TUGAS IMUNOLOGI

BEDAH JURNAL
Purifikasi Antibodi Dengan Melon Gel Chromatography

Disusun oleh :

Kelompok 6 Kelas S1-4C

1. Galuh khairunnisa ramadhani (1801093)
2. R. Pebliana syahara (1801109)
3. Rahul Oktarizal (1801111)
4. Rezy Syaputri (1801113)
5. Sarah gusci priskila (1801115)
6. Venny Fajriati (1801119)
7. Wulan sari firmes putri (1901126)

Dosen pembimbing:
Dr. Meiriza Djohari, M.Kes, Apt

PROGRAM STUDI S1 FARMASI

SEKOLAH TINGGI ILMU FARMASI RIAU
YAYASAN UNIV RIAU
PEKANBARU
2020
BEDAH JURNAL
Judul :Comparison and analysis of different methods for purification of
autoimmune antibody reactive with single stranded DNA: a pilot study
Nama Jurnal : MOJ Proteomics & Bioinformatics
Penulis :Anna Kats, Mirjana Pavlovic, Ran Chen, Michelle Cavallo,
JamesxHartmann
Tahun Terbit : 06 April 2017
Volume : 5 Issue 3
Halaman :94-107

1. Abstrak
Sebelumnya telah dilakukan pembandingkan metode pemurnian afinitas dua langkah,
yang sebelumnya dikembangkan di rumah, yang menggunakan oligo-deoxythymidine (dT)
yang terikat biotinylated streptavidin (SA) manik-manik magnetik M-280 dan protein G
Dynabeads®, dengan Melon ™ Gel, dua lainnya. langkah metode komersial, untuk isolasi
dan pemurnian autoantibodi anti-DNA manusia yang reaktif dengan DNA untai tunggal
(ssDNA), untuk menentukan metode mana yang lebih berlaku untuk analisis subkelas
antibodi dan, aktivitas fungsional yang berpotensi subkelas.

2. Pendahuluan
Ciri khas dari systemic lupus erythematosus (SLE) adalah produksi susunan antibodi
otomatis IgG dan IgM yang diarahkan pada satu atau lebih komponen DNA, paling umum
DNA untai ganda (ds) dan / atau DNA untai tunggal (ss). Antibodi antissDNA dan anti-
dsDNA dianggap terlibat dalam pengembangan penyakit berdasarkan fakta bahwa keduanya
telah dielusi dari ginjal model murine eksperimental dan pasien SLE. Tingkat antibodi anti-
DNA, baik ss dan ds, bervariasi dalam plasma pasien SLE yang berbeda, dengan peningkatan
kadar bersamaan dengan flare. 2-4 Akibatnya, tingkat antibodi anti-DNA dalam serum pasien
digunakan untuk memantau aktivitas dan perkembangan penyakit.
Antibodi DNA anti-untai ganda, dianggap sebagai ciri khas penyakit lupus, ditemukan
pada 70-90% pasien dengan SLE (terutama pada mereka yang menderita nefritis). Peran
penting dari antibodi anti-ssDNA didukung oleh studi dalam model tikus lupus nephritogenic
di mana hanya antibodi anti-ssDNA yang ditemukan serta oleh temuan Swanson et al., 1 &
Spatz et al., bahwa beberapa antibodi manusia anti-dsDNA tidak patogen pada semua.
 Tujuan akhir dari penelitian ini adalah untuk menentukan kondisi optimal untuk
analisis jenis dan aktivitas antissDNA manusia yang sangat murni (antibodi IgG) dan dapat
membantu pengembangan metode untuk memproduksi antibodi anti-DNA yang sangat murni
untuk digunakan dalam rekayasa vaksin berbasis sel dendritik.
Keberatan mendasar terhadap upaya sebelumnya dalam memurnikan antibodi anti-
DNA langsung dari plasma manusia adalah bahwa proses menghasilkan banyak pita pada
pemisahan elektroforesis tidak konsisten dengan bobot molekul IgG, tidak ada upaya untuk
memisahkan atau membedakan antara antibodi terhadap ssDNA dan yang melawan dsDNA,
pengembangan metode khusus untuk isolasi dan pemurnian masing-masing dari dua kategori
antibodi anti-DNA dengan tingkat kemurnian tertinggi diinginkan
Percobaan ini adalah percobaan pertama yang mengembangkan metode spesifik dan
sederhana untuk mengisolasi dan memurnikan antibodi anti-DNA manusia (IgG) dari serum
pasien SLE19, berdasarkan pada pengikatan spesifik antibodi anti-DNA dengan polimer
timin ( spesifisitas dasar antibodi antiDNA adalah dT >> dG >> dC≥dA) . data kristalografi
sinar-X mengkonfirmasi bahwa kelompok arginin bertanggung jawab untuk pengenalan
urutan dan antibodi anti-ssDNA mengikat DNA pada urutan berulang yang timin.
Dikombinasikan dengan data yang dihasilkan oleh Tanner pada tahun 2001,2004 dan
2007, mengkonfirmasi bahwa residu tirosin dan triptofan menciptakan kantong hidrofobik
dalam rantai samping antibodi Temuan ini memberikan dasar untuk isolasi antibodi anti-
ssDNA spesifik untuk untai tunggal nukleotida timin; menggunakan biotinylated oligo- (dT)
mer yang terikat dengan streptavidin (SA) yang dilapisi magnetik Dynabeads® dari
InvitrogenTM (Carlsbad, CA).
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk membandingkan metode berbasis manik-
manik kami untuk pemurnian afinitas antibodi anti-DNA dengan oligo- (dT) M-280 magnetic
Dynabeads® dan protein G Dynabeads® ”dengan Melon ™ Gel IgG Spin Purification untuk
anti-DNA (IgG) antibodi, dengan mengoptimalkan kondisi untuk isolasi dan pemurnian anti-
ssDNA (IgG). Ini diperlukan untuk mencapai hasil maksimum dan tingkat pemulihan
antibodi dengan tingkat kemurnian tertinggi.
Setelah dimurnikan, antibodi dianalisis melalui SDS-PAGE , fokus isoelektrik, chip
Lab-on Agilent 2100, dan ELISA untuk mengidentifikasi pola yang dapat berfungsi sebagai
pedoman untuk menentukan potensi patogenik mereka dalam lupus. Pemutaran aktivitas
hidrolitik mereka dilakukan menggunakan spektrofotometer sinar UV dan Analisis Lab-on-
chip dengan ss DNA sebagai substrat.
3. Metode
Pasien :
 Pasien B-CLL (B cell chronic lymphocytic)
 Pasien dengan penyakit ginjal
Bahan :
 Darah pasien  Buffer penyimpanan (20mM Tris-
 Donor normal HCL, 50% gliserol,dan 0,01%
 Antibody anti-DNA thimerosal)

 Serum  Buffer purffication gel melon

 Anti-DNA IgG  Ammonium sulfat jenuh (SAS)

 Ig G manusia  Es

 Pereaksi Ig G anti manusia  TrisEDTA buffer Saline PH 7,4

 Buffer binding & washing  Tween 20

 Natrium azida 0,01%  TBSE

 0,1 M NaPO4 sitrat  Urea 6M

 NaCL 2M  Ai

Alat :  Wastern blot

 Alat sentrifugasi  Kit ELISA
 Tabung microcentrifuge  Kit Zymed®
 Tabung reaksi  Ultrafiltrasi (Filter Amicon untuk
 Tabung polikarbonat oligo- (dT)
 Batang pengaduk
 Pengaduk magnet
 Incubator
 Handuk kertas
 Palet
 Lemari pendingin
 Magnet dynal ®
 Magnetic dynabeads®
 Kit Pemurniaan Spin Gel
ImmunoPure® Melon TM
Cara Kerja
1) Perlakuan awal sampel darah
a. Seluruh darah diambil secara intravena, sentrifugasi 300x selama 10 menit, untuk
mengendapkan fraksi mononuklear darah tepi dari plasma.
b. Cairan supernatan yang mengandung plasma dipanen dan disentrifugasi pada 600xg
selama 15 menit untuk selanjutnya mengendapkan dan menghilangkan trombosit
darah.
c. Serum disimpan beku pada -20 ° C untuk pemurnian antibodi

2) Metode isolasi dan pemurnian

1. Pemurnian afinitas antibodi anti-DNA dengan oligo- (dT) M-280 magnetic
dynabeads® dan protein G dynabeads®: Desain dua langkah untuk isolasi
dan pemurnian antibodi anti-DNA

I. Persiapan Manik Magnetik:

 a. Biotinylated oligo- (dT) 20mers digabungkan dengan Dynabeads®
berlapis magnetik M-280 SA (InvitrogenTM, Carlsbad, CA) Rasio antara
manik-manik dan oligo (dT) adalah 1mg per 1000pmol.
b. larutan stok mengandung 1,7x108perml M-280 streptavidincoated
magnetic Dynabeads®, 2,5 miligram dicuci dua kali dengan buffer
Binding & Washing (B & W
c. Setelah pencucian cairan supernatan dihilangkan dan manik-manik
ditangguhkan kembali dalam 500 μl B & W buffer
d. Suspensi campuran ini diinkubasi selama 15 menit pada suhu kamar.
e. Setelah inkubasi, tabung yang mengandung suspensi ditempatkan pada
magnet Dynal® (InvitrogenTM, Carlsbad, CA) selama 1 menit. Mab 280
Magnetic Dynabeads® oligo- (dT) kemudian dicuci dua kali dengan buffer
B&W.
f. Setelah pengangkatan supernatan, manik-manik terikat oligo (dT)
disimpan pada suhu 4 ° C dalam 1ml buffer penyimpanan yang terdiri dari
PBS dan 0,01% natrium azida pada konsentrasi manik akhir 1,7x108
perml. Jika lebih banyak manik-manik diperlukan, alikuot dikumpulkan.
II. Perhitungan oligo- (dT) ditambah M-280 magnetic Dynabeads® dan protein G
efisiensi pemulihan Dynabeads® (model Matematika):
a. Berat molekul satu antibodi sama dengan 156 kilodalton dan 1dalton sama
dengan 1,657x1024g. Karena 1 oligo- (dT) bead memiliki sekitar 1,8x106
oligo- (dT) pada permukaannya, ia dapat mengikat antibodi 1,8x106. Jadi,
1 manik mengikat 1,8x106x2,58x10-19g yang sama dengan 4,65x10-13g
antibodi.
b. Menurut protokol Dynal® untuk protein G, tingkat pemulihan 100μl
manik-manik adalah sekitar 40%. Untuk memulihkan IgG maksimum dari
individu normal, dan sampel lupus dengan menambahkan 250 μl protein
G Dynabeads® ke setiap sampel.
c. Secara teoritis, kita membutuhkan manik-manik 1,43x108, dan 1,05x109,
oligo (dT) dan 250μl protein G manik-manik masing-masing untuk
mengeluarkan antibodi anti-DNA total dari 1ml individu normal, dan
plasma pasien lupus.
III. Pemurnian afinitas antibodi anti-DNA menggunakan oligo- (dT) M-280 magnetic
Dynabeads® dan protein G Dynabeads®:
 a. Prosedur pemurnian selanjutnya yang digunakan untuk memurnikan
antibodi anti-DNA dari plasma heparinized dilakukan pada suhu 4 ° C.
b. Plasma yang diklarifikasi diinkubasi dengan oligo- (dT) M-280 magnetic
Dynabeads® Setelah inkubasi, kontaminan dihapus dengan mencuci
kompleks manik-antibodi sepuluh kali dalam buffer B & W menggunakan
perangkat pemisah magnetik (InvitrogenTM, Carlsbad, CA).
c. Pada tahap ini kontaminan seperti DNAse, nuklease lain dan protein
pengikat DNA mungkin telah dielusi bersama dengan antibodi anti-DNA.
d. Oleh karena itu, protein G Dynabeads® digunakan pada langkah kedua
untuk secara khusus memisahkan keempat isotipe IgG dari antibodi anti-
DNA dari kontaminan lain.
e. Antibodi murni dielusi dari protein G Dynabeads® dengan 0,1M NaPO4–
Sitrat, pH = 5 dan disimpan segera dalam buffer penyimpanan yang
mengandung 20mM Tris-HCl, 50% gliserol dan 0,01% thimerosal, pH 7,0
pada -20 ° C

2. Pemurnian afinitas antibodi anti-DNA menggunakan Melon ™ Gel IgG

Purification System

Prosedur
a. Kit Pemurnian Spin Gel ImmunoPure® Melon ™ Gel diperoleh dari Thermo
Fisher Scientific / Pierce Chemical (Rockford, IL).
b. 100μl gel Melon ™ memiliki kapasitas untuk memurnikan hingga 100μl serum.
 c. Dukungan Pemurnian dan Bufer Gel Pemurnian IgG Melon ™ disetimbangkan ke
suhu ruang dan 500μl bubur gel disalurkan ke dalam Kolom Spin-mini Handee ™
yang ditempatkan dalam tabung microcentrifuge.
d. Rakitan kolom yang tidak tertutup disentrifugasi pada 6.000 xg, aliran-dibuang
dibuang dan kolom dicuci dua kali dengan 300μl Purification Buffer.
e. Sampel serum 10-100μl yang diencerkan 1:10 kemudian ditambahkan ke kolom,
diinkubasi selama 5 menit, dan disentrifugasi pada 6.000 xg selama 1 menit;
f. antibodi murni dikumpulkan di bagian bawah tabung pengumpul.
g. Antibodi yang dimurnikan disimpan dalam buffer Purifikasi gel Melon untuk
analisis lebih lanjut atau pemurnian tambahan oleh selulosa DNA.
h. Prinsip-prinsip kedua metode dibandingkan dengan metode sebelumnya
divisualisasikan dalam Gambar 1a-1c (Beads, Melon-Gel dan metode isolasi Old-
dsDNA).

Western blot untuk konfirmasi subkelas antibodi

Western blot digunakan untuk menentukan identitas protein yang dipisahkan
secara elektroforetik dan untuk mengukur jumlah relatif protein yang ada dalam sampel
yang berbeda, berdasarkan densitometri. Larutan antibodi anti-manusia tikus diinkubasi
dengan gel selama 1 jam. Setelah mencuci membran dalam buffer untuk
menghilangkan tikus anti-manusia yang tidak terikat, ditambahkan antibodi anti-tikus
sekunder. Antibodi sekunder terkonjugasi dengan enzim (horseradish peroxidase).
Lokasi konjugasi antibodi terikat membran diungkapkan oleh perkembangan warna
pada inkubasi dengan substrat tidak berwarna

Kit ELISA subclass profil ELISA manusia

 Konsentrasi subclass IgG1, IgG2, IgG3, dan IgG4 dalam persiapan antibodi anti-
DNA murni ditentukan dengan menggunakan kit ELISA profil subclass manusia
komersial ELG. Kit Zymed® (InvitrogenTM, Carlsbad, CA) adalah jenis ELISA
menggunakan sistem deteksi peroksidase lobak.
 Pelat mikrotiter yang dilapisi menangkap reagen monoklonal yang spesifik untuk
berbagai subkelas IgG manusia. Antibodi monoklonal pada gilirannya menangkap
subkelas IgG manusia, yang spesifik, keluar dari sampel serum.
 IgG manusia yang ditangkap kemudian diberi label dengan pereaksi IgG anti-
manusia lobak-peroksidase. Sinyal deteksi kemudian dihasilkan secara proporsional
dengan jumlah antibodi subkelas manusia.

3. Pemurnian afinitas antibodi anti-DNA menggunakan selulosa DNA untai

tunggal / untai ganda

Cara kerja
1. Pilih serum dari pasien diketahui memiliki titer anti-DNA IgG lebih besar dari 200
unit/ ml.
2. Pasien dengan penyakit ginjal memiliki titer yang tinggi ini. Idealnya titer serum
sebelum dan selama pemurnian menggunakan ELISA seperti yang dijelaskan.
Prosedur untuk presipitasi antibodi menggunakan jenuh amonium sulfat (SAS)
3. Tempatkan 1ml sampel serum (yang sebelumnya diklarifikasi oleh centrifuge pada
10.000rpm) dalam tabung reaksi polikarbonat yang dapat mengandung volume
sampel dua kali lipat.
4. Tambahkan batang pengaduk ke tabung, tempat gelas kimia di atas es dan di atas
pengaduk magnet.
5. Saat diaduk, perlahan tambahkan tetes demi tetes volume amonium sulfat jenuh
yang pada suhu kamar sama dengan 33-40% v / v konsentrasi akhir.
6. Jadi untuk 1.0ml serum tambahkan 660 μl SAS.
7. Perhatikan bahwa persentase akhir 50% dalam beberapa protokol adalah untuk
antibodi tikus, protokol manusia sebenarnya mengatakan 33% final.
8. Letakkan di atas es selama satu jam dengan pencampuran dan kemudian endapan
centrifuge dalam dingin, 15 menit pada 3.000 rpm.
9. Buang cairan supernatan yang mengandung albumin.
10. Tarik cairan ke dalam tabung baru, berhati-hatilah untuk tidak menghilangkan lipid
di sisi atas tabung..Tambahkan 200μl SAS dan letakkan di tempat dingin selama satu
jam.
11. Centrifuge, tuang cairan supernatan dan tiriskan cairan yang tersisa dengan
menyentuh tabung ke handuk kertas.
12. Larutkan palet dalam 9.0ml pada DNA cellulose (Sigma-Aldrich) TBSE yang
disiapkan di bawah ini.
Pemurnian antibodi anti-DNA menggunakan ss / ds DNA cellulose.
a. Protokol untuk 1.0ml serum dan 1.0gram selulosa DNA.
b. Hidrasi ulang selulosa DNA 1,0 gram (atau kurang seperti yang ditunjukkan) dalam
TrisEDTA buffer saline pH = 7,4 dengan 0,05% berat Tween 20, catat banyak
bahan yang digunakan.
c. Setelah pengadukan gentile dengan batang pengaduk untuk memecah klem menjadi
bubur halus dalam tabung polikarbonat 50ml selama 1 jam, sentrifugasi pada
500rpm untuk memasukkan matriks.
d. Menangguhkan kembali 1,0 gram bahan bubur dalam 9,0ml TBSE dengan 0,05%
Tween 20.
e. Menangguhkan kembali palet yang dikeringkan dari fraksi gamma globulin dengan
menggunakan metode amonium sulfat di atas dengan 1.0gram bubur selulosa DNA
dari langkah pertama terhidrasi pada TBSE.
f. Campur semalam pada suhu kamar, sentrifus untuk pelet matriks dan mengurangi
protein yang tidak diserap.
g. Tambahkan 9.0ml TBSE ke bubur dan ulangi sentrifugasi. Tunda kembali bubur
dalam TBSE 9,0ml dan tuangkan campuran ke dalam kolom kecil.
h. Cuci kolom pada selulosa DNA dengan TBSE (5-10ml) untuk menghilangkan
kotoran yang tersisa.
i. Elusi antibodi, menangkap kemudian dalam tabung reaksi polikarbonat kecil
sebagai fraksi 0,5ml dengan urea 6M dan 2M NaCl.
 j. Tempatkan 10 μl masing-masing fraksi ke dalam 50 μl reagen Bradford Coomassie
untuk menentukan fraksi mana yang memiliki antibodi.
k. Segera kumpulkan fraksi dan encerkan garam hingga 0,9% dengan pH = 7,4 Hepar
0,01 buffer dengan air, kemudian lepaskan urea dan konsentrasikan antibodi
menggunakan perangkat ultrafiltrasi (filter Amicon untuk oligo- (dT) yang
dijelaskan di atas).

4. Hasil
Metode selulosa anti-ssDNA tidak membuahkan hasil sehingga penggunaannya dalam
penelitian dihentikan. Hasil kami menunjukkan antibodi dengan kemurnian sangat tinggi
yang diperoleh dengan metode manik magnetik terdeteksi oleh pewarnaan perak pada tingkat
sensitivitas nanogramGel Melon memurnikan semua IgG, juga, tetapi pada tingkat kemurnian
yang jauh lebih rendah, seperti yang ditentukan oleh pewarnaan SDS-PAGE perak dan
metode Agilent 2100 Lab-on-chip
Tingkat pemulihan, meskipun awalnya rendah, yaitu 20-40% dapat ditingkatkan
dengan menambahkan lebih banyak manik-manik dan dimodifikasi dengan pH buffer elusi
yang disesuaikan
Perbandingan awal (SDS-PAGE) dari antibodi anti-DNA yang dimurnikan dari donor
normal dan pasien leukemia limfositik B-sel kronis (BCLL) menggunakan metode pemurnian
afinitas dua langkah menggunakan manik-manik magnetik, mengungkapkan tidak ada
perbedaan nyata dalam berat molekul dan jumlahnya.
Antibodi anti-DNA yang dimurnikan dari serum pasien dengan systemic lupus
erythematosus (SLE) menyatakan pola elektroforesis yang berbeda dari kontrol normal dan
bervariasi antara pasien lupus individu dari satu-band hingga empat-band. Band-band banyak
menunjukkan bahwa beberapa protein selain IgG bergabung bersama dengan fraksi antibodi,
selama pemurnian Melon Gel.Namun, metode ini mengungkapkan "pola tersembunyi" yang
sebelumnya tidak terdeteksi oleh elektroforesis SDSPAGE karena keterbatasan konsentrasi
yang diperlukan untuk visualisasi dengan pewarnaan perak.
Analisis Western blot menegaskan bahwa antibodi yang dimurnikan oleh manik-
manik magnetik dan pemurnian spin gel melon, memang termasuk dalam isotipe IgG
(Gambar 4). Perbedaan yang mencolok sekali lagi adalah kemurnian; perbandingan kedua
metode tersebut mengungkapkan dan menegaskan efisiensi pemurnian yang unggul dari
metode manik-manik magnetik dua langkah.
 (Gambar 4)
Profil subclass IgG manusia ELISA mendeteksi keberadaan keempat subclass IgG
di kedua manik-manik dan sampel murni Melon -gel Nilai-nilai yang dinyatakan dalam ug /
ml jauh lebih tinggi dalam sampel murni Melon -gel (lebih dari 1600 untuk IgG1 versus 46
dalam sampel manik), dengan partisipasi yang sama dari Igg1, IgG2 dan IgG3 dan perbedaan
IgG4 yang jauh lebih tinggi pada kelompok yang dimurnikan MelonGel . Karena ini adalah
sampel yang sama, dan dua metode yang berbeda, kami percaya bahwa nilai yang lebih tinggi
dalam IgG4 terisolasi Melon-gel adalah karena masalah teknis dengan pipet yang telah
menciptakan peningkatan yang salah. Data ini dibandingkan dengan nilai referensi untuk
subkelas antibodi.
 Isoelektrik mengungkapkan sifat poliklonal dari antibodi murni lupus manusia (pola
yang dioleskan, pI ~ 9) dibandingkan dengan antibodi monoklonal tikus (tiga pita jelas
berbeda pI ~ 7) (Gambar 10a & 10b). Data menunjukkan bahwa antibodi yang dimurnikan
dari pasien lupus adalah poliklonal dan bahwa B-CLL dan antibodi donor normal adalah
monoklonal, dengan demikian memperhitungkan pola pita yang berbeda. Ini juga
menunjukkan bahwa sel-B pada pasien B-CLL dan pada orang normal lebih dekat dalam
evolusi daripada sel B-lupus

Data Agilent-Lab-on-chip ) mengkonfirmasi data hidrolitik awal yang diperoleh oleh

spektrofotometri UV. Kita dapat melihat dari Gambar 12a bahwa reaksi DNAse1 terjadi
sangat cepat (sekitar 30 menit diperlukan untuk mendapatkan nukleotida kecil (20-50bp)
Dan untuk mendapatkan nukleotida kecil dengan anti body anti SS DNA dari substrat yang
sama memerlukan waktu 12 jam pada suhu 37°c ( gambar 12a)
 ( gambar 12a)
Kami tidak membandingkan sampel yang diisolasi Melon-gel dan sampel
yang terisolasi dari magneticbeads karena yang diperoleh dari pemurnian Melon-gel
tidak memiliki kemurnian yang cukup. Hasil kami menunjukkan bahwa manik-manik
magnetik memurnikan antibodi anti-ssDNA mungkin memiliki aktivitas hidrolitik
terhadap ssDNA. Tampaknya kegiatan ini dipertahankan dalam molekul IgG antibodi
anti-ssDNA selama dan setelah pemurnian.

5. Pembahasan
Metode isolasi dan pemurnian antibodi anti-DNA diterapkan dan diciptakan untuk
mendeteksi karakteristik struktural dan fungsional antibodi anti-DNA. Metode pemurnian
afinitas dua langkah dirancang untuk menargetkan antibodi IgG anti-ssDNA. Namun, untuk
memurnikan antibodi anti-ssDNA menggunakan oligomer lain (dC, dG, dan dA) yang terikat
dengan streptavidin (SA) yang dilapisi Dynabeads® tidak berhasil.
Melon-gel jauh lebih efisien dalam memurnikan antibodi anti-DNA ss-DNA
daripada metode manik-magnetik. Isolasi Melon Gel dari antibodi anti-dsDNA juga
dilakukan di laboratorium dan juga menunjukkan pita tambahan tidak ada setelah pemurnian
manik dua langkah . Seperti disebutkan sebelumnya, selulosa ssDNA tidak berfungsi dan
tidak dianalisis lebih lanjut.
Metode manik magnetik dua langkah asli yang dirancang oleh lab peneliti
memberikan hasil yang masuk akal, murah, cepat (4,5 jam) dan sangat spesifik (mengekstrak
hanya ssDNA autoantibodi yang divisualisasikan dengan pewarnaan perak berskala nano
yang sensitif). Keunggulan ini menjadikannya metode yang sangat berguna untuk isolasi
autoantibodi anti-ssDNA murni
Deteksi antibodi poliklonal dalam lupus sera dibandingkan dengan antibodi
monoklonal dalam kasus B-CLL dan individu yang secara klinis normal, menunjukkan
bahwa hasil yang lebih rendah bukan karena kemungkinan perbedaan ikatan afinitas pada
antibodi poliklonal. tetapi lebih jauh didukung oleh fakta bahwa, konsentrasi antibodi
tertinggi yang dimurnikan menggunakan metode dua langkah terlihat dalam sampel serum
lupus. Hasil penelitian tidak dapat menentukan tingkat pemulihan untuk metode Melon Gel
karena tingkat pengotor dalam produk akhir.
Western Blot dan reaksi dimediasi antibodi enzimatik memberikan konfirmasi
visual tentang keberadaan molekul IgG yang sangat murni dalam sampel yang diperoleh
melalui prosedur pemurnian manik magnetik, dibandingkan dengan melon-gel. Perbedaan
yang kuat dalam pola elektroforesis (jumlah band dan MW) dari antibodi anti-DNA yang
diisolasi dari normal, pasien CLL dan SLE mungkin mencerminkan mekanisme berbeda yang
terlibat dalam modulasi produksi autoantibodi.
Pola tersembunyi diidentifikasi oleh metode Lab on Chip mengkonfirmasi hasil
elektroforesis. Gen imunoglobulin yang mengkode antibodi anti-DNA pada pasien lupus
mungkin mengalami mutasi Oleh karena itu, mutasi somatik adalah salah satu mekanisme
yang mungkin untuk penjelasan pola yang berbeda diamati dalam serum pasien dengan SLE.
Karena antibodi ini memiliki MW yang lebih tinggi (dari 165,3-174KDa), seperti yang
dikonfirmasi oleh Lab-on-chip, dua mekanisme epigenetik tambahan, glikosilasi atau
perpanjangan rantai, juga dapat diusulkan untuk berkontribusi pada "polaisasi" tersebut.
Berbagai tingkat glikosilasi antibodi, telah dijelaskan oleh Ravetchet al sejak 1995
dan kelompok lainnya ditentukan pada individu autoimun menunjukkan bahwa glikosilasi
IgGs dalam rheumatoid arthritis (RA). Antibodi IgG adalah penginduksi yang kuat dari
respons proinflamasi. Selama penyakit autoimun seperti RA dan SLE, antibodi auto IgG
bertanggung jawab atas peradangan kronis dan penghancuran jaringan sehat dengan
menghubungkan reseptor Fc pada sel efektor imun bawaan.
bahwa perubahan dalam glikosilasi yang terkait dengan RA dapat
menciptakan mode baru untuk interaksi IgG dengan komplemen melalui pengikatan
ke protein kolagen mannose-binding lectin kolagen (MBP). presentasi dari glycoform
IgG-G0 untuk MBP menghasilkan aktivasi komplemen. Hal ini menunjukkan bahwa
kontribusi terhadap peradangan kronis pada membran sinovial dapat timbul dari
lokalisasi glikoform IgG-G0 pada sendi yang terkena dan akibat dari aktivasi
komplemen yang dihasilkan.
mekanisme patogenik yang terlibat dalam SLE meliputi induksi lesi awal melalui
pengendapan kompleks imun yang beredar di jaringan berbagai organ di vivo. Endapan
dalam menginduksi respon inflamasi atau sitotoksisitas, dan menyebabkan kerusakan organ /
jaringan multipel dalam bentuk gangguan terkait seperti vaskulitis sistemik,
glomerulonefritis, chorea dan lain-lain.
Osilasi hasil ELISA untuk penentuan konsentrasi antibodi anti-ssDNA. Telah
dilaporkan bahwa pada sebagian besar pasien lupus dan donor normal IgG1 dan IgG4 adalah
yang paling melimpah (> 30 %), sementara IgG2 dan IgG3 hadir pada konsentrasi yang lebih
rendah (<30%). Hasil ELISA untuk subkelas IgG telah menunjukkan bahwa ada distribusi
yang sama dari semua 4 subkelas yang diperoleh ketika kedua metode diuji , dengan
pengecualian IgG4 yang jauh lebih tinggi pada sampel dengan Melon-gel. Menurut literatur,
antibodi anti-DNA hidrolitik dari subkelas IgG1 dan IgG3.
Hasil UV dan Lab-on-chip, juga menunjukkan bahwa antibodi anti-ssDNA dapat
memiliki aktivitas hidrolitik, menunjukkan bahwa antibodi ini mampu hidrolisis dalam
modalitas IgG dan IgM-nya dan bahwa aktivitas IgM adalah 17 kali lebih tinggi dari IgG.
Hasil IEF yang berfokus pada isoelektrik Antibodi yang dimurnikan dari pasien
lupus adalah poliklonal dan bahwa B-CLL dan antibodi donor normal adalah monoklonal,
sehingga memperhitungkan pola pita yang berbeda. Ini juga merupakan indikasi bahwa sel-B
dalam B-CLL dan individu normal lebih dekat dalam evolusi daripada sel B-lupus.

6. Kesimpulan
 Melon-gel jauh lebih efisien dalam memurnikan antibodi anti-DNA ss-DNA daripada
metode manik-magnetik.
 Deteksi antibodi poliklonal dalam lupus sera dibandingkan dengan antibodi
monoklonal dalam kasus B-CLL dan individu yang secara klinis diam, menunjukkan
bahwa hasil yang lebih rendah
 Western Blot dan reaksi dimediasi antibodi enzimatik memberikan konfirmasi visual
tentang keberadaan molekul IgG yang sangat murni dalam sampel yang diperoleh
melalui prosedur pemurnian manik magnetik, dibandingkan dengan melon-gel.
 Osilasi hasil ELISA untuk penentuan konsentrasi antibodi anti-ssDNA menunjukkan
bahwa ada distribusi yang sama dari semua 4 subkelas yang diperoleh ketika kedua
metode diuji , dengan pengecualian IgG4 yang jauh lebih tinggi pada sampel yang
diobati dengan Melon-gel. Menurut literatur, antibodi anti-DNA hidrolitik dari
subkelas IgG1 dan IgG3.
 Hasil UV dan Lab-on-chip, juga menunjukkan bahwa antibodi anti-ssDNA dapat
memiliki aktivitas hidrolitik, menunjukkan bahwa antibodi ini mampu hidrolisis
 dalam modalitas IgG dan IgM-nya dan bahwa aktivitas IgM adalah 17 kali lebih
tinggi dari IgG.
 Hasil IEF yang berfokus pada isoelektrik, menunjukkan bahwa antibodi yang
dimurnikan dari pasien lupus adalah poliklonal dan bahwa B-CLL dan antibodi donor
normal adalah monoklonal, sehingga memperhitungkan pola pita yang berbeda. Ini
juga merupakan indikasi bahwa sel-B dalam B-CLL dan individu normal lebih dekat
dalam evolusi daripada sel B-lupus.