Probe

Probe untuk Southern dan Northernblots adalah fragmen asam nukleat beruntai tunggal. Tujuan
dari probe adalah untuk mengidentifikasi satu atau lebih urutan yang menarik dalam sejumlah
besar asam nukleat. Oleh karena itu, probe harus berhibridisasi secara spesifik dengan DNA
target atau RNA yang akan dianalisis. Probe dapat berupa RNA, DNA terdenaturasi, atau asam
nukleat termodifikasi lainnya. Peptida asam nukleat (PNA) dan asam nukleat terkunci juga telah
digunakan sebagai probe. Struktur ini mengandung basa nitrogen normal yang dapat
berhibridisasi dengan komplementer DNA atau RNA, tetapi basa dihubungkan oleh tulang
punggung berbeda dari tulang punggung fosfodiester alami DNA dan RNA. Tulang punggung
yang dimodifikasi ini tahan terhadap degradasi nuklease dan karena berkurangnya muatan
negatif pada tulang punggungnya, dapat lebih mudah berhibridisasi untuk menargetkan DNA
atau RNA.
Probe untuk Western blot adalah protein pengikat spesifik atau antibodi. Antibodi sekunder
berlabel diarahkan terhadap protein pengikat primer kemudian digunakan untuk visualisasi pita
protein yang menarik.

Probe DNA

Probe DNA dibuat dengan beberapa cara. Sebuah fragmen dari gen yang akan dianalisis dapat
dikloning pada plasmid bakteri dan kemudian diisolasi oleh pencernaan enzim restriksi dan
pemurnian gel. Fragmen, setelah diberi label (lihat bawah) dan denaturasi, kemudian dapat
digunakan di Selatan atau Prosedur Northernblot. Sumber lain dari probe DNA termasuk isolasi
urutan yang menarik dari genom virus dan in vitro sintesis organik dari sepotong asam nukleat
yang memiliki urutan tertentu. Yang terakhir hanya digunakan untuk jangka pendek, probe
oligomer. Probe juga dapat disintesis menggunakan reaksi berantai polimerase (PCR) (lihat Bab
7) untuk menghasilkan sejumlah besar sekuens DNA spesifik.
Panjang probe akan, sebagian, menentukan spesifisitas reaksi hibridisasi. Panjang probe
berkisar dari puluhan hingga ribuan pasangan basa. Dalam analisis seluruh genom dalam
Southern blot, probe yang lebih panjang lebih spesifik untuk wilayah DNA karena harus sesuai
dengan urutan yang lebih panjang pada target. Probe yang lebih pendek tidak biasanya
digunakan di Southern blot karena urutannya pendek lebih mungkin ditemukan di beberapa
lokasi di genom, menghasilkan pengikatan latar belakang tinggi ke urutan yang tidak terkait
dengan wilayah target yang diinginkan. Probe pendek lebih tepat untuk analisis mutasi karena
mereka sensitif terhadap ketidakcocokan basis tunggal (lihat Bab 8). Probe dibangun sehingga
memiliki komplementer urutan ke gen yang ditargetkan. Untuk mengikatke probe kemudian,
asam nukleat target harus mengandung urutan yang diinginkan. Biasanya ada lebih sedikit
salinan dari urutan spesifik dalam genom, dan karena itu hanya sedikit pita akan terlihat setelah
deteksi.
Probe DNA yang disiapkan dan disimpan dengan benar relatif stabil dan mudah dibuat.
Probe DNA untai ganda harus didenaturasi sebelum digunakan. Hal ini biasanya dilakukan
dengan memanaskan probe (misalnya, 95 C, 10-15 menit) dalam larutan hibridisasi atau
perlakuan dengan 50% formamida / 2X SSC pada suhu yang lebih rendah untuk a waktu yang
lebih singkat (mis., 75 ° C, 5-6 menit)

Probe RNA

Probe RNA sering dibuat dengan transkripsi dari template DNA sintetis in vitro. Probe ini mirip
dengan probe DNA dengan afinitas pengikatan yang sama atau lebih besar terhadap sekuens
homolog. Karena RNA dan DNA membentuk heliks yang lebih kuat daripada DNA / DNA,
probe RNA mungkin menawarkan lebih banyak sensitivitas daripada probe DNA di Southern
blot.

Probe RNA dapat disintesis langsung dari plasmid template atau dari DNA template yang
dihasilkan oleh PCR (lihat Bab 7). Sistem yang dirancang sebelumnya bersifat komersial tersedia
untuk tujuan ini. Produk-produk ini termasuk plasmid DNA vektor seperti pGEM (Promega)
atau pBluescript (Stratagen), yang mengandung situs pengikatan untuk RNA polimerase
(promotor) dan situs kloning untuk sekuens yang diinginkan, dan RNA polimerase yang
bergantung pada DNA dari bakteriofag Salmonella SP6 atau bakteriofag E. Coli T3 atau T7.
Urutan DNA yang melengkapi transkrip RNA yang akan dianalisis diklon ke dalam vektor
plasmid menggunakan enzim restriksi. Vektor rekombinan yang mengandung gen yang
diinginkan kemudian dilinearisasi, dan Probe RNA ditranskripsi secara in vitro dari promotor.
Probe RNA diberi label dengan memasukkan aradioaktif atau nukleotida yang dimodifikasi
selama proses transkripsi in vitro.
Baik pengkodean atau RNA komplementer akan berhibridisasi ke target DNA untai
ganda. Namun, perawatan harus dilakukan dalam merancang probe RNA untuk Northern blots.
Urutan komplementer ke target harus digunakan untuk probe. Probe dengan urutan yang identik
dengan target RNA (urutan pengkodean) tidak akan berhibridisasi. Karena pelabelan selama
sintesis, probe RNA dapat memiliki aktivitas spesifik yang tinggi (sinyal ke mikrogram probe)
yang meningkatkan sensitivitas probe. Untuk menghindari latar belakang yang tinggi, beberapa
protokol termasuk pencernaan nonhybridized RNA, menggunakan RNase spesifik, seperti RNase
A, setelah hibridisasi selesai.
Probe RNA umumnya kurang stabil dibandingkan probe DNA dan tidak dapat disimpan
dalam waktu lama. Sintesis probe RNA dengan transkripsi dari template yang disimpan relatif
sederhana dan harus dilakukan dalam beberapa hari penggunaan. Template DNA dapat
dikeluarkan dari probe dengan pengobatan dengan DNase bebas RNase. Meskipun RNA sudah
beruntai tunggal, denaturasi sebelum digunakan direkomendasikan untuk menghilangkan
struktur sekunder bagian dalam molekul RNA.
Jenis Probe Asan Nukleat Lainnya

Asam nukleat peptida dan probe asam nukleat terkunci (Gbr. 6-9 dan 6-10) dapat disintesis
menggunakan metode kimia.5-8 Asam nukleat yang dimodifikasi ini memiliki keuntungan
karena tahan terhadap nuklease yang akan terdegradasi DNA dan RNA dengan memecahkan
tulang punggung fosfodiester. Selanjutnya, muatan negatif dari tulang punggung fosfodiester
DNA dan RNA menetralkan ikatan hidrogen antara dasar probe dan urutan target. Struktur
seperti PNA yang tidak memiliki muatan negatif berhibridisasi lebih efisien.
Antibodi poliklonal adalah campuran imunoglobulin yang diarahkan pada lebih dari satu
epitop (molekul struktur) pada antigen. Antibodi monoklonal lebih sulit untuk diproduksi.
Kohler dan Milstein dulu menunjukkan bahwa sel limpa dari tikus yang diimunisasi dapat
menyatu dengan sel myeloma tikus untuk membentuk hibrida sel (hibridoma) yang dapat tumbuh
dalam kultur dan mensekresi antibodi.9 Dengan mengkloning hibridoma (tumbuh) kultur kecil
dari sel tunggal), preparat spesifik antibodi dapat diproduksi terus menerus. Klon kemudian
dapat disaring untuk antibodi yang bereaksi paling baik dengan antigen sasaran. Antibodi
monoklonal dapat diisolasi dari cairan kultur sel. Titer antibodi yang lebih tinggi adalah
diperoleh dengan menginokulasi hibridoma penghasil antibodi ke tikus dan mengumpulkan
cairan peritoneum. antibodi monoklonal kemudian diisolasi dengan kromatografi. Antibodi
poliklonal berguna untuk imunopresipitasi metode dan dapat digunakan untuk Western blot.
Dengan milik mereka spesifisitas yang lebih besar, antibodi monoklonal dapat digunakan untuk
hampir semua prosedur.
Dalam teknologi Western blot, antibodi poliklonal dapatnmemberikan sinyal yang lebih
kuat, terutama jika epitop target sebagian hilang selama elektroforesis dan transfer.nAntibodi
monoklonal lebih spesifik dan mungkin memberikan sedikit latar belakang; Namun, jika epitop
yang ditargetkan hilang,nantibodi ini tidak mengikat, dan tidak ada sinyal yang
dihasilkan.nPengenceran antibodi primer dapat berkisar dari 1/100 hingga 1 / 100.000,
tergantung pada sensitivitas sistem deteksi (lihat di bawah).

Pelabelan Probe

Untuk memvisualisasikan probe yang terikat pada fragmen target pada blot, probe harus diberi
label dan menghasilkan sinyal yang dapat dideteksi. Analisis Selatan asli yang digunakan
pelabelan radioaktif dengan 32P. Pelabelan ini dicapai dengan pengenalan nukleotida yang
mengandung fosfor radioaktif ke probe. Saat ini, banyak laboratorium klinis gunakan pelabelan
nonradioaktif untuk menghindari bahaya dan biaya bekerja dengan radiasi. Metode pelabelan
nonradioaktif didasarkan pada deteksi tidak langsung dari nukleotida yang ditandai yang
digabungkan atau ditambahkan ke probe. Dua tag nonradioaktif yang paling umum digunakan
adalah biotin dan digoxygenin (Gbr. 6-11), salah satunya dapat terikat secara kovalen pada
nukleotida trifosfat, biasanya UTP atau CTP.
Ada tiga metode dasar yang digunakan untuk memberi label a Probe DNA: pelabelan
akhir, terjemahan nick, dan priming acak. Pelabelan akhir melibatkan penambahan nukleotida
berlabel ke ujung fragmen menggunakan terminal transferase atau T4 polinukleotida kinase.
Dalam terjemahan nick, nukleotida berlabel dimasukkan ke dalam fragmen beruntai tunggal,
atau torehan, dalam probe beruntai ganda. DNA polimerase memperpanjang ujung yang rusak
dari satu untai menggunakan untai komplementer yang utuh untuk cetakan dan menggantikan
untai yang sebelumnya telah dihibridisasi. Priming acak menghasilkan versi untai tunggal baru
dari probe dengan penggabungan nukleotida berlabel. Sintesis untaian baru ini disiapkan oleh
oligomer urutan acak yang enam sampai sepuluh dasar panjangnya. Urutan pendek ini akan,
pada frekuensi tertentu, melengkapi urutan dalam probe dan prime sintesis salinan probe dengan
nukleotida berlabel yang tergabung. Probe RNA ditranskripsi dari DNA kloning atau DNA yang
diperkuat. Probe ini diberi label selama sintesisnya dengan penggabungan nukleotida yang
ditandai dengan radioaktif, biotinilasi, atau digoksigenin. Tidak seperti untai ganda probe DNA
komplementer dan target yang mengandung kedua untai urutan komplementer, Probe RNA
adalah untai tunggal dengan hanya satu untai dari urutan komplementer yang diwakili.