PRAKTIKUM V
ISOLASI MIKROORGANISME
Kelompok : 6A
I. Tujuan
Setelah mengikuti praktikum ini, mahasiswa diharapkan dapat:
1. Mengisolasi mikroorganisme terutama bakteri dan fungi dari beberapa
sumber isolasi.
2. Mengetahui mikroorganisme yang terdapat dalam sumber isolasi.
II. Pendahuluan
Mikroba ada yang bermanfaat dan ada yang merugikan yang bersifat
patogen. Mikroba yang bermanfaat dan mikroba yang merugikan untuk
membedakannya tentu sulit, mengingat mikroba tersebut dalam bentuk
populasi campuran. Hal ini dapat diatasi dengan proses identifikasi antara
mikroba bermanfaat dan mikroba yang merugikan dapat melalui pemisahan
populasi campuran dari lingkungannya. Pemisahan ini lebih dikenal dengan
nama isolasi mikroba. Pengamatan mikroba hanya dapat dilakukan jika
mikroba yang diamati di isolasi di tempat-tempat tertentu sehingga mereka
mudah diamati. Pengamatan terhadap mikroba tertentu hanya dapat dilakukan
jika mikroba dipisahkan dari lingkungan dan mikroba lainnya. Ini bisa
dilakukan dengan teknik isolasi (Badaring dkk., 2020).
Menurut Jufri (2020), beberapa faktor yang perlu dipertimbangkan dalam
melakukan isolasi mikroba antara lain: sifat setiap jenis mikroba yang akan
diisolasi, tempat hidup atau asal mikroba, media pertumbuhan yang tepat, cara
menginokulasi mikroba, bagaimana cara menetaskan mikroba, cara menguji
bahwa mikroba yang terisolasi telah dalam bentuk kultur murni dan sesuai
dengan apa yang dimaksudkan, bagaimana mempertahankan bahwa mikroba
yang telah diisolasi tetap murni kultur.
Prinsip dari isolasi mikroba adalah memisahkan satu jenis mikroba dengan
mikroba lain yang berasal dari campuran bermacam-macam mikroba. Hal ini
dapat dilakukan dengan menumbuhkannya dalam media padat, sel-sel
mikroba akan membentuk koloni sel yang tetap pada tempatnya. Beberapa
cara atau metode untuk memperoleh biakan murni dari suatu biakan
campuran. Dua diantaranya yang paling sering digunakan adalah metode
cawan gores dan metode cawan tuang. Yang didasarkan pada prinsip
pengenceran dengan maksud untuk memperoleh spesies individu. Dengan
anggapan bahwa setiap koloni dapat terpisah dari satu jenis sel yang dapat
diamati (Afrianto, 2004 dalam Sabbathini dkk., 2017).
Ada beberapa teknik isolasi mikroba (Stolp dan Starr, 1981 dalam Moenir
dkk., 2016):
1. Spread plate (Agar Tabur Ulas)
Spread plate adalah teknik menanam dengan menyebarkan suspensi
bakteri di permukaan agar, agar diperoleh kultur murni. Pada spread plate
diteteskannya bakteri sebanyak 0,1 ml karena bertujuan untuk
menumbuhkan dipermukaan saja.
2. Pour plate (Agar Tuang)
Teknik ini memerlukan agar yang belum padat dan dituang bersama
suspensi bakteri ke dalam cawan petri dan dihomogenkan lalu dibiarkan
memadat. Hal ini akan menyebabkan sel-sel bakteri tidak hanya terdapat
pada permukaan agar saja tapi juga di dalam atau dasar agar sehingga bisa
diketahui sel yang dapat tumbuh di permukaan agar yang kaya O2 dan di
dalam agar yang tidak banyak begitu banyak mengandung O2. Pada pour
plate diteteskan sebanyak 1 ml karena membutuhkan ruang yang lebih luas
untuk penyebarannya sehingga diberikan lebih banyak dari pada spread
plate.
3. Teknik Penanaman dengan Goresan (Streak)
Bertujuan untuk mengisolasi mikroorganisme dari campurannya atau
meremajakan kultur ke dalam medium baru.
4. Goresan Sinambung
Goresan sinambung umumnya digunakan bukan untuk mendapatkan
koloni tunggal, melainkan untuk peremajaan ke cawan atau medium baru.
5. Goresan T
Prosedur kerjanya adalah petridish dibagi menjadi 3 bagian menggunakan
spidol dan daerah tersebut diinokulasi dengan streak zig-zag. Ose
dipanaskan dan didinginkan, lalu distreak zig-zag pada daerah berikutnya.
6. Goresan Kuadran (Streak Quadrant)
Hampir sama dengan goresan T, namun berpola goresan yang berbeda
yaitu dibagi empat. Daerah 1 merupakan goresan awal sehingga masih
mengandung banyak sel mikroorganisma. Goresan selanjutnya
dipotongkan atau disilangkan dari goresan pertama sehingga jumlah
semakin sedikit dan akhirnya terpisah-pisah menjadi koloni tunggal.
VI. Pembahasan
Praktikum kali ini bertujuan agar dapat mengisolasi mikroorganisme
terutama bakteri dan fungi dari beberapa sumber isolasi serta dapat
mengetahui mikroorganisme yang terdapat dalam sumber isolasi. Isolasi
bakteri merupakan proses pengambilan bakteri dari medium atau lingkungan
asalnya dan menumbuhkan pada medium buatan sehingga diperoleh kultur
murni atau biakan murni hasil isolasi (Fitriana dkk., 2016). Mikroorganisme
bakteri pada suatu lingkungan alami merupakan populasi campuran dari
berbagai jenis, baik mikroorganisme pada tanah, air, udara, makanan, maupun
yang terdapat pada tubuh hewan maupun tumbuhan. Pemisahan bakteri
diperlukan untuk mengetahui jenis, mempelajari kultural, morfologi, fisiologi,
dan karakteristik. Berdasarkan pengertiannya, isolasi bakteri memiliki prinsip
memisahkan satu jenis mikroba dengan mikroba lain yang berasal dari
campuran bermacam-macam mikroba. Hal ini dapat dilakukan dengan
menumbuhkannya dalam media padat, sel-sel mikroba akan membentuk
koloni sel yang tetap pada tempatnya (Sabbathini dkk., 2017).
Ada beberapa teknik isolasi mikroba (Stolp dan Starr, 1981 dalam Moenir
dkk., 2016):
1. Spread plate (Agar Tabur Ulas)
Spread plate adalah teknik menanam dengan menyebarkan suspensi
bakteri di permukaan agar, agar diperoleh kultur murni. Pada spread plate
diteteskannya bakteri sebanyak 0,1 ml karena bertujuan untuk
menumbuhkan dipermukaan saja. Spread plate juga didefinisikan sebagai
suatu teknik di dalam menumbuhkan mikroorganisme di dalam media agar
dengan cara cepat menuangkan stok kultur bakteri di atas media yang telah
padat. Keunggulan metode cawan sebar dapat digunakan untuk
memperkirakan jumlah bakteri dalam satu sel sedangkan kekurangan
metode cawan sebar, yaitu cukup sulit terutama saat meratakan suspensi
dengan batang bengkok, untuk menumbuhkan koloni secara merata,
biakan justru terkontaminasi (Damayanti dkk., 2020).
2. Pour plate (Agar Tuang)
Teknik ini memerlukan agar yang belum padat dan dituang bersama
suspensi bakteri ke dalam cawan petri dan dihomogenkan lalu dibiarkan
memadat. Hal ini akan menyebabkan sel-sel bakteri tidak hanya terdapat
pada permukaan agar saja tapi juga di dalam atau dasar agar sehingga bisa
diketahui sel yang dapat tumbuh di permukaan agar yang kaya O2 dan di
dalam agar yang tidak banyak begitu banyak mengandung O2. Pada pour
plate diteteskan sebanyak 1 ml karena membutuhkan ruang yang lebih luas
untuk penyebarannya sehingga diberikan lebih banyak dari pada spread
plate. Dalam metode ini diperlukan pengenceran sebelum ditumbuhkan
pada medium agar di dalam cawan petri. Keunggulan metode tuang adalah
dapat digunakan untuk memperoleh biakan murni sedangkan kekurangan
pada metode cawan tuang adalah hasil perhitungan tidak menunjukkan
jumlah sel mikroba yang sebenarnya karena beberapa sel yang berdekatan
mungkin membentuk satu koloni, mikroba yang ditumbuhkan harus dapat
tumbuh pada medium padat dan membentuk koloni yang kompak dan
jelas, tidak menjalar, memerlukan persiapan dan waktu inkubasi sehingga
pertumbuhan koloni dapat dihitung (Damayani dkk., 2020).
3. Teknik Penanaman dengan Goresan (Streak)
Bertujuan untuk mengisolasi mikroorganisme dari campurannya atau
meremajakan kultur ke dalam medium baru. Cara gores umumnya
digunakan untuk mengisolasi koloni mikroba pada medium-agar sehingga
didapatkan koloni terpisah dan merupakan biakan murni. Cara ini dasarnya
ialah menggoreskan suspensi bahan yang mengandung mikroba pada
permukaan medium-agar yang sesuai pada cawan petri. Setelah inkubasi
maka pada bekas goresan akan tumbuh koloni-koloni terpisah yang
mungkin berasal dari 1 sel mikroba, sehingga dapat dikultur lebih lanjut.
Penggoresan yang sempurna akan menghasilkan koloni yang terpisah.
Bakteri yang memiliki flagella seringkali membentuk koloni yang
menyebar terutama bila digunakan medium yang basah. Pencegahan
terjadinya penyebaran koloni harus digunakan lempengan agar yang
benar-benar kering permukaannya. Kelebihan metode streak plate adalah
mikroorganisme yang tumbuh dapat tersebar merata pada bagian
permukaan agar, dapat segera diketahui adanya kontaminasi sedangkan
kekurangannya yaitu sulit dilakukan dan hanya dapat digunakan untuk
menumbuhkan bakteri aerob saja. Tipe goresan dapat dibagi menjadi :
- Goresan Sinambung
Goresan sinambung umumnya digunakan bukan untuk mendapatkan
koloni tunggal, melainkan untuk peremajaan ke cawan atau medium baru.
Umumnya dilakukan dengan cara menyentuhkan ujung ose pada koloni
dan menggoreskan secara kontinyu sampai setengah permukaan agar. Putar
cawan 180o lanjutkan goresan sampai habis. Tipe goresan
sinambung/kontinyu juga dilakukan pada media agar miring dalam tabung
reaksi.
- Goresan T
Prosedur kerjanya adalah petridish dibagi menjadi 3 bagian menggunakan
spidol dan daerah tersebut diinokulasi dengan streak zig-zag. Ose
dipanaskan dan didinginkan, lalu distreak zig-zag pada daerah berikutnya.
Umumnya dilakukan dengan cara menandai bagian luar-bawah cawan
petri dengan membagi cawan menjadi 3 bagian menggunakan spidol
marker, inokulasi daerah 1 dengan streak zig-zag. Panaskan jarum ose dan
tunggu dingin, kemudian lanjutkan streak zig-zag pada daerah 2. Cawan
diputar untuk memperoleh goresan yang sempurna. Lakukan hal yang
sama pada daerah 3.
- Goresan Kuadran (Streak Quadrant)
Hampir sama dengan goresan T, namun berpola goresan yang berbeda
yaitu dibagi empat. Daerah 1 merupakan goresan awal sehingga masih
mengandung banyak sel mikroorganisma. Goresan selanjutnya
dipotongkan atau disilangkan dari goresan pertama sehingga jumlah
semakin sedikit dan akhirnya terpisah-pisah menjadi koloni tunggal. Tipe
goresan kuadran dapat dilakukan dengan menggores secara zig-zag
maupun secara terputus. Umumnya dilakukan dengan cara menandai
bagian luar-bawah cawan petri dengan membagi cawan menjadi 4 bagian
menggunakan spidol marker, inokulasi daerah 1 dengan streak
zig-zag/terputus. Panaskan jarum ose dan tunggu dingin, kemudian
lanjutkan streak pada daerah 2. Cawan diputar untuk memperoleh goresan
yang sempurna. Lakukan hal yang sama pada daerah 3 dan 4.
Pada praktikum ini, isolasi mikroba dilakukan menggunakan 3 teknik yaitu
spread plate, pour plate, dan streak plate. Teknik spread plate merupakan teknik
isolasi mikroba dengan cara menginokulasi kultur mikroba dengan cara dipulas
atau disebar pada permukaan media agar padat. Metode ini dilakukan dengan
mengencerkan biakan kultur mikroba. Teknik pour plate dilakukan dengan
menginokulasi medium agar yang sedang mencair pada temperatur 45-50°C
dengan suspensi bahan yang mengandung mikroba, dan menuangkannya ke
dalam cawan petri steril (Yusmaniar dkk., 2017). Tujuan dari teknik pour plate
yaitu untuk menentukan perkiraan jumlah bakteri hidup dalam cairan atau
specimen. Hasil perhitungan bakteri dinyatakan dalam koloni (Irianto, 2012).
Teknik isolasi koloni bakteri dengan cara streak plate dilakukan dengan cara
menggoreskan suspensi bahan yang mengandung mikroba pada permukaan
media agar padat (Yusmaniar dkk., 2017). Penggoresan bertujuan untuk
membuat garis sebanyak mungkin pada permukaan medium agar bakteri yang
tumbuh pada garis-garis terakhir berupa koloni yang terpisah-pisah (Irianto,
2012).
Alat yang digunakan dalam praktikum ini yaitu jarum ose untuk
menggores pada media untuk memperbesar area pertumbuhan pada metode
streak plate, spidol untuk menandai, cawan petri untuk tempat pertumbuhan
bakteri, inkubator untuk menumbuhkan kultur mikroba, pipet untuk mengambil
media NA ke dalam cawan petri, bunsen untuk mensterilkan alat, serta batang
bengkok untuk meratakan media NA. Bahan yang digunakan dalam praktikum
ini yaitu media NA sebagai media pertumbuhan bakteri. Media NA (Nutrient
Agar) berdasarkan bahan yang digunakan termasuk dalam kelompok media
semi alami, media semi alami merupakan media yang terdiri dari bahan alami
yang ditambahkan dengan senyawa kimia. Berdasarkan kegunaannya media
NA (Nutrient Agar) termasuk ke dalam jenis media umum, karena media ini
merupakan media yang paling umum digunakan untuk pertumbuhan sebagian
besar bakteri. Berdasarkan bentuknya media ini berbentuk padat, karena
mengandung agar sebagai bahan pemadatnya. Media padat biasanya digunakan
untuk mengamati penampilan atau morfologi koloni bakteri (Munandar, 2016).
Media NA (nutrient agar) merupakan media yang berbentuk serbuk berwarna
putih kekuningan dan apabila setelah digunakan akan berbentuk padat karena
terdapat kandungan agar sebagai pemadatnya. Komposisi yang terpenting
dalam media ini adalah karbohidrat dan protein yang terdapat pada ekstrak
daging dan pepton sesuai dengan kebutuhan sebagian besar bakteri (Thohari
dkk., 2019).
Pada ketiga teknik yang digunakan yaitu spread plate, pour plate, dan
streak plate, kultur bakteri diinkubasi pada inkubator selama 3x24 jam. Lama
waktu inkubasi bakteri berbeda dengan jamur. Waktu inkubasi bakteri yang
digunakan dalam peremajaan umumnya adalah 24 jam (Pelczar dan Chan,
2008), sedangkan pada jamur umumnya 5-7 hari (Wijayanti, 2003). Saat kultur
diinkubasi dalam inkubator, cawan petri diposisikan terbalik atau menghadap
ke bawah. Pada pemindahan bakteri di cawan petri setelah agar baru, maka
cawan petri tersebut harus dibalik, hal ini berfungsi untuk menghindari adanya
tetesan air yang mungkin melekat pada dinding tutup cawan petri
(Dwijoseputro, 1987 dalam Handayani dkk., 2016). Inkubasi dilakukan pada
suhu 37°C karena pertumbuhan koloni bakteri pada suhu 37°C jauh lebih baik
dibandingkan pertumbuhan pada suhu kamar (27°C) (Sopiah dan Prayudi,
2002).
Berdasarkan hasil tabel percobaan, menggunakan ketiga teknik isolasi
bakteri, yaitu spread, pour, streak plate didapat hasil yang sama, yaitu bentuk
koloninya yang streptococcus (bulat membentuk rantai), bentuk tepian koloni
entire, warna koloni putih susu, dan bentuk selnya basil. Sampel percobaan
menggunakan bakteri Escherichia coli. E. coli adalah kuman oportunis yang
banyak ditemukan di dalam usus besar manusia sebagai flora normal. Bakteri
aerob ini ditemukan oleh Theodor Escherich pada tahun 1885. Bakteri aerob
mempunyai sifat unik karena dapat menyebabkan infeksi primer pada usus
misalnya diare, dan infeksi pada jaringan tubuh lain diluar usus. Bakteri
Escherichia Coli memiliki ukuran sel dengan panjang 2,0 – 6,0μm dan lebar
1,1-1,5 μm serta berat sel E. coli 2 × 10-12 gram. Bakteri ini berbentuk
batang, lurus, tunggal, berpasangan atau rantai pendek, termasuk gram negatif
yang dapat hidup soliter maupun berkelompok, umumnya motil, tidak
membentuk spora, serta fakultatif anaerob. E. coli tumbuh dengan baik pada
suhu optimal 370C pada media yang mengandung 1% peptone sebagai sumber
karbon dan nitrogen (Carter and Wise, 2004).
Isolasi
Pemurnian
Fitriana, Baharuddin, M., dan Wali, S. 2016. Isolasi dan Identifikasi Bakteri
Pendegradasi Fenol yang Bersumber dari Danau Tempe Kabupaten
Wajo Sulawesi Selatan. Al-Kimia, 4(2) : 33-42.
IX. Lampiran
1. Abstrak jurnal dan bagian yang disitasi
2. Abstrak jurnal case study