M.K.

Bioteknologi Hasil Perairan

Isolasi Karakterisasi Senyawa Aktif Marine Fungi

REVISI

Disusun oleh
Annisa Diah Likandi C34190065

Antibacterial and cytotoxic activities screening of

symbiotic fungi extract isolated from marine sponge
Neopetrosia chaliniformis AR-01
Jenis-jenis mikroorganisme simbiosis, salah satunya adalah jamur
simbiosis spons yang dikenal sebagai produsen senyawa bioaktif (Bhadury et al.
2006) dan Ebel (2011) menjelaskan bahwa jamur yang diisolasi dari spons laut
adalah salah satu dari tiga sumber utama untuk menghasilkan metabolit sekunder
baru sebagai antikanker dan antimikroba. Metil-averantin, terisolasi senyawa
Aspergillus versicolor aktif melawan sel tumor line (XF498) dengan LC50
sebesar 0,41 g/mL. Kelas Meroterpenoid Alternatif sp. diperoleh dari
Callyspongia sp. diuji sebagai inhibitor NF-kB dalam sel kanker RAW264.7
dengan LC50 39 M, dan dankastin C diuji pada sel leukemia limfositik (P388)
dengan LC50 sebesar 57 g/mL, diisolasi dari Gymnascella dan kaliensis diperoleh
dari Homaxinella sp. (Lee et al. 2010; Zhang et al. 2013; Amagata dkk., 2013).
Studi pendahuluan tentang aktivitas antimikroba jamur dan bakteri baru-
baru ini meneliti spons Haliclona fascigera dan Petrosia nigrans dari Mandeh
Pulau Sumatera Barat (Handayani et al. 2015a, 2015b, 2016a, 2016b). Averantin
dari Aspergillus versicolor diperoleh dari Neopetrosia sp. memiliki aktivitas
sebagai antibakteri terhadap beberapa strain bakteri pathogen Staphylococcus
dengan kisaran MIC-nya 0,78-1,56 g/mL (Lee et al. 2010). Spons laut
Neopetrosia chaliniformis adalah salah satu dari spons endemik di laut Indonesia,
namun sampai sekarang belum ada literatur yang menjelaskan metabolit sekunder
N. chaliniformis termasuk metabolit sekunder symbiosis mikroba. Genus
Neopterosia telah menjadi mayor perhatian sebagai penghasil metabolit sekunder,
dan juga lebih dari 85 metabolit sekunder telah diisolasi dari spons ini (Qaralleh
et al. 2016).
Bahan dan Alat
N. chaliniformis dikumpulkan dari pulau Mandeh, Pantai Selatan,
Sumatera Barat, Indonesia, yang diambil dari kedalaman ± 10 m menggunakan
scuba diving. Spons segera ditempatkan di kantong plastik steril dan disimpan
dalam kotak es. Spons itu diidentifikasi oleh Dr. Nicole J. De Voogd, Pusat
Keanekaragaman Hayati Alami, Belanda. Spesimen voucher (AR-01) telah
disimpan di Koleksi Referensi Kelautan, Laboratorium Biota Sumatera,
Universitas Andalas, Sumatera Barat, Indonesia.
Isolasi Jamur Simbiotik dari Spons Laut
Isolasi jamur diawali dengan sterilisasi pada permukaan sampel. Spons
dibilas dengan air laut steril, kemudian dipotong kecil-kecil. Spons diambil
sebanyak 10 gram dimasukkan ke dalam Erlenmeyer dan ditambahkan 100 mL
steril air laut. Sampel diencerkan hingga mencapai konsentrasi 10 -6 dan
diinokulasi pada media SDA (Sabouraud Dextrose Agar), dan diinkubasi pada
suhu 27-29 °C selama 5-7 hari. Koloni itu memiliki bentuk dan warna yang
berbeda dengan koloni lain bisa dianggap sebagai isolat yang berbeda. Kemudian
dimurnikan dengan goresan metode untuk mendapatkan isolat murni dan
diidentifikasi berdasarkan Brigitte(1980).
Kultivasi Jamur Terisolasi dalam Media Padi
Isolat murni cendawan simbiosis dikultivasi pada padi sebagai media dan
diinkubasi pada suhu kamar selama 4-6 minggu sampai volume beras di
Erlenmeyer ditumbuhi jamur (Kjer et al. 2010).

Ekstraksi Metabolit Sekunder dari Isolat Jamur

Proses selanjutnya setelah isolat jamur tumbuh optimal, masing-masing
jamur diekstraksi setelah pertumbuhan optimal dengan metode ekstraksi maserasi
menggunakan etil asetat (EtOAc) dengan perbandingan 1:1 dengan 3 kali
pengulangan. Ekstrak etil asetat dikumpulkan dan diuapkan dalam vakum
menggunakan rotary penguap. Ekstrak EtOAc diuji antibakteri aktivitas dan
sitotoksik. Skrining Aktivitas Sitotoksik Telur udang air asin (Artemia salina)
ditetaskan pada suhu 500 mL air laut yang disaring dengan aerasi konstan selama
48 jam pada (27±2)oC. Setelah menetas, nauplii aktif bebas dari cangkang telur
adalah dikumpulkan dan digunakan untuk pengujian. Lima ratus, lima belas dan
lima mikroliter semua isolat jamur ditambahkan ke dalam well plate pada suhu
1000 ppm, konsentrasi 100 ppm dan 10 ppm dalam rangkap tiga. Lima belas
mikroliter ditambahkan 50 l DMSO dan sampai 5000 air laut yang berisi sepuluh
nauplii, sementara ditempatkan di sumur masing-masing dan dipertahankan pada
suhu kamar selama 24 jam. Air laut yang disaring digunakan sebagai kontrol
negatif. Nilai LC50 dihitung menggunakan metode curva berdasarkan analisis
probit (Meyer et al. 1982).
Skrining aktivitas antibakteri
Untuk skrining aktivitas antibakteri, ekstrak EtOAc jamur simbiosis diuji
terhadap Basillus subtilis, Staphylococcus epidemidis, Salmonella typosa, dan
Escherichia coli menggunakan metode paper disk. Satu lembar kertas steril 6 mm
disk direndam dalam masing-masing ekstrak EtOAc (50 mg/ml dalam DMSO).
Disk kertas juga diinokulasi dengan DMSO (kontrol negatif) dan Amikasin
sebagai kontrol positif. Aktivitas antagonis terdeteksi setelah inkubasi selama 24
jam pada suhu 30oC. Adanya zona bening dalam media dianggap sebagai
indikator aktivitas antibakteri. Zona hambat diukur dan dinyatakan dalam
milimeter. Strain yang menunjukkan penghambatan maksimum dipilih untuk uji
fitokimia.
Uji Fitokimia
Pengujian fitokimia dilakukan untuk semua ekstrak etil asetat jamur
simbiosis sesuai standar metode (Tiwari et al. 2011). Fenolik, alkaloid, steroid
dan Uji terpenoid dilakukan untuk mengetahui metabolit sekunder penyusun
dengan metode ini.
Penelitian tentang potensi ekstrak etil asetat dari jamur simbiotik spons
laut Neopetrosia chaliniformis AR-01 sebagai penghasil senyawa sitotoksik dan
antibakteri telah dilakukan. jamur symbiosis N. chaliniformis diisolasi dengan
metode pengecoran menggunakan Sabouraud Dextrose Agar (SDA) dan
dimurnikan dengan metode goresan. Cendawan hasil isolasi murni kemudian
dibudidayakan menggunakan media beras pada suhu 25-27°C selama 4-8 minggu
dan diekstraksi menggunakan pelarut etil asetat. Ekstrak etil asetat diuji sebagai
sitotoksik menggunakan Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) dan diuji sebagai
antibakteri terhadap bakteri patogen Gram positif (Bacillus subtilis dan
Staphylococcus epidermidis) dan Gram negatif (Escherichia coli dan Salmonella
typhosa) menggunakan metode difusi agar. 13 fungi simbiosis spons laut N.
chaliniformis yang telah telah diisolasi. Hasil penapisan aktivitas sitotoksik
menunjukkan bahwa 76,92 % atau 10 isolat fungi tergolong sitotoksik dengan
LC50 < 100 ppm yaitu NC01, NC02, NC03, NC05, NC06, NC07, NC08, NC09,
NC10, dan NC11. Hasil penapisan aktivitas antibakteri didapatkan 5 isolat yaitu
NC01, NC03, NC04 NC07 dan NC10 dapat menghambat pertumbuhan bakteri
patogen dengan diameter zona hambat > 10 mm. Berdasarkan hasil penapisan,
dapat disimpulkan bahwa ekstrak etil asetat jamur simbiosis laut sponge N.
chaliniformis merupakan sumber potensial untuk memproduksi senyawa
antikanker dan antibakteri.
Jurnal acuan:
Handayani D, Artasasta MA. 2017. Antibacterial and cytotoxic activities
screening of symbiotic fungi extract isolated from marine sponge Neopetrosia
chaliniformis AR-01. Journal of Applied Pharmaceutical Science. 7(5):66-
69. doi: 10.7324/JAPS.2017.70512

Referensi:
Amagata T, Tanaka M, Yamada T, Chen YP, Minoura K, and Numata A.
Additional cytotoxic substances isolated from the sponge-derived
Gymnascella dankaliensis. Tetrahedron Lett, 2013; 54:5960-5962.
Bhadury P, Mohammad BT, and Wright PC. The current status of natural
products from marine fungi and their potential as anti-infective agents. J. Ind.
Microbiol. Biotechnol, 2006; 33:325–337. Bright M and Bulgheresi S. A
Complex Journey: Transmission of Microbial Symbionts. Nature Reviews
(Microbiology), 2010; 8:219-230.
Brigitte G. Kompendium der Medizinschen Mykologi. 1980, BerlinHamburg.
Verlag Paul Parey. Gomes NGM, Lefranc F, Kijjoa A and Kiss R. Can Some
MarineDerived Fungal Metabolites Become Actual Anticancer Agents?
Marine Drugs, 2015; 13:3950-3991.
Handayani D, Ahdinur RF, Rustini R. Antimicrobial Activity of Endophytic
Fungi from Marine Sponge Haliclona fascigera. Journal of App Pharm Sci,
2015a; 5: 154-156.
Handayani D, Sandrawaty N, Murniati M, and Regina,R. Screening of Endophytic
Bacteria Isolated from Marine Sponge Haliclona fascigera for Inhibition
against Clinical Isolates of Methicillin Resistant Staphylococcus aureus
(MRSA). J. App Pharm Sci, 2015b; 5(9): 139-142.
Handayani D, Murniati M and Rustini R. In Vitro Inhibitory Activity of Ethyl
Acetat Extract of Symbiotic Bacteria Isolated from Marine Sponge Haliclona
fascigera against Multidrug Resistant Organism (MDRO). J App Pharm Sci,
2016a; 6 (11): 218-222.
Handayani D, Ornando R, ,Rustini. Antimicrobial activity screening of symbiotic
fungi from marine sponge Petrosia nigrans collected from south coast of
West Sumatera, Indonesia. International Journal of Pharmacognosy and
Phytochemical Research, 2016b; 8(4): 623-626.
Henriquez M, Vergara K, Norambuena J, Beiza A, Maza F, Ubilla P, Araya I,
Chavez R, Martin AS, Darias J, Darias MJ, and Vaca I. Diversity of
Cultivable Fungi Associated With Antartic Marine Sponges and Screening
for their Antimicrobial, Antitumorial and Antioxidant Potential. World J.
Microbiol Biotechnol, 2013; 30: 65-76.
Hentschel U, Hopke J, Horn M, Friederich AB, Wagner M, Hacker J, and Moore
BS. Molecular Evidance for a Uniform Microbial Community in Sponges
from Diffrent Oceans. Applied and Environmental Microbiology, 2002; 68:
4432-4440.
Hentschel U, Piel J, Degnan SM, and Taylor MW. Genomic Insights Into the
Marine Sponge Microbiome. Nature Review Microbiology, 2012; 10(9):61-
654.
Kjer J, Debbab A, Aly AH, dan Proksch, P. Methods for isolation of marine-
derived endophytic fungi and their bioactive secondary products. Nature
Protocols, 2010; 5:479-490.
Lee YM, Li H, Hong J, Cho HY, Bae KS, Kim MA, Kim DK, and Jung JH.
Bioactive Metabolites from the Sponge-Derived Fungus Aspergillus
versicolor. Archives of Pharmacal Research, 2010; 33:231-235.
Meyer BN, Figni NR, Putman JE, Jacobsen DE, Nichols DE, and Mc-Laughlin
JL. Brine shrimp: A convient general bioassay for active plant constituents.
Planta Medica,1982; 45:31-34.
Proksch P, Edrada RA, and Ebel R. Drugs from the Seas - Current Status and
Microbiological Implications. Appl Microbiol Biotechnol, 2002; 59:125-134.
Qaralleh H. Chemical and Bioactive Diversites of Marine Sponge Neopetrosia. A
Journal of the Bangladesh Pharmacological Society, 2016; 11:433-452.
Qi J, Shao CL, Li ZY, Gan LS, Fu XM, Bian WT, Zhao HY, and Wang CY.
Isocoumarine Derivates and Benzofurans from a Sponge-Derived Pencillium
sp. Fungus. Journal of Natural Products, 2013; 76(4):571-9.
Rateb ME, and Ebel R. Secondary Metabolites of Fungi from Marine Habitats.
Nat. Prod. Rep, 2011; 28: 290–344.
Tiwari P, Kumar B, Kaur M, Kaur G., and Kaur H. Phytochemical screening and
Extraction: A Review, Internationale Pharmaceutica Sciencia, 2011; 1(1): 98-
106.
Vallabhapurapu S, Karin M. Regulation and Function of NF-kB Transcription
Factor in Immune System. Annu. Rev. Immunol, 2009; 27:693- 733.
Vasanthabharathi V, and Jayalakshmi S. Bioactive potential of symbiotic bacteria
and fungi from marine sponges. African Journal of Biotechnology, 2011;
11:7500-7511.
Webster NS, and Taylor M. Marine Sponges And Their Microbial Symbionts :
Love And Other Relationships. Environmental Microbiology, 2012; 14:335-
346.
Wilkinson CR. Net primary productivity in coral reef sponges. Science, 1983;
219: 410-412.
Zhang G, Wu G, Zhu T, Kurtain T, Mandi A, Jiao J, Li J, Qi X, Gu Q, and Li D.
Meroterpenoids with diverse ring systems from the spongeassociated fungus
Alternaria sp. JJy-32. Journal of Natural Products, 2013; Doi :
10.1021/np4005757.
Zhou Y, Debbab A, Wray V, Lin W, Schulz B, Trepos R, Pile C, Hellio C,
Proksch P, and Aly AH. Marine Bacterial Inhibitors from the Sponge-
Derived Fungus Aspergillus sp. Tetrahedron Letters, 2014; 56:2789- 2792