Nama Berliani Puspita Sari

NIM 205100501111001
Kelas Q
Kelompok Q3

BAB I
EKSTRAKSI DAN UJI AKTIVITAS AMILASE

A. Pre Lab
1. Mengapa pada percobaan ini digunakan kecambah biji-bijian untuk ekstraksi enzim
amilase?
Pada percobaan ekstraksi dan uji aktivitas amilase digunakan kecambah biji-bijian
untuk ekstraksi enzim amilase ini dikarenakan enzim amilase banyak terdapat pada
kecambah biji-bijian. Sumber enzim amilase dalam biji dibentuk pada waktu awal
perkecambahan yang mana saat pertumbuhan tanaman berasal dari biji diawali dari proses
perkecambahan yang memerlukan energi dan energi tersebut berasal dari perombakan
bahan-bahan organik seperti karbohidrat, lemak, dan protein. Dalam hal ini enzim-enzim
tersebut antara lain protease, lipase, dan amilase secara bersamaan dihasilkan tumbuhan
secara alami saat melakukan proses perkecambahan (Bahri dkk., 2012). Adapun kecambah
biji-bijian pada percobaan yakni menggunakan biji kacang hijau yang mampu
memproduksi enzim amilase yang berfungsi untuk menghidrolisis ikatan α 1,4 glikosida
pada pati menjadi senyawa yang lebih sederhana seperti oligosakarida, disakarida, atau
monosakarida (Mikawlrawng, 2016). Darmayanti dkk. (2013) juga menambahkan bahwa
saat biji berkecambah, biji memerlukan enzim amilase yang berperan sebagai katalisator
sekaligus pengontrol perkecambahan. Enzim ini mampu menguraikan cadangan makanan
biji berupa amilum menjadi senyawa yang lebih sederhana melalui proses hidrolisis,
sehingga dapat dimanfaatkan sebagai sumber energi untuk perkecambahan. Berdasarkan
hal tersebut, maka kecambah biji-bijian berpotensi sebagai penghasil enzim amilase. Oleh
karena itu, pada percobaan ini digunakan kecambah biji-bijian untuk ekstraksi enzim
amilase.

2. Jelaskan prinsip pengukuran aktivitas enzim amilase secara kuantitatif pada percobaan ini?
Prinsip pengukuran aktivitas enzim amilase secara kuantitatif yakni dengan mengukur
kadar maltosa atau kadar gula tereduksi yang terbentuk akibat adanya hidrolisis enzim
terhadap substrat saat setelah dilakukan proses inkubasi yang diukur menggunakan metode
DNS atau dinitrosalicylic acid yang mana ditentukan oleh spektrofotometer UV-Vis pada
panjang gelombang 550 nm. Dalam hal ini pengukuran aktivitas enzim pada sampel dengan
reagen DNS digunakan untuk menentukan kadar gula reduksi yang dihasilkan dari aktivitas
enzim. Kadar gula ini ditentukan dengan membuat kurva standar glukosa untuk mengetahui
konsentrasi larutan dengan nilai absorbansinya. Hasil absorbansi pada sampel nantinya
disubstitusikan pada persamaan kurva standar atau regresi linier yang didapat untuk
menghitung gula pereduksi enzim yang merupakan aktivitas enzim amilase dari sampel
yang diuji dengan metode DNS menghasilkan 1 mg/ml glukosa pada kondisi optimum
(Mayasari, 2016). Reaksi DNS yang terjadi merupakan reaksi redoks pada gugus aldehid
gula dan teroksidasi menjadi gugus karboksil dimana pada suasana basa, gula pereduksi
akan mereduksi DNS untuk membentuk asam 3-amino-5-nitrosalisilat yang mampu
menyerap dengan kuat radiasi gelombang elektromagentik pada panjang gelombang
 Nama Berliani Puspita Sari
NIM 205100501111001
Kelas Q
Kelompok Q3

tertentu. Semakin banyak gula pereduksi maka semakin banyak pula molekul asam 3 –
amino-5-nitrosailisat yang terbentuk. Adanya senyawa gula pereduksi pada sampel ini
ditunjukkan dengan larutan DNS yang semula berwarna kuning berubah menjadi merah
jingga (Theo, 2013).

3. Bagaimana cara mengidentifikasi secara kualitatif bahwa telah terjadi reaksi enzimatis pada
percobaan ini?
Cara mengidentifikasi secara kualitatif bahwa telah terjadi reaksi enzimatis pada
percobaan ini yakni dalam pengujian aktivitas enzim amilase secara kualitatif dapat
ditunjukkan dengan mengamati adanya perubahan warna dari kuning menjadi warna merah
jingga pada sampel yang diuji. Hal ini dikarenakan terdapat reaksi reduksi dari gugus nitro
(-NO2) menjadi gugus amina (-NH2) oleh ujung gula pereduksi hasil degradasi pati oleh
enzim amilase dimana pada proses hidrolisis pati menghasilkan molekul oligosakarida dan
monosakarida yang memiliki ujung gugus pereduksi. Ujung pereduksi inilah nantinya akan
mereduksi DNS yang semula memiliki warna kuning berubah menjadi spesi tereduksi
dengan warna merah jingga. Perubahan warna tersebut dapat ditentukan dengan analisis
spektofotometer UV-Vis yang selanjutnya aktivitas enzim amilase ini juga akan
menghasilkan molekul sederhana kembali yang memiliki gugus pereduksi, sehingga jumlah
ujung gugus pereduksi dalam larutan akan bertambah. Pertambahan ujung gugus pereduksi
ini nantinya akan berpengaruh pada perubahan warna dalam uji DNS (Mayasari, 2016).
Dengan adanya perubahan warna pada larutan tersebut menandakan bahwa telah terjadi
reaksi enzimatis dalam percobaan yakni enzim amilase yang merombak suatu pati menjadi
molekul yang lebih sederhana seperti glukosa atau maltosa.
 Nama Berliani Puspita Sari
NIM 205100501111001
Kelas Q
Kelompok Q3

B. Diagram Alir dan Analisis Prosedur

a) Persiapan Sampel a) Persiapan Sampel

1. Biji kacang hijau kering dan segar digunakan sebagai
1. sampel dalam percobaan ekstraksi dan uji aktivitas
Biji kacang hijau kering enzim amilase karena biji kacang hijau memiliki kadar
50gr pati yang tinggi dan biji ini juga akan menghasilkan
2. kecambah biji-bijian sebagai sumber potensi penghasil
Ditimbang sebanyak 50 g 3. amilase.
2. Kemudian, biji kacang hijau ditimbang dengan
timbangan analitik sebanyak 50 gr yang sebelumnya
timbangan dikalibrasi menjadi nol agar berat dari kertas
10 g biji 10 g biji 10 g biji 10 g biji timbang atau gelas arloji tidak mengganggu hasil proses
10 g biji
timbangan.
kacang K. hijau K. hijau K. hijau K. hijau 3. Setelah dilakukan penimbangan, sampel biji kacang
hijau direndam dikecambah dikecambah dikecambah hijau ini dibagi menjadi 5 bagian dengan perlakuan yang
kering 12 jam kan 12 jam kan 24 jam kan 48 jam berbeda yakni biji kacang hijau kering, biji kacang hijau
yang direndam semalam selama 12 jam, biji kacang
hijau yang dikecambahkan selama 12 jam, biji kacang
hijau yang dikecambahkan selama 24 jam, dan biji
kacang hijau yang dikecambahkan selama 48 jam.
Masing-masing perlakuan tersebut ditimbang dengan
Hasil timbangan analitik sebanyak 10 gram tiap perlakuan. Hal
4. ini dilakukan untuk membandingkan antara lima
perlakuan pada uji aktivitas enzim amilase.
4. Jadilah hasil dari praktikum ini dengan sampel siap
untuk dilakukan ekstraksi enzim amilase.
 Nama Berliani Puspita Sari
NIM 205100501111001
Kelas Q
Kelompok Q3

b) Ekstraksi Enzim Amilase b) Ekstraksi Enzim Amilase

1. Sampel yang digunakan pada ekstraksi enzim amilase
Sampel yakni sampel kacang hijau yang telah disiapkan
1. sebelumnya dengan perlakuan yang berbeda masing-
masing 10 gram.
2. Lalu, masing-masing sampel dihancurkan dengan mortar
Dihancurkan 2. untuk mendapatkan enzim amilase yang termasuk dalam
3. enzim endoseluler sehingga untuk memisahkan atau
Ditimbang sebanyak 5 g mengekstraksi dilakukan penghancuran secara mekanik
50 ml buffer asetat pada masing-masing sampel.
(0,1-0,5M) pH 5,5 3. Tiap sampel tersebut akan ditimbang dengan timbangan
Didiamkan selama +- 30 menit analitik sebanyak 5 gram yang kemudian dimasukkan
4. dalam erlenmeyer dan ditambahkan 50 ml buffer asetat
(0,1-0,5 M) pH 5,5. Buffer asetat berfungsi untuk
Disaring dengan kertas saring whatman mempertahankan pH karena enzim yang digunakan
5. bekerja pada kondisi optimum sesuai dengan pH yang
optimum.
Diambil filtratnya (larutan enzim kasar) 12 g 4. Kemudian, dibiarkan selama kurang lebih 30 menit sambil
sesekali diaduk agar campuran terhomogenisasi.
6.
5. Setelah mencapai 30 menit, larutan tersebut disaring
Disentrifugasi 1500 rpm selama 30 menit 7. dengan kertas saring whatman untuk diambil filtratnya.
6. Filtrat yang diambil sebanyak 12 gram di timbang dalam
tube sentrifuge. Filtrat tersebut merupakan larutan enzim
Diambil supernatannya 2 ml 8. kasar yang ditampung dalam gelas beaker.
7. Lalu, dilakukan proses sentrifugasi dengan kecepatan
1500 rpm selama 30 menit dengan sentrifuge untuk
9. memisahkan supernatan dengan pelet.
Hasil
8. Diambil bagian supernatan sebanyak 2 ml dimana
supenatan yang diperoleh ini merupakan ekstrak kasar
enzim amilase yang nantinya digunakan untuk
menentukan aktivitas ekstrak kasar enzim amilase.
 Nama Berliani Puspita Sari
NIM 205100501111001
Kelas Q
Kelompok Q3

9. Jadilah hasil dari praktikum ini yakni supernatan untuk uji

aktivitas enzim amilase

c) Pengukuran Aktivitas Enzim Amilase :
1. Pembuatan Kurva Standar :
a. Pembuatan Larutan Standar Maltosa
Nama Berliani Puspita Sari
NIM 205100501111001
Kelas Q
Kelompok Q3
c) Pengukuran Aktivitas Enzim Amilase :
1. Pembuatan Kurva Standar :
a. Pembuatan Larutan Standar Maltosa
1. Maltosa 50 g disiapkan terlebih dahulu yang
berfungsi sebagai bahan dalam pembuatan larutan
standar maltosa dimana maltosa adalah kadar gula
pereduksi. Lalu, ditambahkan dalam 50 ml buffer
asetat pada gelas beaker. Buffer asetat ini berfungsi
sebagai untuk menjaga kestabilan pH enzim serta
untuk melarutkan.
2. Kemudian, dilarutkan dengan magnetic stirrer agar
homogen.
3. Larutan yang sudah homogen diencerkan sehingga
diperoleh stok standar dengan konsentrasi 1000 ppm.
4. Setelah itu, dilakukan seri pengenceran sehingga
diperoleh konsentrasi larutan standar maltosa 0 ppm,
100 ppm, 200 ppm, 300 ppm, 400 ppm, 500 ppm,
600 ppm.
5. Jadilah hasil dari praktikum ini yakni larutan standar
maltosa yang sudah dibuat dengan stok standar pada
konsentrasi 1000 ppm dengan seri pengenceran yang
digunakan untuk pembuatan kurva standar maltosa.
 Nama Berliani Puspita Sari
NIM 205100501111001
Kelas Q
Kelompok Q3

b. Pembuatan Blanko Larutan Standar b. Pembuatan Blanko Larutan Standar

6.

7.

8.
 Nama Berliani Puspita Sari
NIM 205100501111001
Kelas Q
Kelompok Q3

c. Pembuatan Kurva Standar Maltosa c. Pembuatan Kurva Standar Maltosa

1. Larutan stok standar maltosa diambil dengan gelas ukur
sebanyak 1 ml yang telah dibuat sebelumnya dengan
masing-masing konsentrasi. Kemudian ditambahkan dengan
reagen DNS sebanyak 3 ml yang berfungsi sebagai larutan
blanko sekaligus untuk mendeteksi adanya gula pereduksi
dalam sampel hasil dari hidrolisis substrat pati olehenzim
amilase.
2. Lalu, dihomogenkan agar tercampur secara merata
3. Setelah itu, dilakukan proses inkubasi pada water bath
selama 15 menit dengan suhu 40°C agar mencapai suhu
optimum yang sesuai dengan suhu optimum enzim amilase.
Selama proses inkubasi ini akan terjadi reaksi enzimatis
yakni reaksi enzim dengan substrat yang akan menghasilkan
gula reduksi.
4. Larutan didinginkan, untuk mengurangi inaktifasi dimana
peningkatan suhu inkubasi dapat menyebabkan denaturasi.
5. Setelah dingin, dimasukkan ke dalam kuvet dan diukur
absorbansinya pada λ sebesar 550 nm yang merupakan λ
maksimum untuk penentuan aktivitas enzim.
6. Lalu dibuat kurva standar sesuai absorbansi larutan yang
dihasilkan pada spektorofotometer. Kurva ini berfungsi
untuk mengetahui konsentrasi larutan (sumbu x) dengan
nilai absorbansinya (sumbu y).
7. Jadilah hasil dari praktikum ini yakni kurva standar yang
merupakan persamaan regresi linier y= ax+b yang akan
 Nama Berliani Puspita Sari
NIM 205100501111001
Kelas Q
Kelompok Q3

digunakan dalam pengukuran kadar enzim.

d. Pengukuran Aktivitas Enzim Amilase d. Pengukuran Aktivitas Enzim Amilase

1) Pembuatan Larutan Substrat Pati 1) Pembuatan Larutan Substrat Pati
1. Soluble starch (Merck) disiapkan terlebih dahulu
dengan ditimbang menggunakan timbangan analitik
sebanyak 0,2 gram dimana bahan ini digunakan sebagai
Soluble Starch 0,2 gr 1. substrat pada uji aktivitas enzim amilase yang dihidrolisis
oleh enzim amilase. Lalu, dimasukkan ke dalam gelas
20 ml aquades beaker dan ditambahkan dengan aquades sebanyak 20 ml.
2. Setelah itu, dilarutkan dengan magnetic stirrer agar
Dilarutkan dengan magnetic stirrer
2. campuran larutan tersebut homogen secara merata
3. Kemudian, diaduk dengan spatula kaca agar tidak
Diaduk dan dipanaskan hingga jernih dan homogen 3. terjadi penggumpalan serta dipanaskan larutan
menggunakan kompor listrik hingga kenampakan terlihat
4. jernih dan sudah tercampur atau terhomogenisasi.
4. Jadilah hasil berupa larutan substrat pati yang
Hasil nantinya digunakan pada percobaan selanjutnya yakni
pengukuran aktivitas enzim hasil ekstraksi.
 Nama Berliani Puspita Sari
NIM 205100501111001
Kelas Q
Kelompok Q3

2) Pembuatan Blanko Enzim Amilase 2) Pembuatan Blanko Enzim Amilase

1. Aquades dengan gelas ukur sebanyak 10 ml yang
selanjutnya ditambahkan dengan buffer asetat sebanyak 50 ml
1. sebagai larutan blanko pada pengukuran aktivitas enzim
10 ml Aquades
amilase.
50 ml buffer asetat 2. Dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml yang kemudian
ditambahkan dengan aquades.
Dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml
3. Aquades ditambahkan hingga tanda batas pada labu ukur
Aquades 2. 4. Kemudian, dihomogenkan dengan cara dibolak-balik
Ditambahkan hingga tanda batas hingga tercampur secara merata.
3. 5. Jadilah hasil dari praktikum ini yakni blanko enzim amilase
Dihomogenkan yang dibuat untuk mengetahui aktivitas enzim tanpa adanya
4. ekstrak atau sebagai kontrol untuk membandingkan pada
masing-masing sampel.

Hasil
5.
Nama Berliani Puspita Sari
NIM 205100501111001
Kelas Q
Kelompok Q3
3) Pengukuran Aktivitas Enzim Amilase 3) Pengukuran Aktivitas Enzim Amilase

1. 1. Disiapkan enzim hasil ekstraksi sebanyak 1 ml berupa

Ekstrak Enzim Amilase 1 ml dan buffer asetat 1 ml ekstraksi enzim amilase pada biji kacang hijau dengan
masing-masing perlakuan dalam gelas beaker. Kemudian,
1 ml larutan substrat pati
ditambahkan masing-masing dengan 1 ml larutan substrat
Dihomogenkan
2. pati yang sebelumnya dibuat sebagai substrat yang akan
dihidrolisis oleh enzim dan 1 ml buffer asetat ditambahkan
3.
Diinkubasi (30°C, 3 menit) dengan 1 ml larutan substrat pati sebagai blanko.
2 ml DNS (3,5 DNS) 2. Lalu, campuran larutan tersebut dihomogenkan agar semua
larutan terhomogenisasi secara merata.
Dipanaskan selama 15 menit hingga merah jingga 4. 3. Proses inkubasi pada shaker water bath selama 3 menit
pada suhu optimum 30°C agar mencapai suhu optimum
Didinginkan secara cepat dengan air mengalir 5. yang sesuai dengan suhu optimum pada enzim amilase.
Selama proses inkubasi, terjadi reaksi enzimatis antara
20 ml aquades
enzim dengan substrat yang menghasilkan gula reduksi
Diukur absorbansinya dengan spektrofotometer berupa glukosa dengan enzim amilase. Setelah itu, maka
pada λ 550 nm 6. glukosa ini direaksikan dengan reagen DNS sebanyak 2 ml
untuk menyempurnakan reaksi yang terjadi. Reagen DNS
berfungsi untuk mendeteksi adanya gula pereduksi dalam
Dihitung kadar maltosa dari plotting sampel maltosa hasil dari hidrolisis substrat pati tersebut.
7.
regresi linear standar maltosa 4. Selanjutnya, sampel dan blanko yang ditambah DNS
dipanaskan dengan kompor listrik pada gelas beaker yang
8. berisi aquades selama 15 menit hingga warnanya berubah
Hasil
menjadi merah jingga. Hal ini ditujukan untuk
menginaktivasi enzim.
5. Didinginkan secara cepat dengan air mengalir agar enzim
tidak terdenaturasi saat setelah melakukan proses
 pemanasan. Kemudian diencerkan terlebih dahulu dengan
menambahkan 20 ml aquades. Aquades sebagai pengencer.
6. Setelah dingin, blanko dan masing-masing sampel tersebut
diukur nilai absrobansinya menggunakan spektrofotometer
pada panjang gelombang maksimum yakni 550 nm. Jika
absrobansi bernilai negatif maka ulangi mulai dari tahap
awal yakni setelah penambahan DNS sebelum dipanaskan
encerkan terlebih dahulu larutan sampel dengan labu ukur
10 ml. Hasil pengenceran kemudian dipanaskan dan diukur
kembali absorbansinya. Larutan blanko ini dimasukkan
terlebih dahulu pada kuvet dan dimasukkan ke
spektorofotometer untuk kalibrasi yang kemudian kuvet
yang berisi sampel diukur nilai absorbansinya.
7. Dan dihitung kadar maltosa dari plotting regresi linier
standar maltosa. Kadar maltosa inilah yang menujukkan
nilai dari aktivitas ekstrak kadar amilase dalam
menghasilkan glukosa atau maltosa.