2019-2020

DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU
PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR

Diah Ratnadewi

DASAR TEKNIK
KULTUR SEL/JARINGAN TANAMAN
PRAKTIKUM (BIO 305)
DASAR TEKNIK KULTUR SEL/JARINGAN TANAMAN
PRAKTIKUM (BIO 305)

Disusun oleh:

Diah Ratnadewi
Koordinator mata kuliah Kultur Sel & Jaringan
untuk mahasiswa S1 – semester 4 - 6

DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN
ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2019

1
 DASAR TEKNIK KULTUR JARINGAN TANAMAN
PRAKTIKUM (BIO 305/542)

TEKNIK ASEPTIK

Memelihara kondisi aseptik sangat penting untuk mendapatkan hasil yang

memuaskan dalam kultur jaringan. Untuk mencapai keadaan aseptik perlu diperhatikan
empat macam kegiatan:

1. Sterilisasi alat-alat gelas, instrumen, media dan bahan kimia. Sterilisasi dapat dilakukan
dengan beberapa cara. Yang paling banyak dipergunakan adalah dengan autoklaf,
pemanasan kering dalam oven, penyaringan, dan sterilisasi dengan bahan kimia. Untuk
memilih mana yang akan dipergunakan, perlu di pertimbangkan sifat bahan yang akan
disterilkan.

2. Ruang kerja yang memadai. Yang terpenting adalah ruangan untuk pemindahan bahan
tanaman ke dalam medium. Ruang ini dapat berupa ruangan sederhana seperti kotak
pemindahan atau yang istimewa berupa kotak atau kamar yang dilengkapi dengan
“laminar air flow cabinet atau LAFC”. Tujuan penggunaan ruang kerja semacam ini
adalah untuk mengurangi kontaminasi yang berasal dari udara saat mengerjakan kultur
atau pemindahan kultur.

3. Teknik manipulasi dan cara kerja pelaksana. Ini mungkin merupakan sumber
kontaminasi paling umum dalam laboratorium. Aliran udara yang berasal dari
pernapasan dan pembicaraan, debu atau partikel lain yang terhambur dari tubuh
pelaksana, atau bahan yang tersentuh oleh pelaksana, dapat mengakibatkan kontaminasi.

4. Bahan tanaman dan eksplan yang disterilisasi dengan baik untuk kultur baru. Berbagai
bahan pensteril dapat digunakan untuk mendapatkan kultur yang aseptik. Yang perlu
diwaspadai adalah mikroorganisme yang telah menginfeksi jaringan dalam eksplan:
kontaminasi kultur terjadi setelah beberapa minggu karena mikroba tersebut hidup
dalam ruang antar sel bahan tanaman.

PROSEDUR UMUM PEMBUATAN MEDIA

1. Kecuali kalau ditentukan lain, untuk pembuatan media biasanya digunakan bahan
kimia murni ”reagent grade”.

2. Tahapan pembuatan media dilakukan dengan cermat sesuai dengan pedoman

pembuatan larutan baku atau medium yang bersangkutan.

3. Dalam pembuatan larutan baku, perlu dicatat bobot dan volume setiap bahan yang
dipergunakan pada botolnya.

2
 4. Pada botol larutan baku perlu juga dicatat tanggal terakhir pembuatannya.

Cara mempersiapkan larutan baku

Untuk memudahkan pembuatan medium kultur dan takaran unsur-unsurnya lebih

teliti, sebagian besar komponen medium disiapkan dalam bentuk larutan baku. Hanya
sukrosa, agar dan beberapa komponen tambahan tidak dibuat larutan bakunya, tetapi
ditimbang atau diukur secukupnya dan ditambahkan langsung ke dalam campuran untuk
pembuatan medium.

1. Garam anorganik. Larutan baku hara makro biasanya dibuat dengan konsentrasi 100 x
atau 200 x konsentrasinya dalam medium. Setiap garam hara makro dibuat larutan
bakunya sendiri-sendiri secara terpisah. Larutan baku hara mikro dibuat dengan
konsentrasi 1000 x konsentrasinya dalam medium. Kecuali Fe dan kadang-kadang KI,
garam-garam mikro biasanya dibuat menjadi satu larutan baku.

2. Vitamin. Larutan baku vitamin biasa dibuat dengan konsentrasi 100-200 x

konsentrasinya dalam medium. Setiap vitamin dibuat larutan bakunya secara terpisah.

3. Zat Tumbuh. Auksin dan sitokinin sintetik masing-masing dibuat larutan bakunya
dengan konsentrasi 100-1000 x konsentrasinya dalam medium.. Untuk memudahkan
pelarutan seringkali dipergunakan beberapa mililiter etanol atau larutan basa atau asam,
atau pemanasan. Cek lebih dulu, kelarutan terbesarnya di dalam pelarut apa.

4. Suplemen organik. Beberapa kultur jaringan membutuhkan suplemen organik untuk

mendapatkan pertumbuhan yang memuaskan. Misalnya: kasein hidrolisat, ekstrak ragi,
air kelapa dan lain-lain. Air kelapa diambil dari kelapa yang telah cukup masak tapi
kulitnya masih berwarna hijau. Air kelapa mula-mula dipanaskan sampai suhu 80ºC
sambil diaduk-aduk, disaring dan disimpan dalam labu Erlenmeyer dalam keadaan beku
sampai digunakan.

Untuk menjaga agar jangan sampai terjadi perubahan dalam bahan yang ada dalam
larutan baku, larutan-larutan tersebut disimpan dalam kulkas  suhu + 4ºC).

3
 Tabel 1. Larutan baku untuk medium Murashige & Skoog (MS)

Bahan Konsentrasi
A. Garam-garam Anorganik
1. NH4NO3 16.50 g/100 mL
2. KNO3 19.00 g/100 mL
3. MgSO4. 7 H2O 7.40 g/100 mL
4. KH2PO4 3.40 g/100 mL
5. CaCl. 2 H2O 8.80 g/100 mL
6. Fe EDTA
a. FeSO4 7 H2O 1.392 g/100 mL
b. Na2EDTA. 2 H2O 1.862 g/100 mL

7. Larutan hara mikro

a. KI 83 )
b. H3BO3 620 )
c. MnSO4. 4 H2O 2230 )
d. ZnSO4. 7 H2O 860 ) mg/100 mL
e. Na2MoO4. 2 H2O 25 )
f. CuSO4. 5 H2O 2.5 )
g. CoCl2. 6 H2O 2.5 )

B. Vitamin
1. Asam nikotinat 100 mg/100mL
2. Piridoksin HCl 100 mg/100mL
3. Tiamin HCl 100 mg/100 mL
4. Mio-Inositol 100 mg/L, ditimbang langsung

C. Zat pengatur tumbuh

1. IAA 100 mg/100 mL
2. Kinetin 100 mg/100 mL

D. Asam amino
1. Glisin 200 mg/100 mL

4
 Tabel 2. Komposisi medium Murashige dan Skoog

Bahan/larutan baku mg/L mL larutan baku /

L media

1.. NH4NO3 1650 10

2. KNO3 1900 10
3. MgSO4. 7 H2O 370 5
4. KH2PO4 170 5
5. CaCl. 2 H2O 440 5
6. Fe EDTA
a. FeSO4 7 H2O 27.85)
b. Na2EDTA. 2 H2O 37.25) 2

7. Hara mikro
a. KI 0.83 )
b. H3BO3 6.2 )
c. MnSO4. 4 H2O 22.3 )
d. ZnSO4. 7 H2O 8.6 ) 1
e. Na2MoO4. 2 H2O 0.25 )
f. CuSO4. 5 H2O 0.025 )
g. CoCl2. 6 H2O 0.025 )

8. Sukrosa 30 000 30 g
9. Inositol 100 100 mg
10. Nicotinic acid 0.5 0.5
11. Pyridoxine HCl 0.5 0.5
12. Thiamine HCl 0.1 0.1
13. Glycine 2.0 1
14. IAA
15. Kinetin

5
 Cara membuat medium Murashige dan Skoog (MS)

1. Larutan baku dikeluarkan dari kulkas.

2. Labu ukur 1 liter diisi sepertiganya dengan aquades/air destilata.
3. Satu persatu larutan baku ditambahkan ke dalam labu ukur sebanyak yang tercantum
pada Tabel 2. Campuran diaduk dengan saksama setiap kali setelah penambahan
suatu larutan baku.
4. Timbang sukrosa dan bahan lainnya yang tidak tersedia dalam larutan baku, sebanyak
yang tercantum dalam Tabel 2 atau sesuai keperluan. dan ditambahkan ke dalam labu
ukur tersebut; kemudian diaduk dengan saksama sampai larut seluruhnya.
5. Tambahkan aquades secukupnya sampai volume total mencapai 1 liter. Untuk
medium yang diberi suplemen air kelapa, cairan ini ditambahkan terlebih dahulu
sebanyak yang diperlukan, kemudian disusul dengan penambahan aquades sampai
volume 1 liter.
6. Campuran dipindahkan ke dalam Erlenmeyer besar. Sambil diaduk berikan setetes
demi setetes larutan KOH 1N atau HCl 1N hingga tercapai pH 5,6-5,8. Untuk
mengukur nilai pH campuran, gunakan metode kolorimetrik atau gunakan pH meter.
7. Untuk membuat medium padat, setelah campuran medium diukur pH-nya, tambahkan
agar 6-8 g/L medium dan aduk sampai merata. Panaskan sampai mendidih, sambil
diaduk.
8. Tuangkan medium ke dalam tabung atau botol kultur sebanyak yang diperlukan (kira-
kira seperlima dari kapasitas tabung) dan tabung/botol ditutup dengan alumunium foil
atau kertas mika atau plastik tahan autoklaf.
9. Sterilkan dalam autoklaf:
a. Media 25-50 mL: 20 menit, pada suhu 121ºC, tekanan 15 psi.
b. Media kurang dari 200 ml: 25 menit pada suhu 121ºC, tekanan 15 psi
c. Media dari 200-1000 ml: 30 menit pada suhu 121ºC, tekanan 15 psi
10. Setelah media diautoklaf, dinginkan di suhu ruang, dan perbaiki/perketat tutup
botol/tabungnya.
11. Simpan media dalam lemari di ruang khusus sampai saatnya diperlukan untuk
digunakan.
12. Bila ada komponen yang perlu disterilkan dengan filter, ikuti pedoman khusus untuk
itu.

6
 CARA MEMPERSIAPKAN DAN BEKERJA DI DALAM
LAMINAR AIRFLOW CABINET (LAFC)

1. Seka meja dan dinding-dinding LAFC dengan tisu dan alkohol 70 %.

2. Siapkan 1 botol kecil berisi alkohol 98 % yang ditutup rapat dengan Al-foil, beberapa
cawan petri steril, kotak stainless steel berisi pinset, pisau scalpel dll., dan media
kultur di dalam LAFC.
3. Nyalakan lampu UV selama minimum 15 menit. Ingat, pintu LAFC harus dalam
keadaan tertutup rapat. Sementara itu, siapkan larutan sterilan dan bahan lainnya.
4. Setelah lampu UV dimatikan, nyalakan lampu neon dan blower; pintu LAFC dapat
dibuka atau dibuka sebagian namun tidak menyebabkan turbulensi aliran udara di
dalamnya.
5. Persiapkan pinset, pisau scalpel, gunting dan alat lain yang akan diperlukan untuk
membuat kultur dengan cara mencelupkannya ke dalam botol berisi alkohol 98 %
tersebut, lalu dibakar dengan api bunsen. Letakkan alat-alat tersebut di tempat yang
steril. Lakukan sterilisasi alat ini sebanyak 3-4 kali, lalu biarkan mendingin.
6. Sterilisasi eksplan dilakukan di dalam LAFC. Jaga kebersihan dan keaseptikan di
dalam LAFC selama bekerja.
7. Pisau, pinset dll. digunakan hanya setelah tidak panas lagi. Karena itu, pencelupan
dalam alkohol dan pembakarannya dilakukan segera SETELAH digunakan, dan
bukan sebelumnya. Bila perlu tunggu hingga alat-alat tersebut tidak panas.
8. Cawan petri, botol larutan sterilan, botol media selalu dalam keadaan tertutup.
Upayakan bekerja secepat mungkin ketika harus membukanya dan dekatkan pada
nyala api.
9. Tutup rapat botol media setelah eksplan ditanam. Lembar plastik/Al foil penutup tidak
boleh bergelombang atau terlipat-lipat yang dapat menjadi lubang masuknya
mikroorganisme.
10. Setelah pekerjaan selesai, keluarkan semua bahan dan peralatan dari dalam LAFC,
lalu semprot dengan alkohol 70 % dan diseka dengan tisu hingga bersih kembali.
11. Matikan lampu dan blower, dan tutuplah LAFC dengan baik.

CARA STERILISASI EKSPLAN

Pekerjaan sterilisasi eksplan dilakukan di dalam Laminar Airflow Cabinet (LAFC) yang
sudah disiapkan agar aseptik.

Bahan sterilan hendaknya berupa larutan yang baru dibuat agar efektif. Selama sterilisasi,
pengocokan secara manual perlu sering dilakukan agar proses sterilisasi berlangsung lebih
saksama.

7
 Beberapa Contoh Sterilisasi Eksplan

Biji tembakau/biji jeruk/bulir padi:

1. Cuci biji tembakau dengan air bersih/kran. Tiriskan. Biji jeruk dan bulir padi
langsung dikupas kulitnya.
2. Di dalam LAFC, sterilisasi dalam alkohol 70 % selama 30 detik.
3. Lalu pindahkan ke dalam larutan Bayclin (NaClO 5.25 %) 10-20 % selama 5-20
menit. Masing-masing larutan ditambah 1-2 tetes Tween 80 %.
4. Bilas 3 x dengan akuades steril.
5. Tiriskan secara aseptik, dan siap ditanam dalam medium.

Batang jarak pagar/daun tembakau (bahan tanaman sedikit berbulu):

1. Cuci bahan tanaman secara saksama dengan sabun dan dibilas bersih dengan air
kran. Tiriskan.
2. Potong menjadi besaran tertentu agar seluruh jaringan nantinya terendam dalam
larutan sterilan.
3. Lakukan di dalam LAFC: Sterilisasi dengan larutan fungisida Dithane M-45 2 g/l
dan bakterisida Agrept 2 g/l masing-masing selama 30 menit. Lalu bilas dengan
akuades steril 1 x.
4. Pindahkan ke dalam alkohol 70 % selama 30 detik.
5. Selanjutnya ke dalam larutan Bayclin 10 % + 2 tetes Tween 80% selama 15
menit.
6. Bilas lagi 3 x dengan akuades steril.
7. Tiriskan secara aseptik, dan bahan siap digunakan sebagai eksplan.

KULTUR BAWANG PUTIH

Bahan eksplan:
1. Stem disk (dasar siung bawang putih, setebal 2 mm)
2. Tunas muda di dalam siung.

Sterilisasi eksplan:
Siung disterilisasi dalam benlate 2 g/L selama 10 menit, bilas dengan akuades steril. Lalu
direndam dalam alkohol 70% selama 2 menit, bilas lagi dengan akuades steril 3 kali.

Media kultur: Media B5 (Gamborg) + vitamin, NAA 0,5 mg/L dan 2 taraf 2-iP (atau BAP): 2
dan 4 mg/L, Sukrosa 3%, agar 7 g/L. pH 5,7.

Cara menanam, setelah disterilisasi:

1. Stem disk dibagi 2 bagian. Ditanam di 1 media dengan posisi atas/bawah berlawanan
(ditunjukkan oleh asisten)

8
 2. Belah siung secara hati-hati sehingga tunas di dalam siung tidak rusak. Lalu tunas
tersebut dibagi 2 bagian secara membujur. Keduanya ditanam di media yang sama.

Pengamatan:
Pertumbuhan tunas dan perakaran (jumlah tunas, jumlah akar, atau kalus yang tumbuh)
selama 4 minggu.

Tabel 3. Media B5 (Gamborg)

No Nama bahan Konsentrasi mg/L

1 KNO3 2 500
2 (NH4)2SO4 134
3 CaCl2 2 H2O 150
4 MgSO4.7H2O 246
5 NaH2PO4.H2O 130.5
6 MnSO4.H2O 10
7 H3BO3 3
8 KI 0.75
9 Na2MoO.2H2O 0.25
10 ZnSO4.7H2O 2
11 CuSO4.5H2O 0.025
12 CoCl2.6H2O 0.025
13 FeSO4.7H2O 27.80
14 NaEDTA.2H2O 37.30
15 Mio-inositol 100
16 Tiamin-HCl 10
17 Piridoksin HCl 1
18 Asam nikotinat 1
19 Sukrosa 20 000

9
 ORGANOGENESIS DARI KOTILEDON SEMANGKA

Bahan tanaman:
Biji semangka direndam dalam air selama 4-15 jam, dipotong ujungnya yang berlawanan
dengan letak embrio dengan skalpel. Lalu dikecambahkan secara aseptik dalam media in
vitro.

Sterilisasi biji yang telah dilukai tersebut dalam Bayclin 5% (NaOCl 5.25%) + 2 tetes Tween
80 selama 25 menit. Bilas dengan akuades steril 3 x.
Tanam dalam media ¼ MS tanpa ZPT.

Percobaan 1. Perbedaan potensial regenerasi pada beberapa bagian jaringan kotiledon

Prosedur:
1. Ambil kecambah semangka dari botol kultur secara aseptik.
2. Letakkan dalam cawan Petri, dan pisahkan kotiledonnya tanpa mengikutsertakan
apeks.
3. Potong kotiledon menjadi 4 bagian secara melintang.
4. Tanam ke-4 eksplan dalam 1 media kultur; bagian abaxial menyentuh media.
5. Amati pertumbuhannya hingga 4 minggu.
6. Pindahkan planlet yang muncul ke media pembesaran, dan amati hingga 4 minggu.
7. Planlet dengan tinggi minimum 2 cm dipindahkan ke media perakaran.
8. Amati tumbuhnya akar pada 10 dan 21 hari. Planlet dengan akar sepanjang min. 1 cm
siap dipindahkan ke fase aklimatisasi.

Media: MS dasar
1. Media perkecambahan: ¼ MS dasar + 30 g/L sukrosa, tanpa ZPT
2. Media regenerasi: MS dasar + 30 g/L sukrosa + 1.25 mg/L BA.
3. Media pemanjangan: MS dasar + 30 g/L sukrosa, tanpa ZPT.
4. Media perakaran: MS dasar + 20 g/L sukrosa + IBA 0.2 mg/L.

Percobaan II. Efek genotipe tanaman semangka pada kemampuan kotiledonnya

membentuk tunas.

Prosedur:
1. Ikuti butir 1 dan 2 di atas.
2. Potong bagian basal kotiledon (bagian yg dekat dengan tangkai) dan gunakan sebagai
eksplan.
3. Amati kultur pada hari ke 9 sampai 12 di bawah mikroskop stereo. Beberapa mungkin
sudah menumbuhkan kuncup-kuncup adventif pada pinggiran eksplan.
4. Pada minggu ke 4 hitung jumlah tunas dan kuncup per eksplan dari setiap genotipe.
5. Setelah itu ikuti butir 4 – 6 di atas.

10
 ORGANOGENESIS LANGSUNG DARI DAUN KRISAN

Bahan eksplan:
Daun muda, panjang 2-5 cm. Diambil bagian jaringan tulang daun, 0.5 – 1 cm2.
Letakkan pada posisi sisi bawah daun (abaxial) menempel pada media.

Media dasar per liter:

MS + sukrosa 30 g, mio inositol 1 g, tiamin-HCl 5 mg, agar 8 g. pH 5.7

Percobaan I. Jenis genotype dalam kemampuan meregenerasikan tajuk dan akar

Bahan tanaman: 2-3 genotipe tanaman krisan.

Media untuk pertunasan (2 minggu), masing-masing 4 botol kultur per mahasiswa.

1. Media dasar MS (di atas) + BA 0.25 mg/L (1 µM) + IAA 2 mg/L (11.5 µM).
2. Media dasar MS + 2 mg/L IAA
3. Media dasar MS + 0.25 mg/L BA
4. Media dasar MS tanpa ZPT

Media untuk pemanjangan batang dan perakaran (3 minggu)

1. Media dasar MS tanpa ZPT

Percobaan II. Efek ZPT pada pembentukan tunas dan akar

Bahan tanaman s.d.a.

Media: Media dasar MS + IAA 2 mg/L + sitokinin (0, 0.5, 1 mg/L)

Jenis sitokinin: BAP, kinetin, TDZ

Setelah 2 minggu dalam media inisiasi, dipindahkan ke medium pembesaran/perakaran (MS

dasar tanpa ZPT) untuk selama 3 minggu.

Pengamatan pada minggu ke-5: tunas dan akar.

11