MODUL PRAKTIKUM BIOKIMIA

PRAKTIKUM 10: PEMURNIAN PROTEIN

LABORATORIUM BIOKIMIA

S1 JURUSAN FARMASI KLINIS DAN KOMUNITAS

STIKES WIDYA DHARMA HUSADA TANGERANG

2021
I. Tujuan

Tujuan dilakukannya praktikum adalah agar mahasiswa dapat memahami teknik

pemurnian protein.

II. Teori Dasar

Protein

Protein merupakan makromolekul yang terbentuk dari asam amino yang tersusun dari
atom nitrogen, karbon, dan oksigen, serta beberapa atom lain, diantaranya sulfur
(seperti: metionin, sistin dan sistein) yang dihubungkan oleh ikatan peptida. Dalam
makhluk hidup, protein berperan sebagai pembentuk struktur sel dan beberapa jenis
protein memiliki peran fisiologis (Bintang, 2010).
Protein yang yang mempunyai aktivitas katalis disebut enzim. Hampir semua reaksi
kimia biomolekul organik di dalam sel dikatalisis oleh enzim. Lebih dari 2000 jenis
enzim, masing-masing dapat mengkatalisis reaksi kimia yang berbeda (Bintang, 2010).

Pada paktikum ini, protein yang akan dimurnikan adalah LDH (Laktat dehidrogenase).

Enzim Laktat dehidrogenase

Laktat dehidrogenase (LDH atau LD) adalah enzim intraseluler yang terdapat di
hampir semua sel hidup terutama sel yang terdapat pada jaringan terutama ginjal,
rangka, hati, dan otot jantung. LDH dibutuhkan untuk mempertahankan glikolisis dan
produksi adenosina trifosfat (ATP) pada kondisi minim oksigen dengan cara
meregenerasi nikotinamida adenina dinukleotida bentuk teroksidasi (NAD+) dari
nikotinamida adenina dinukleotida bentuk tereduksi (NADH). LDH berfungsi
mengkatalisis proses reduksi piruvat menjadi laktat dan menghasilkan NAD+.
Produknya, yaitu laktat merupakan hasil samping dari reaksi ini. LDH mempengaruhi
proses pembentukan asam laktat.
Laktat dehidrogenase merupakan enzim yang berperan di balik rasa asamnya susu, dan
karena itu banyak dimanfaatkan untuk membuat olahan susu, termasuk keju cottage,
kefir, dan yogurt. Beberapa pembuat bir dan kilang anggur bahkan menggunakan
dehidrogenase laktat untuk menciptakan rasa asam yang berbeda dalam bir atau anggur
mereka. Enzim ini akan bekerja baik di dalam maupun di luar sel, dan mengubah
piruvat menjadi asam laktat. Asam laktat memiliki rasa asam yang khas

Gambar 1. Reaksi yang dikatalisis LDH

Gambar 1 menunjukkan fungsi katalitik dari LDH.

Gambar 2. Mekanisme reaksi dari LDH.

Pemurnian Protein

Berikut teknik yang dapat dilakukan untuk pemurnian protein/enzim

1. Ekstraksi dan Fraksinasi dengan Salting Out

Ekstraksi
Metode ekstraksi enzim ditentukan oleh jenis sumbernya. Enzim yang terdapat
pada tepung biji-bijian diekstraksi dengan cara mencampur pada media cair kemudian
diaduk, enzim dari bagian tanaman yang bersifat lunak diekstraksi dengan dipotong
kecil-kecil, dipres kemudian disaring dengan kain, sedangkan untuk mengekstrak
enzim dari daun dan biji-bijian atau daging dengan cara digiling, dihomogenasi dalam
media cair atau langsung diblender dalam media cair. Dalam ekstraksi enzim dari
tanaman atau daging digunakan bufer untuk mempertahankan harga pH. Beberapa pH
yang dapat digunakan diantaranya : bufer tris-hidroksimetil amino metan, bufer glisin
dan bufer fosfat.

Fraksinasi dengan salting out

Banyak metode yang digunakan untuk fraksinasi protein terutama
berdasarkan ukuran molekul dari protein. Sebagai contoh, protein yang diangkat dari
larutan dengan menambahkan garam, proses yang memisahakan protein yang
berukuran lebih kecil dari ukuran molekul protein yang lebih besar. Peristiwa
pemisahan atau pengendapan protein oleh garam berkonsentrasi tinggi disebut "salting
out". Salting out merupakan metode yang digunakan untuk memisahkan protein yang
didasarkan pada prinsip bahwa protein kurang terlarut ketika berada pada daerah yang
konsentrasi kadar garamnya tinggi. Konsentrasi garam diibutuhkan oleh protein untuk
mempercepat keluarnya larutan yang berbeda dari protein satu ke protein yang lainnya.
Pengaruh penambahan garam terhadap kelarutan protein berbeda-beda, tergantung
pada konsentrasi dan jumlah muatan ionnya dalam larutan. Semakin tinggi konsentrasi
dan jumlah muatan ionnya, semakin efektif garam dalam mengendapkan protein.
(Yazid dan Nursanti, 2006)
Suatu campuran protein, seperti yang dapat diekstraksi dari jaringan dengan
menggunakan atau larutan garam encer, dapat dipisah-pisahkan dengan penambahan
sedikit demi sedikit ammonium sulfat. Pertama-tama globulin akan diendapkan dan
kemudian dapat dipisahkan dengan sentrifus atau dengan penyaringan. Albumin
mengendap apabila ammonium sulfat dalam larutan tersebut telah jenuh.
Kelarutan protein akan berkurang jika kedalam larutan protein ditambahkan
garam- garam anorganik. Pengendapan terus terjadi karena kemampuan ion garam
untuk menghidrasi, sehingga terjadi kompetisi antara garam anorganik dengan molekul
protein untuk mengikat air. Karena garam anorganik lebih menarik air maka jumlah air
yang tersedia untuk molekul protein akan berkurang.
Kegunaan dari ammonium sulfat untuk pemisahan protein adalah untuk
mempercepat dalam menghubungkan klasifikasi dari albumin dan globulin. Sodium
sulfat lebih sesuai untuk pemisahan analitik dari plasma protein.

2. Teknik yang digunakan untuk Pemisahan Protein menggunakan kromatografi

Kromatografi Gel
Kromatografi gel terdiri dari: kromatografi eksklusi, kromatografi
penyaring gel, dan kromatografi permeasi gel. Teknik Kromatografi ini paling mudah
dimengerti dan paling mudah dikerjakan dan sederhana. Diantara aplikasinya dapat
digunakan untuk menentukan bobot molekul polimer.
Metode ini didasarkan pada teknik fraksinasi yang tergantung dari ukuran molekul
polimer yang diinjeksikan ke dalam suatu kolom yang terdiri atas gel berpori berjari -
jari sekitar 50 -1060 A.
Kolom dapat melewatkan molekul pelarut yang merupakan fasa bergerak, sedangkan
molekul polimer yang lebih kecil dapat memasuki pori – pori gel, karena itu bergerak
lebih lambat disepanjang kolom dibanding molekul besar.
Kelebihan kromatografi gel diantaranya:
 1. Dapat memisahkan sampel dengan berat molekul tinggi (BM >2000),
makromolekuler seperti protein dan asam nukleat, kromatografi gel dapat
digunakan untuk mendapatkan distribusi berat molekul dari polimer sintetis.
2. Dapat memisahkan sampel secara mudah dengan jumlah yang lebih banyak
terutama jika penyusun campuran itu memiliki berat molekul yang sangat
berbeda.
3. Kromatografi gel sangat cocok untuk kerja awal, pemisahan eksplorasi dari
sampel yang tak diketahui. Pemisahan ini memberikan gambaran isi sampel
sehingga dapat diketahui dengan cepat apakah sampel itu memiliki berat
molekul rendah atau berat molekul tinggi.

Kromatografi Afinitas
Kromatografi afinitas memisahkan protein-protein berdasarkan interaksi
reversibel antara satu protein (atau grup protein-protein) dan pasangan ligan spesifik
ke matriks kromatografi. Teknik ini ideal untuk menangkap tahap intermediet dalam
protocol pemurnian dan dapat digunakan kapanpun pada ligan yang cocok sesuai untuk
ketertarikan dari protein tersebut.
Kromatografi tipe ini menggunakan bahan stasioner jenis khusus untuk
mengikat salah satu komponen dari sampel campuran secara spesifik. Molekul
pengikat tersebut memiliki nilai afinitas khusus, yang cenderung mudah mengikat
suatu substansi tertentu. Sifat inilah yang digunakan untuk proses kromatografi
afinitas. (Technoart staff, 2015)
 Gambar 3 Prinsip dasar kromatografi afinitas

Kromatografi afinitas biasa diaplikasikan untuk mengumpulkan sejenis protein

tertentu dengan melalui empat tahapan proses. Pertama (a), molekul zat stasioner harus
dalam kondisi setimbang dengan cara direndam di dalam larutan penyangga (buffer).
Kedua (b), memasukkan sampel campuran ke dalam zat stasioner sehingga molekul
stasioner akan mengikat molekul sasaran yang terdapat pada sampel. Ketiga (c) adalah
proses pengumpulan molekul protein yang terikat pada molekul stasioner dengan jalan
merubah kondisi kimia larutan penyangga. Biasanya larutan penyangga diubah kondisi
pH-nya, kekuatan ion atau polaritasnya. Proses keempat (d) adalah penyeimbangan
kembali bahan stasioner dengan jalan merendam kembali dengan larutan penyangga
penyeimbang. (Technoart staff, 2015)

III. Alat dan Bahan

Alat yang di gunakan:
- Kain penyaring
- Tabung sentrifugasi 50 Ml
 - Blender
- Tabung mikrosentrifugasi
- Pipet tip
- Tabung falcon 50 mL
- Batang pengaduk
- Beaker glass
- Alat sentrifuga
- Kolom desalting
- Rak tabung
Bahan yang digunakan
- 10 mM Tris-HCL (pH 7,4)
- 1 mM 2-Mercaptoethanol
- 1 mm Phenylmethylsulfonyl flouide (PMSF)
- 1 Mm ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA)
- Ammonium sulfate (solid)
- Daging ayam

IV. Prosedur Kerja

Presipitasi Laktat Dehidrogenase dari Ayam dengan Ammonium Sulfat
• Penyiapan jaringan
50 gram daging dada ayam dipotong kecil dan dibuang jaringan ikat dan
lemaknya.
• Ekstraksi protein yang larut
Dimasukan potongan dada ayam dan 75 ml dapar pengekstrasi dingin ke dalam
blender. Ditutup dan dihancurkan jaringan dengan homogenasi, blen-der 4x30
detik dengan jeda min 10 detik.
• Sentrifugasi
Dimasukkan homogenate kedalam 4 tabung sentri-fugasi 50 ml yang telah
didinginkan, dimasukkan dalam sentrifugasi selama 30 menit pada 2.500 rpm.
• Filtrasi
Dituangkan supernatant melalui kain penyaring kedalam gelas kimia yang
sudah didinginkan terlebih dahulu buang ampasnya. Diukur dan dicatat volume
supernatant, simpan 3 × 0,5 ml aliquot.
• Presipitasi dengan ammonium sulfat secara perlahan (lebih dari ~15 menit)
ditambahkan 0,39 gram ammonium sulfat per ml persupranatant ke dalam
supernatant yang telah disaring pada suhu dingin dan pengadukan dilakukan
secara perlahan agar tidak terjadi denaturasi protein (berbusa). Diaduk lagi 15
menit setelah selesai ditambahkan ammonium sulfat agar setimbang.
• Sentrifugasi
Sampel disentrifugasi dengan prosedur yang sama dengan no 3. Supernatant
dan pellet disimpan ditempat yang berbeda dan disimpan dilemari es untuk
tahap pemurnian selanjutnya. LDH seharusnya terkandung didalam pellet.

Kromatografi

• Tidak perlu dilakukan resuspensi bagi kelompok yang menggunakan

supernatantnya.
• Resuspensi pellet ammonium sulfat
Ditambahkan 1 ml dapat Tris-PMSF ke pellet ammonium sulfat perlahan (jangan
sampai terjadi gelebung). Diaduk campuran tersebut hingga pellet larut
pencampuran dilakukan diatas es. Diperiksa volume larutan (tidak lebih dari 3 ml,
jika kurang ditambah lagi hingga 3 ml)
• Memasukan larutan suspense ke dalam kolom desalting
 Ketika mendapatkan kolom, bagian atas frit akan ada larutan dapar, dibuang
larutan tersebut. Dimasukin sampel ke dalam kolom, dibuang cairan yang keluar
dari kolom
• Elusi protein dari kolom desalting
Dimasukan 4 ml dapar Tris-PMSF kedalam kolom dan ditampung cairan yang
keluar dari kolom (cairan ini mengandung protein LDH, simpan diatas es)
• Catat volume cairan yang keluar dari kolom (jika digunakan lebih dari satu kolom,
gabung cairan yang keluar dari tiap kolom ke dalam satu tabung dan ukur volume
total)

V. Data Pengamatan

Pada tahap pengambilan ekstrak kasar Apa warna dari ekstrak dari sampel daging
hasil yang didapatkan adalah ekstrak yang digunakan?
daging
Pada tahap sentrifugasi dihasilkan Apa warna dari supernatant dan apa warna
supernatant dan pellet dari pellet yang diperoleh?
Pada tahap filtrasi Berapa mL cairan supernatant yang
dihasilkan?
untuk tahap penambahan ammonium,
berapa gram Ammonium yang
dibutuhkan?
Pada tahap penambahan ammonium Apakah terjadi perubahan warna pada
dan pada saat pengadukan. warna pada cairan supernatant?
Pada tahap sentrifugasi yang kedua Apakah terjadi perubahan warna
supenatant?
Apakah terjadi perubahan warna pada
pellet ?
Tahap Pemisahan Supernatan dan Pelet (pasca sentrifugasi kedua)
Pada bagian Supernatan Tidak dilakukan tahap resuspensi.
Berapa mL hasil yang didapatkan setelah supernatant dimasukkan
dalam kolom desalting

Pada bagian Pelet dilakukan tahap resuspensi dengan penambahan larutan Tris-
PMSF
Berapa mL Hasil yang didapatkan setelah campuran pellet dan Tris-
PMSF (resuspensi) dimasukkan dalam kolom desalting ?
 DAFTAR PUSTAKA

Bintang, Maria. 2010. Biokimia Teknik Penelitian. Erlangga, Jakarta

Technoart staff.2015.Prinsip Kromatografi Afinitas http://artikel-

teknologi.com/macam-macam-kromatografi/2/

Yazid dan Nursanti.2006.Penuntun Praktikum Biokimia Untuk Mahasiswa Analis.

Yogyakarta: Penerbit Andi

Valvona CJ, Fillmore HL, Nunn PB, and Pilkington GJ. The Regulation and Function
of Lactate Dehydrogenase A: Therapeutic Potential in Brain Tumor. Brain
Pathology. 2016; 26(1): 3-17