membentuk kompleks garam kalium alkaloid.

 37

+ KI + I2 + I3-
coklat
N N
K+

Alkaloid Kalium-Alkaloid (endapan)

Gambar 4.3 Reaksi Pembentukan Kalium Alkaloid dengan Pereaksi Wagner
(Tiwari et al., 2011)

e. Identifikasi Steroid dan Terpenoid

Identifikasi kandungan senyawa steroid dan terpenoid menggunakan pereaksi

Liebermann-Burchard. Hasil positif senyawa steroid ditunjukkan dengan

perubahan warna menjadi hijau atau ungu, sedangkan uji positif terpenoid

ditunjukkan dengan perubahan warna menjadi merah atau violet. Hal tersebut

disebabkan terjadinya reaksi oksidasi pada golongan terpenoid/steroid melalui

pembentukan ikatan rangkap terkonjugasi (senyawa pentaenilik). Sampel yang

diuji hanya menunjukkan positif steroid karena perubahan warna yang

ditunjukkan adalah hijau muda menjadi hijau tua. Adapun reaksi Liebermann-

Burchard dapat dilihat pada Gambar 4.4.

HOAc/H2SO4

Carbonium Ion of 3,5-Diena

Ac2O
Cholesterol
(SO3)

+ SO2
+

HOO2S
 38

Cholestahexaena sulfonic acid λmax 410 nm Pentaenylic cation λmax 620 nm

Gambar 4.4 Reaksi Steroid/Terpenoid dengan Pereaksi Liebermann-

Burchard (Tiwari et al., 2011)

4.3 Penentuan Kadar Fenol Total

Penentuan kadar fenol total menggunakan metode Almey et al. (2010)

dengan asam galat sebagai standar baku. Fenolik total diukur dengan

menggunakan pereaksi Folin-Ciocalteau yang didasarkan pada reaksi oksidasi-

reduksi. Reagen Folin yang terdiri dari asam fosfomolibdat dan asam

fosfotungstat akan tereduksi oleh senyawa polifenol menjadi molibdenum-

tungsen. Reaksi ini membentuk kompleks warna biru. Semakin tinggi kadar

fenolik pada sampel, semakin banyak molekul kromagen (biru) yang terbentuk

sehingga semakin tinggi nilai absorbansi pada sampel tersebut (Illing et al., 2017).

Hasil pengukuran absorbansi larutan standar ditampilkan pada Lampiran 5.

Berdasarkan data pada Lampiran 5 diperoleh persamaan garis linier kurva standar

asam galat adalah y = 0,0092x + 0,0187 dengan nilai R 2 sebesar 0,9954.

Persamaan tersebut digunakan untuk menentukan kadar fenol (x) pada ekstrak

etanol batang kecombrang berdasarkan absorbansinya, yang dapat dilihat pada

Lampiran 6. Hasil perhitungan kadar fenol pada ekstrak etanol dapat dilihat pada

Tabel 4.2.

Tabel 4.2 Hasil Pengukuran Kadar Fenol Total Ekstrak Etanol Batang
Kecombrang dengan Variasi Waktu Maserasi
Fenol
Fenol Rata-rata
Waktu Absorbansi Total
Ulangan Total fenol total SD
maserasi sampel (mg
(mg/L) (mg GAE/g)
GAE/g)
6 jam 1 0,155 29,63 2,37 2,45 0,08
2 0,164 31,59 2,53
3 0,159 30,50 2,44
12 jam 1 0,232 46,37 3,71 3,86 0,13
 39

2 0,243 48,76 3,90

3 0,247 49,63 3,97
18 jam 1 0,413 85,72 6.86 6,94 0,04
2 0,422 87,67 7,01
3 0,419 87,02 6,96
24 jam 1 0,387 80,07 6,41 6,56 0,13
2 0,402 83,33 6,67
3 0,398 82,46 6,59

Pada Tabel 4.2 menunjukkan total fenol tertinggi terdapat pada perlakuan

waktu maserasi selama 18 jam yaitu 6,94 ± 0,0354mg GAE/g ekstrak dan fenol

total terendah terdapat pada perlakuan waktu maserasi 6 jam, sebesar 2,45 ± 0,08

mg GAE/g ekstrak. Waktu ekstraksi sangat berpengaruh terhadap kadar total fenol

ekstrak batang kecombrang. Hal ini sesuai dengan yang dilaporkan Devi dan

Arumughan (2007) bahwa waktu maserasi berpengaruh terhadap rendamen

ekstrak senyawa fitokimia termasuk senyawa fenolik. Semakin lama waktu

ekstraksi menyebabkan semakin banyak senyawa fenol yang larut dalam pelarut

sampai titik tertentu.

Menurut Kemit et al. (2015) semakin lama waktu maserasi maka waktu

kontak antara bahan dan pelarut semakin besar sehingga hasil ekstraksi akan terus

meningkat sampai pada titik jenuh dari pelarut tersebut. Waktu ekstraksi yang

singkat belum menunjukkan reaksi yang optimal terhadap senyawa fenolik

(Tananuwong dan Tewaruth, 2010). Penurunan kadar total fenol setelah waktu

maserasi 18 jam mengindikasikan adanya kemungkinan senyawa fenol mengalami

kerusakan atau terdegradasi seiring dengan lamanya waktu ekstraksi. Peningkatan

waktu ekstraksi menaikkan kemungkinan terjadinya dekomposisi atau oksidasi

senyawa fenolik karena kontak yang relatif lama dengan faktor lingkungan seperti

oksigen (Kristiani dan Halim, 2014).

 40

4.4 Aktivitas Antioksidan

Uji aktivitas antioksidan dilakukan untuk mengetahui kemampuan

senyawa aktif dalam ekstrak untuk menangkap radikal bebas. Aktivitas

antioksidan ekstrak batang kecombrang diukur menggunakan 1,1-diphenyl-2-

picrylhydrazil) (DPPH). DPPH merupakan senyawa radikal bebas yang stabil dan

tidak membentuk dimer akibat delokalisasi dari elektron bebas pada seluruh

molekul. Uji aktivitas antioksidan dengan metode ini didasarkan pada hilangnya

warna ungu akibat reduksi DPPH oleh senyawa antioksidan dalam sampel,

sehingga menghasilkan senyawa DPP Hidrazin (DPPHH) berwarna kuning.

Metode ini tidak memerlukan substrat sehingga lebih sederhana dengan waktu

analisis yang lebih cepat (Molyneux, 2004). Aktivitas antioksidan ekstrak batang

kecombrang dinyatakan dalam persentase inhibisi radikal bebas DPPH (Langseth,

1995). Persen inhibisi diperoleh dari perbandingan serapan antara absorban DPPH

dengan absorban sampel yang diukur dengan spektrofotometer UV-Vis (Andayani

et al., 2008). Perhitungan persen inhibisi dan IC50 dapat dilihat pada Lampiran 6.

Aktivitas antioksidan dinyatakan dalam IC50, yaitu konsentrasi zat

antioksidan yang menghasilkan persen penghambatan DPPH sebesar 50%. Nilai

IC50 diperoleh melalui persamaan linier antara persen inhibisi dengan konsentrasi

sampel. Semakin rendah nilai IC50 maka daya hambat ekstrak terhadap radikal

bebas semakin tinggi. Molyneux (2004) menggolongkan aktivitas antioksidan

berdasarkan nilai IC50 yang diperoleh, yaitu sangat kuat (IC50 < 50ppm), kuat (50

ppm < IC50 > 100ppm), sedang (100 ppm < IC50 > 150 ppm), lemah (150 ppm <

IC50 > 200 ppm), dan sangat lemah (IC50 > 200ppm). Berdasarkan nilai IC50 yang

diperoleh, ekstrak etanol batang kecombrang dengan waktu maserasi 18 jam

 41

memiliki aktivitas antioksidan tertinggi dengan nilai IC50 sebesar 170,96 mg/L dan

tergolong antioksidan lemah. Batang kecombrang yang dimaserasi dengan waktu

6 jam, 12 jam, dan 24 jam juga memiliki aktivitas antioksidan lemah yang

ditunjukkan dari nilai IC50 masing-masing sebesar 196,37 mg/L, 184,19 mg/L, dan

181,49 mg/L. Menurut Widyawati et al. (2010), perbedaan aktivitas antioksidan

dapat disebabkan oleh beberapa faktor, seperti perbedaan kemampuan dalam

mentransfer atom hidrogen ke radikal bebas, struktur kimia senyawa antioksidan,

dan pH campuran reaksi. Aktivitas antioksidan juga dipengaruhi oleh jumlah serta

posisi gugus hidroksil dan metil pada cincin. Molekul yang lebih banyak memiliki

gugus hidroksil akan semakin kuat dalam menangkap radikal bebas karena

kemampuannya dalam mendonorkan atom hidrogen semakin besar. Hal ini sesuai

dengan Andayani et.al (2008) yang menyatakan senyawa-senyawa yang memiliki

aktivitas antioksidan umumnya memiliki gugus hidroksil yang tersubstitusi pada

posisi orto dan para terhadap gugus –OH dan –OR.

Aktivitas antioksidan ekstrak batang kecombrang kemungkinan karena

adanya kandungan senyawa flavonoid, polifenol, alkaloid, saponin, dan steroid.

Hal tersebut didukung oleh hasil uji fitokimia yang menunjukkan ekstrak etanol

batang kecombrang positif mengandung senyawa flavonoid. Berdasarkan hasil

penelitian, aktivitas antioksidan dan kadar fenol menunjukkan korelasi positif,

semakin tinggi kadar fenol maka aktivitas antioksidan semakin tinggi. Hasil ini

sesuai dengan penelitian Faezah et al., (2013) yang menunjukkan adanya korelasi

positif antara fenol total dan aktivitas antioksidan.

4.4.1 Analisis Ekstrak dengan LC-MS/MS

 42

Sebelum dilakukan pengujian LC-MS/MS, dilakukan pemisahan dengan

Solid Phase Extraction (SPE) yang bertujuan untuk mengurangi pengotor pada

sampel. Analisis menggunakan LC-MS/MS dilakukan untuk mengetahui luas area

puncak, berat molekul serta kemungkinan struktur senyawa yang terdapat pada

ekstrak batang kecombrang. Hasil identifikasi menggunakan LC-MS/MS

menghasilkan beberapa puncak spektrum kromatografi dengan waktu retensi yang

berbeda. Kromatogram yang diperoleh ditunjukkan pada Gambar 4.5.

 43

Gambar 4.5 Hasil Kromatogram LC-MS/MS Ekstrak Etanol Batang Kecombrang

Hasil kromatogram muncul banyak puncak yang menunjukkan bahwa sampel

tersebut belum murni. Puncak-puncak pada kromatogram dianalisis menggunakan

program MassLynx V4.1 untuk melihat data spektrum massa dari masing-masing

puncak dan dapat ditentukan rumus molekul yang terionisasi positif.

Senyawa yang dicari pada penelitian ini adalah senyawa metabolit

sekunder yang berperan sebagai antioksidan. Hasil analisis kromatogram

menggunakan program MassLynx V4.1 berupa spektrum massa ditampilkan pada

Gambar 4.7 dan Gambar 4.9, dan kemudian dicocokkan menggunakan

chemspider.

Gambar 4.6 Spektrum LC-MS/MS Ekstrak Etanol Batang Kecombrang pada

Waktu Retensi 2,121 Menit
 44

Terlihat pada spektrum yaitu terdapat senyawa yang diduga memiliki

aktivitas antioksidan yaitu maklurin dengan rumus molekul C13H10O6 (Gambar

4.7).

HO OH OH

OH

OH O

Gambar 4.7 Struktur Maklurin

Efek antioksidan dari maklurin dipengaruhi oleh gugus orto-dihidroksil,

dan pada stabilitas relatif dari bentuk ortho-benzoquinone. Dugaan senyawa ini

bersifat antioksidan karena memiliki gugus hidroksil yang mempunyai

kemampuan untuk menyumbangkan hidrogen. Sifat antioksidan dari suatu

senyawa berasal dari kemampuan untuk mentransfer satu elektron ke senyawa

radikal bebas dan juga membentuk kompleks dengan logam.

Gambar 4.8 Spektrum LC-MS/MS Ekstrak Etanol Batang Kecombrang pada

Waktu Retensi 7,961 Menit
 45

Terlihat pada spektrum Gambar 4.8 yaitu terdapat senyawa yang diduga memiliki

aktivitas antioksidan yaitu cosmosiin dengan rumus molekul

C21H20O10. Struktur untuk senyawa cosmosiin ditunjukkan pada Gambar 4.9.

OH O

HO
O OH
O
O
HO
HO OH
OH

Gambar 4.9 Struktur Cosmosiin

Senyawa Cosmosiin merupakan turunan dari senyawa flavonoid yang memiliki

aktivitas antioksidan.
 BAB IV

SIMPULAN DAN SARAN

5.1 Simpulan

1 Waktu maserasi 6 jam, 12 jam, 18 jam, dan 24 jam. Rendamen tiap waktu

maserasi sebesar 8,03; 10,27; 11,71; dan 14,04%. Hasil pengukuran kadar

fenol total ekstrak etanol batang kecombrang tiap waktu maserasi yaitu

2,44; 3,87; 6,94; dan 6,56 mg GAE/g. Nilai IC50 tiap waktu maserasi

sebesar 196,37; 184,19; 170,96; dan 181,49 mg/L. Ekstrak etanol batang

kecombrang yang memiliki kadar fenol total dan aktivitas antioksidan

tertinggi yaitu pada waktu maserasi selama 18 jam.

2 Senyawa yang terkandung pada ekstrak batang kecombrang yang diduga

memiliki aktivitas antioksidan yaitu maklurin dan kosmosin.

5. 2 Saran

Saran yang dapat diberikan dari hasil penelitian ini adalah perlunya

pengkajian lebih mendalam terhadap mekanisme antioksidan ekstrak batang

kecombrang melalui uji in vivo.

46
 DAFTAR PUSTAKA

Agoes, G. 2007. Teknologi Bahan Alam. ITB Press. Bandung

Almey, A., Khan, A.J., Zahir, S., Suleiman, M., and Aisyah, R.K. 2010. Total
Phenolic Content and Primary Antioxidant Activity of Methanolic and
Ethanolic Extract of Aromatic Plant’s Leaves. International Food Research.
17:1077-1088

Andayani, R., Lisawati, Y., dan Maimunah. 2008. Penentuan Aktivitas, Kadar
Fenolat Total dan Likopen pada Buah Tomat (Solanum lycopersicum L).
Jurnal Sains dan Teknologi Farmasi. 13:1–9

Arief, S. 2006. Radikal Bebas. SMF Ilmu Kesehatan Anak. Fakultas Kesehatan
UNAIR. Surabaya

Azis, A.A. 2009. Penentuan Kadar Air dan Minyak Sawit Mentah (CPO) pada
Tangki Penyimpan di Pabrik Kepala Sawit PTPN. IV Kebun
Adolina. Karya Ilmia. Program Diploma-3 Kimia Industri Fakultas
MIPA Universitas Sumatera Utara. Medan

Boer, Y. 2000. Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Kulit Buah Kandis (Garcinia
parvifolia Miq). Jurnal Matematika dan IPA. 1(1):26-33

Bogoriani, N. W., Laksmiwati, A. A. I. M., Putra, A. A. B., Heltyanim, W. E.,

Lestari, K. D. P., Mahayani, P. A. E. 2019. Saponins Role of Bali
Andong Leaf As Antiobesity In Rats. International Journal of
Pharmaceutical Research. 11(2):383–389

Budiyanto, A. dan Yulianingsih. 2008. Pengaruh Suhu dan Waktu Ekstraksi

terhadap Karakter Pektin dari Ampas Jeruk Siam (Citrus nobilis L.).
Jurnal Penelitian Pascapanen Pertanian. 5(2):37-4

Chan, E.W.C, Lim, Y.Y. dan Omar, M. 2007. Antioxidant and Antibacterial
Activity of Leaves of Etlingera species (Zingiberaceae) in Peninsular
Malaysia, Food Chemistry. 104:1586–1593

Cuppett, S., Schrepf, M. and Hall C. 1954. Natural Antioxidant – Are They
Reality. AOCS Press. Illinois

Devi, R.R dan Arumughan, C. 2007. Phytochemical Characterization of Efatted

Rice Bran and Optimization of a Process for Their Extraction and
Enrichment. Bioresource Technology. 98:3037-3043

Dewick, P.M. 1999. Medical Natural Product, A Biosynthetic Approach. John

Wiley and Sons. New Jersey
47
 48

Dhianawaty, D. dan Ruslin. 2015. Kandungan Total Polifenol dan Aktivitas

Antioksidan dari Ekstrak Metanol Akar Imperata cylindrica (L) Beauv.
(Alang-alang). Jurnal Majalah Kedokteran Bandung. 47(1):60-64

Droge, W. 2002. Free Radicals in the Physiological Control of Cell Function.

Physiological Review. 82:47-95

Etika, S.B. dan Suryelita. 2014. Isolasi Steroid dari Daun Mengkudu (Morinda
citrifolia L.). Jurnal Eksakta. 1:60-65

Faezah, N., Aishah, S.H., dan Kalsom, U.Y. 2013. Comparative Evaluation of
Organic and Inorganic Fertilizers on Total Phenolic, Total Flavonoid,
Antioxidant Activity and Cyanogenic Glycosides in Cassava (Manihot
esculenta). African Journal of Biotechnology. 12(18):2414-2421

Fauzana, D. L. 2010. Perbandingan Metode Maserasi, Remaserasi, Perkolasi dan

Reperkolasi Terhadap Rendamen Ekstrak Temulawak (Curcuma
xanthorrhiza Roxb.). Skripsi. Fakultas Teknologi Pertanian IPB. Bogor

Gazali, M., Nufus, H., Nurjanah, Zuriat. 2019. Eksplorasi Senyawa Bioaktif
Ekstrak Daun Nipah (Nypa fruticans Wurmb) Asal Pesisir Aceh Barat
sebagai Antioksidan. Jurnal Penelitian Hasil Perikanan Indonesia.
22(1):155-163

Gordon, M. H. 1990. The Mechanism of Antioxidant Action in Vitro. B.J.F.

Hudson (ed). Food Oxidant. Elsevier Applied Science. Springer. Berlin

Habsah, M., Lajis, N.H., Sukari, M.A., Yap, Y.H., Kikuzaki, H., Nakatani, N. dan
Ali, A. M. 2005. Antitumour-Promoting and Cytotoxic Constituentss of
Etlingera elatior. Malaysian Journal of Medical Sciences. 12:6-12

Hanani, E. 2005. Identifikasi Senyawa Antioksidan dalam Sponscallispongia Sp.

dari Kepulauan Seribu. Majalah Ilmu Kefarmasian. 2(3):127-133

Harborne, J.B. 1987. Metode Fitokimia. Penentuan Cara Modern Menganalisis

Tumbuhan. ITB. Bandung.

Hidayat, S. S. dan Hutapea, J. R. 1991. Inventaris Tanaman Obat Indonesia.

Badan Penelitian dan Pengembangan Departemen Kesehatan Republik
Indonesia. Jakarta

Illing, I., Safitri,W., dan Erfiana. 2017. Uji Fitokimia Ekstrak Buah Dengen.
Jurnal Dinamika. 8(1):66-84

Ionita, P. 2005. Is DPPH Stable Free Radical a Good Scavenger for Oxygen
Active Species. Chemical Papers. 59(1):11-16
 49

Jaffar, F. M., Osman, C.P., Ismail, N. H. dan Awang K. 2007. Analysis of

essential oils of leaves, stems, flowers and rhizomes of Etlingera elatior
(JACK) R. M. SMITH. The Malaysian Journal of Analytical Sciences.
11:269-273

Kemit, N., Widarta, I W.R. dan Nocianitri K. A. 2016. Pengaruh jenis Pelarut dan
Waktu Maserasi terhadap Kandungan Senyawa Flavonoid dan Aktivitas
Antioksidan Ekstrak Daun Alpukat (Persea americana Mill). Jurnal Ilmu dan
Teknologi Pangan. 5:130-141

Kristiani, V. dan Halim, F.I. 2014. Pengaruh Konsentrasi Etanol dan Waktu
Maserasi Terhadap Perolehan Fenolik, Flavonoid dan Aktivitas
Antioksidan Ekstrak Rambut Jagung. Skripsi. Fakultas Teknik Universitas
Katolik Widya Mandala. Surabaya

Lakshmi, V., Mahdi, A.A., Agarwal, S.K., and Khanna, A. K. 2012. Steroidal
Saponin from Chlorophy tumnimonii (Grah) with Lipid-lowering and
Antioxidant Activity. Chronicles of Young Scientists. 3:227-32

Langseth L. 1995. Oxidants, Antioxidants and Disease Prevention. ILSI Europe.

Bruxelles

Lestario, L.N., Hastuti, P., Raharjo, S., Tranggono. 2001. Sifat Antiksodatif
Ekstrak Buah Duwet (Synzigium cumini), Journal of Agritech. 25(1):24-31

Molyneux P. 2004. The Use of the Stable Free Radical (DPPH) for Estimating
Antioxidant Activity. Journal of Science and Technology. 26:211-219

Mukhriani. 2014. Ekstraksi, Pemisahan Senyawa, dan Identifikasi Senyawa Aktif.

Jurnal Kesehatan. 7(12):361-367

Mulja, M., dan Suharman. 1995. Analisis Instrumental. Cetakan I. Airlangga

University Press. Surabaya

Naufalin, R. 2005. Kajian Sifat Antimikroba Ekstrak Bunga Kecombrang

(Nicolaia speciosa Horan) terhadap Berbagai Mikroba Patogen dan
Perusak Pangan. Disertasi. Sekolah Pasca Sarjana Institut Pertanian
Bogor. Bogor

Prakash, A., Rigelhof, F., Miller, E. 2001. Medallion Laboratories: Analytical

Progress. Antioxidant Activity. www.terranostrachocolate.com/files/
Comparative_and_General_Antioxidant_Information.pdf, diunduh pada
20 Juli 2019

Ramdja, A.F., Aulia, R.M.A. dan Mulya, P. 2009. Ekstraksi Kurkumin dari
Temulawak dengan Menggunakan Etanol. Jurnal Teknik Kimia. 16(3):52-
58
 50

Redha, A. 2010. Flavonoid: Struktur, Sifat Antioksidatif dan Peranannya dalam

Sistem Biologis. Jurnal Belian. 9(2):196-202

Rohman, A. dan Riyanto, S. 2005. Aktivitas Antioksidan Ekstrak Buah

Mengkudu (Morinda Citrifolia L,). Journal of Agritech. 25(3):131-136

Saifudin, A. 2014. Senyawa Metabolit Sekunder : Teori, Konsep, dan Teknik

Pemurnian. CV Budi Utama. Yogyakarta

Sampurno. 2000. Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuahan Obat.

Departemen Kesehatan. Jakarta

Sarastani, D., Soekarto, S.T., Muchtadi, T.R., Fardiaz, D. dan Apriyanto, A. 2002.
Aktivitas Antioksidan Ekstrak dan Fraksi Ekstrak Biji Atung. Jurnal
Teknologi dan Industri Pangan. 13:149-156

Shintawati, R., Hernawati, dan Indraswati, D. 2011. Kadar Lipid Darah Mencit
Betina Middle-Aged Galur Swiss Webster setelah Pemberian Jus Buah Pare
(Momordica charantia L.). Jurnal Majalah Kedokteran Bandung. 43(2):93-
97

Sies, H. 1997. Oxidative Stress: Oxidants and Antioxidants. Experimental

Physiology. 82:291–295

Silvany, R., Ginting, M., Ginting, A. 2016. Pengujian Antioksidan Minyak Atsiri,
Ekstrak Air dan Ekstrak Etanol dari Batang Kecombrang (Etlingera
elatior) dengan Metode DPPH. Chempublish Journal. 1(2):1-6

Soeatmaji, D. W. 1998. Peran Stress Oksidatif dalam Patogenesis Angiopati

Mikro dan Makro DM. Medica. 5(24):318-325

Sukandar, D., Radiastuti, N., Jayanegara I., dan Hudaya A. 2010. Karakterisasi
Senyawa Aktif Antibakteri Ekstrak Air Bunga Kecombrang (Etlingera
elatior) Sebagai Bahan Pangan Fungsional. Valensi. 2(1):333-339

Sunarni, T. 2005. Aktivitas Antioksidan Penangkap Radikal Bebas Beberapa

Kecambah dari Biji Tanaman Familia Papilinaceae. Jurnal Farmasi
Indonesia. 2:53-61

Susana, I., Ridhay, A., Bahri, S. 2018. Kajian Aktivitas Antioksidan Ektrak
Batang Kecombrang (Etlingera elatior) Berdasarkan Tingkat Kepolaran
Pelarut. Kovalen. 4(1):16-23

Tamat, S. R., Wikanta, T. dan Maulina, L. S. 2007. Aktivitas Antioksidan dan

Toksisitas Senyawa Bioaktif dari Ekstrak Rumput Laut Hijau Ura
retikulata Forsskal. Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia. 5:31-36
 51

Tampubolon, O.T., Suhatsyah, S. dan Sastrapradja, S. 1983. Penelitian

Pendahuluan Kimia Kecombrang (Nicolaia speciosa Horan). Risalah
Simposium Penelitian Tumbuhan Obat III. Fakultas Farmasi UGM.
Yogyakarta

Tananuwong, K. dan Tewaruth, W. 2010. Extraction and Application of

Antioxidants from Black Glutinous Rice. 43:476–481

Tiwari, P., Kumar, B., Kaur, M., Kaur G., and Kaur H. 2011. Phytochemical
Screening And Extraction: A Review, International Pharmaceutica
Sciencia. 1(1):98-106

Utami. 2009. Potensi Daun Alpukat (Persea americana Mill) sebagai Sumber
Antioksidan Alami. Jurnal Teknik Pertanian. 2(1):58-64

Voigt R. 1994. Buku Pelajaran Teknologi Farmasi. Alih Bahasa Dr. Soendani
Noerono, Edisi Kelima. Gadjah Mada University Press. Yogyakarta

Vogeser, M. and Seger, C. 2008. A Decade of HPLC-MS/MS in The Routine

Clinical Laboratory-Goals for Futher Development. Clinical Biochemistry
Review. 41:649-662

Waters Corporation. 2005. MassLynx 4.1: Getting Started Guide. Waters

Corporation. Washington D.C.

Widyawati, P.S., Wijaya, C.H., Harjosworo, P.S., Sajuthi, D. 2010. Pengaruh

Ekstraksi dan Fraksinasi Terhadap Kemampuan Menangkap Radikal Bebas
DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil) Ekstrak dan Fraksi Daun Beluntas
(Pluchea indica Less.). Seminar Rekayasa Kimia dan Proses. ISSN : 1411 -
4216

Winarsi, H. 2007. Antioksidan Alami dan Radikal Bebas. Kanisius. Yogyakarta

 LAMPIRAN

Lampiran 1. Bagan Alur Penelitian

Penyiapan sampel

Ekstraksi Batang Kecombrang

Dengan Variasi Waktu
Maserasi 6, 12, 18, dan 24 jam

Uji Fitokimia

Uji Polifenol
Uji Flavonoid
Uji Saponin
Uji Alkaloid
Uji Steroid & Terpenoid

Penentuan Kadar Fenol

Analisis Antioksidan

Analisis Ekstrak dengan LC-MS/MS

52
 53

Lampiran 2. Skema Ekstraksi Batang Kecombrang

Tanaman kecombrang Determinasi

 Diambil batangnya
 Dicuci dan diangin-anginkan pada suhu ruang
Batang kecombrang
 Dipotong kecil-kecil
 Dikeringkan dengan cara diangin-anginkan pada suhu ruang
 Ditentukan kadar air
Batang kecombrang kering

 Diblender dan diayak

100 gram serbuk batang

kecombrang kering
 Dimaserasi dengan etanol selama 6, 12, 18, dan 24 jam
 Disaring
Filtrat

 Dipekatkan dengan freeze dryer

Ekstrak pekat batang

kecombrang, rendamen

 Uji fitokimia, penentuan kadar fenol total, analisis antioksidan

dan analisis ekstrak dengan LC-MS/MS

Hasil uji fitokimia, kadar fenol

total, nilai IC50, senyawa yang
diduga memiliki aktivitas
antioksidan
 54

Lampiran 3. Perhitungan Rendamen Ekstrak

Rendamen ekstrak =

1. Waktu maserasi 6 jam

Rendamen ekstrak = x 100% = 8,03%

2. Waktu maserasi 12 jam

Rendamen ekstrak = x 100% = 10,27%

3. Waktu maserasi 18 jam

Rendamen ekstrak = = 11,71%

4. Waktu maserasi 24 jam

Rendamen ekstrak = = 14,04%

 55

Lampiran 4. Perhitungan Kadar Air

% Kadar Air =

% Kadar Air = = 8,43%

Keterangan :

W0 = berat cawan kosong (gram)

W1 = berat cawan + ekstrak sebelum dipanaskan (gram)

W2 = berat cawan + ekstrak setelah dipanaskan (gram)

Perhitungan standar deviasi:

8,43 -0,42 0,1764

9,14 0,29 0,0841
8,99 0,14 0,0196
2
= 8,85 = 0,2801

SD =

SD =
 56

SD =

SD =

SD = 0,3742

Dengan cara yang sama, diperoleh kadar air dalam sampel batang kecombrang pada

masing-masing pengulangan sebagai berikut:

Kadar Kadar air

W0 W1 W2
Ulangan air rata-rata SD
(gram) (gram) (gram)
(%) (%)
1 109,34 111,12 110,97 8,43
2 103,36 105,11 104,95 9,14 8,85 0,37
3 100,77 102,55 102,71 8,99
 57

Lampiran 5. Penentuan Persamaan Regresi Standar Asam Galat

Persamaan regresi y= bx + a; y = serapan larutan yang diukur

x = konsentrasi larutan yang diukur

b = slope

a = intersep

x Y x2 y2 x.y

0 0 0 0 0
10 0,111 100 0,012321 1,11
20 0,205 400 0,042025 4,1
40 0,402 1600 0,161604 16,08
60 0,579 3600 0,335241 34,74
80 0,787 6400 0,619369 62,96
100 0,899 10000 0,808201 89,9
Σx = 310 Σy = 2,983 Σx2 = 22100 Σy2 = 1,978761 Σxy = 208,89
 58

0,0187

Jadi, persamaan regresi linier kurva standar asam galat adalah

y = 0,0092x + 0,0187

R2= 0,9954
 59

Lampiran 6. Penentuan Kadar Fenol Total

Keterangan:
Bobot sampel: 0,005 g
Volume sampel: 0,0004 L
Faktor pengenceran: 2

Contoh perhitungan:

 Fenol total

Persamaan kurva standar asam galat: y = 0,0092x + 0,0187

Absorbansi rata-rata sampel = 0,0092x + 0,0187

0,159 = 0,0092 (fenolik total) + 0,0187
0,159 – 0,0187 = 0,0092 (fenolik total)
Fenol total = 15,25 mg/L x faktor pengenceran
= 15,25 mg/L x 2
= 30,50 mg/L
 Fenol total (mg GAE/g)
C = c (V/m)

Keterangan:

C = Fenol total (mg GAE/g)

c = kadar fenol total dari kurva standar (mg/L)

V = volume sampel (L)

m = bobot sampel (g)

Fenol total (mg GAE/g) = 30,50 mg/L x (0,0004 L / 0,005 g)

= 2,44 mg GAE/g
 60

Lampiran 6. Perhitungan persen inhibisi dan IC50

Data absorbansi sampel dan blanko menggunakan DPPH waktu maserasi 6 jam

Rata-rata
Absorbansi sampel Inhibisi (%) inhibisi SD
Konsentras
(%)
i (ppm)
Ulanga Ulanga Ulanga Ulanga Ulanga Ulanga
n1 n2 n3 n1 n2 n3
Blanko 0,608 0,613 0,617 - - - - -

50 0,582 0,588 0,591 4,28 4,08 4,21 4,19 0,1015

100 0,485 0,491 0,482 20,23 19,90 21,88 20,67 1,0608
150 0,377 0,381 0,387 37,99 37,85 37,28 37,71 0,3761
200 0,294 0,298 0,305 51,64 51,39 50,57 51,20 0,5597
250 0,204 0,219 0,211 66,45 64,27 65,80 65,51 1,1192

Contoh perhitungan:
a. Persentase inhibisi

% inhibisi =

Ulangan 1
% inhibisi 50 ppm
=

= 4,28%
Ulangan 2
% inhibisi 50 ppm
=

= 4,08%
Ulangan 3
% inhibisi 50 ppm
=

= 4,21%
61
 62

Rata-rata % inhibisi 50 ppm

=

= 4,19%

Data absorbansi sampel dan blanko menggunakan DPPH waktu maserasi 12 jam

Absorbansi sampel Inhibisi (%) Rata-rata

Konsentras
Ulanga Ulangan Ulanga Ulanga Ulanga Ulangan inhibisi SD
i (ppm)
n1 2 n3 n1 n2 3 (%)
Blanko 0,608 0,613 0,617 - - - - -

50 0,558 0,561 0,553 8,22 8,48 10,37 9,03 1,1735

100 0,449 0,456 0,452 26,15 25,61 26,74 26,17 0,5652
150 0,359 0,358 0,362 40,95 41,60 41,33 41,29 0,3265
200 0,273 0,279 0,283 55,10 54,49 54,13 54,57 0,4903
250 0,192 0,196 0,189 68,42 68,03 69,37 68,61 0,6892

Data absorbansi sampel dan blanko menggunakan DPPH waktu maserasi 18 jam

Absorbansi sampel Inhibisi (%) Rata-

Konsentras rata
Ulangan Ulanga Ulangan Ulanga Ulangan Ulangan SD
i (ppm) inhibisi
1 n2 3 n1 2 3
(%)
Blanko 0,608 0,613 0,617 - - - - -

50 0,525 0,532 0,539 13,65 13,21 12,64 13,17 0,506

4
100 0,419 0,426 0,431 31,09 30,51 30,15 30,58 0,474
3
150 0,342 0,338 0,332 43,75 44,86 46,19 44,93 1,221
7
200 0,251 0,262 0,249 58,72 57,26 59,64 58,54 1,200
1
250 0,174 0,166 0,171 71,38 72,92 72,29 72,20 0,774
2
 63

Data absorbansi sampel dan blanko menggunakan DPPH waktu maserasi 24 jam

Absorbansi sampel Inhibisi (%) Rata-

Konsentras rata
Ulanga Ulanga Ulanga Ulanga Ulanga Ulanga SD
i (ppm) inhibis
n1 n2 n3 n1 n2 n3
i (%)
Blanko 0,608 0,613 0,617 - - - - -

50 0,549 0,558 0,557 9,70 8,97 9,72 9,47 0,4274

100 0,438 0,448 0,442 27,96 26,92 28,36 27,75 0,7433
150 0,352 0,358 0,363 42,11 41,60 41,17 41,62 0,4706
200 0,264 0,275 0,276 56,58 55,14 55,27 55,66 0,7965
250 0,189 0,191 0,183 68,91 68,84 70,34 69,37 0,8465
 64

Waktu Konsentrasi Rata-rata Persamaan garis Nilai R2 IC50 (mg/L)

maserasi (mg/L) inhibisi (%)
50 4,19
100 20,67
6 jam 150 37,71 y = 0,306x - 10,09 0,997 196,37
200 51,20
250 65,51
50 9,03
100 26,17
12 jam 150 41,29 y = 0,295x - 4,335 0,997 184,19
200 54,57
250 68,61
50 13,17
100 30,58
18 jam 150 44,93 y = 0,292x + 0,079 0,997 170,96
200 58,54
250 72,20
50 9,47
100 27,75
24 jam 150 41,62 y = 0,295x - 3,540 0,996 181,49
200 55,66
250 69,37

Perhitungan IC50 waktu maserasi 6 jam

y = 0,306x - 10,09

% inhibisi = 0,306 (IC50) – 10,09

50 = 0,306 (IC50) – 10,09

IC50 = 196,37 mg/L

Untuk IC50 waktu maserasi 12, 18, dan 24 jam dihitung menggunakan perhitungan
yang sama seperti di atas.
 65

Lampiran 7. Spektrum LC-MS/MS Pada Waktu Retensi

 66

Lampiran 8. Surat Keterangan Determinasi Tanaman Kecombrang