DISERTASI DITERBITKAN

UNTUK SEMINAR
HASIL PENELITIAN

PENGARUH FORMULASI NANOKRISTAL ASAM USNAT TERHADAP

EKSPRESI MATRIX METALLOPROTEINASE-13 DAN KOLAGEN
TIPE 2 PADA KELINCI OSTEOARTRITIS SERTA ANALISIS
NANOKRISTAL ASAM USNAT DALAM PLASMA DARAH

Suatu Penelitian Eksperimental Murni Laboratorium

Oleh

RINA WAHYUNI
NIM. 1530312015

PROGRAM STUDI ILMU BIOMEDIS PROGRAM DOKTOR

FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS ANDALAS
PADANG
2022
PENGARUH FORMULASI NANOKRISTAL ASAM USNAT TERHADAP
EKSPRESI MATRIX METALLOPROTEINASE-13 DAN KOLAGEN
TIPE 2 PADA KELINCI OSTEOARTRITIS SERTA ANALISIS
NANOKRISTAL ASAM USNAT DALAM PLASMA DARAH

PENELITIAN DISERTASI

Sebagai Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Doktor

Program Pasca Sarjana
Fakultas Kedokteran Universitas Andalas

Oleh

RINA WAHYUNI
NIM. 1530312015

PROGRAM STUDI ILMU BIOMEDIS PROGRAM DOKTOR

FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS ANDALAS
PADANG
2022
 LEMBAR PERNYATAAN

Saya yang bertanda tangan dibawah ini:

Nama : apt. Rina Wahyuni, M.Farm

NIM : 1530312015

Dengan ini menyatakan bahwa disertasi saya yang akan diuji pada Seminar Hasil

Penelitia yang berjudul “PENGARUH FORMULASI NANOKRISTAL ASAM

USNAT TERHADAP EKSPRESI MATRIX METALLOPROTEINASE-13 DAN

KOLAGEN TIPE 2 PADA KELINCI OSTEOARTRITIS SERTA ANALISIS

NANOKRISTAL ASAM USNAT DALAM PLASMA DARAH” adalah hasil karya

cipta saya sendiri. Apabila kemudian hari ternyata pernyataan ini tidak benar, maka

saya siap menanggung konsekuensi sesuai dengan ketentuan dan perundangan yang

berlaku.

Demikian pernyataan ini saya buat dan ditandatangani untuk dipergunakan dan

dimaklumi

Padang, Mei 2022

Saya yang menyatakan

apt. Rina Wahyuni, M.Farm

 KATA PENGANTAR

Bismillahirrohmanirrohim,

Alhamdulillah, puji dan syukur penulis ucapkan kehadirat Allah SWT

karena berkat rahmat, hidayah dan bimbinganNya, penulis dapat menyelesaikan

penelitian disertasi ini yang berjudul “PENGARUH FORMULASI NANOKRISTAL

ASAM USNAT TERHADAP EKSPRESI MATRIX METALLOPROTEINASE-13

DAN KOLAGEN TIPE 2 PADA KELINCI OSTEOARTRITIS SERTA ANALISIS

NANOKRISTAL ASAM USNAT DALAM PLASMA DARAH”. Shalawat dan

salam penulis kirimkan kepada junjungan baginda Rasulullah Muhammad SAW

dengan hantaran kata Allahumma Shalli’ala Muhammad wa’ala ali Muhammad, yang

telah menyampaikan risalah sehingga penulis menjadi orang yang tercerahkan dalam

nikmat iman dan Islam.

Penulisan disertasi ini diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh

gelar doktor pada Program Studi Ilmu Biomedis Program Doktor Fakultas

Kedokteran Universitas Andalas. Hasil penelitian ini diharapkan dapat menjadi salah

satu bahan rujukan dalam pengembangan ilmu kedokteran, khususnya bidang

pemanfaatan bahan alam sebagai calon sumber obat baru dan penembangan bentuk

sediaan obat.

Kekayaan hayati alam Indonesia sangat beragam,mulai dari tumbuhan

tingkatan rendah yang hidup bersimbiosis sampai tumbuhan tinggi, dimana masing

masingnya mempunyai manfaat yang beranekaragam dalam kehidupan manusia.

Perkembangan ilmu pengetahuan mengungkap fakta adanya jenis senyawa metabolit

yang dihasilkan spesifik oleh masing masing tumbuhan, sebagian besar dapat

dimanfaatkan dalam bidang pengobatan. Kayu angin yang merupakan tumbuhan

tingkat rendah ynag hidup bersimbiosis menghasilkan senyawa asam usnat yang

mempunyai banyak khasiat farmakologis, diantaranya sebagai anti-inflamasi.

Berdasarkan hal ini, penulis tertarik untuk memformulasi senyawa asam usnat

menjadi sediaan obat dalam bentuk nanokristal, dengan tujuan untuk meningkatkan

kelarutannya didalam air, sehingga pemanfaatannya dalam bidang pengobatan dapat

dikembangkan. Selanjutnya penulis melakukan pengujian aktifitas anti-inflamasinya

terhadap kelinci osteoartritis, dengan mengamati ekspresi MMP-13 yang merupakan

biomarker dalam osteoatritis, dan mengamati deposisi kolagen tipe 2 pada jaringan

kartilago. Dalam penelitian ini, penulis juga mengembangkan metode analisis asam

usnat dalam plasma darah, yang merupakan langkah awal dalam tahapan studi

farmakokinetika asam usnat.

Penulis menyadari atas keterbatasan kemampuan dalam penyusunan disertasi

ini. Oleh karena itu, penulis mengharapkan kritikan dan saran yang bersifat

membangun untuk hasil yang lebih baik. Atas kritikan dan saran yang diberikan,

penulis ucapkan terimakasih.

Padang, Mei 2020

Penulis
 UCAPAN TERIMA KASIH

Alhamdulillahiarobbil’alamin, puji dan syukur penulis ucapkan kehadirat

Allah SWT karena berkat rahmat, hidayah dan bimbinganNya, penulis dapat

menyelesaikan penelitian disertasi ini yang berjudul “PENGARUH FORMULASI

NANOKRISTAL ASAM USNAT TERHADAP EKSPRESI MATRIX

METALLOPROTEINASE-13 DAN KOLAGEN TIPE 2 PADA KELINCI

OSTEOARTRITIS SERTA ANALISIS NANOKRISTAL ASAM USNAT DALAM

PLASMA DARAH”. Proses penulisan disertasi ini dapat diselesaikan berkat

partisipasi, dorongan dan batuan promotor, para guru besar dan seluruh staf pengajar

Progam Studi Biomedis Program Doktor Fakultas Kedokteran Universitas Andalas

serta berbagai pihak yang telah banyak membantu terlaksananya penelitian dan

penulisan disertasi ini. Oleh karena itu, izinkan penulis mengucapkan terima kasih.

Kepada yang terhormat Bapak Prof. Dr. Yuliandri, SH. MH, selaku Rektor

Universitas Andalas, telah memberikan izin, kesempatan dan kebijakan kepada

penulis untuk mengikuti dan menyelesaikan Pendidikan pada Program Studi Ilmu

Biomedis Program Doktor Fakultas Kedokteran Universitas Andalas.

Kepada yang terhormat Bapak Dr. dr. Afriwardi, SH, SpKO, MA selaku

Dekan Fakultas Kedokteran Universitas Andalas yang telah memberikan izin dan

kesempatan kepada penulis untuk mengikuti dan menyelesaikan Pendidikan pada

Program Studi Ilmu Biomedis Program Doktor Fakultas Kedokteran Universitas

Andalas.
 Kepada yang terhormat Bapak Prof. Dr. rer. soz. Nursyirwan Effendi selaku

Direktur Pascasarjana Universitas Andalas yang telah memberikan izin dan

kesempatan kepada penulis untuk mengikuti dan menyelesaikan Pendidikan pada

Program Studi Ilmu Biomedis Program Doktor Fakultas Kedokteran Universitas

Andalas.

Kepada yang terhormat Ibu Prof. dr. Nur Indrawaty Liputo, MSc, PhD

selaku Ketua Program Stusi Ilmu Biomedis Program Doktor Fakultas Kedokteran

Universitas Andalas yang telah memberikan izin dan kesempatan kepada penulis

untuk mengikuti dan menyelesaikan Pendidikan pada Program Studi Ilmu

Biomedis Program Doktor Fakultas Kedokteran Universitas Andalas.

Kepada yang terhormat Ibu Prof. Dr. Henny Lucida, Apt yang telah

berkenan menjadi Ketua Tim Promotor, menyediakan waktu, tenaga dan pikiran

dalam mengarahkan, membimbing dan mengoreksi penelitian ini. Kepada yang

terhormat Bapak Prof. Dr. Erizal Zaini, Apt sebagai Co-Promotor I dan Ibu Dr.

Gusti Revilla, M.Kes sebagai Co-Promotor II atas arahan, bimbingan, nasehat,

ketelitian penulissan, dan terus mengingatkan untuk menyelesaikan program ini.

Semoga ilmu yang diberikan Ibu dan Bapak menjadi amal ibadah dan diridhoi

Allat SWT.

Kepada yang terhormat Bapak Dr. Salman Umar, M.Si, Apt., Bapak Dr.

Friardi, Apt., Ibu Dr. dr. Efrida, Sp.PK(K), M.Kes dan Ibu dr. Ilmiawati PhD yang

telah berkenan menjadi tim penguji, memberikan masukan dan saran yang sangat

bermanfaat dalam penulisan disertasi ini.

 Kepada yang terhormat Bapak Prof. Dr. rer.nat. H. Auzal Halim, Apt selaku

Ketua Sekolah Tinggi Ilmu Farmasi Padang yang telah memberikan kesempatan,

dukungan pada penulis untuk mengikuti Program Studi Ilmu Biomedis Program

Doktor Fakultas Kedokteran Universitas Andalas.

Penulis ucapkan terima kasih kepada teman-teman seperjuangan peserta

Pendidikan Program Studi Ilmu Biomedis Program Doktor Fakultas Kedokteran

Universitas Andalas khususnya Angkatan 2015 atas kebersamaan yang sangat

berarti dalam menempuh Pendidikan ini. Semoga teman-teman diberi kemudahan

dalam menyelesaikan studi dan ukhuwah kita selalu terjaga sampai nanti.

Penulis ucapkan terima kasih kepada semua rekan Dosen Sekolah Tinggi

Ilmu Farmasi (STIFARM) Padang dan analis laboratorium yang telah bersedia

membantu dan memberi masukan dalam pelaksanaan penelitian ini.

Terima kasih yang tak terhingga kepada orang tua tercinta ayahanda

Zulhasri dan ibunda Zubaidah, AmaPd dan seluruh keluarga besar atas doa dan

dukungannya. Untuk anak-anakku tersayang Henny Fadjrina Yasmin dan M.

Rifki Al Buchori yang menjadi motivasi bagi penulis untuk menyelesaikan

disertasi ini.

Akhir kata, penulis mengucapkan terima kasih kepada semua pihak yang

tidak dapat disebutkan aamanya satu persatu, yang telah membantu dalam

penelitian dan penyelesaian disertasi. Semoga Allah SWT membalas segala

kebaikan semua pihaka yang telah membantu dan kita semua diberi petunjuk

rahmat dan hidayah-Nya.

 Penulis menyadari atas keterbatasan kemampuan dalam penyusunan

disertasi ini. Oleh karena itu, penulis mengharapkan kritikan dan saran yang

bersifat membangun untuk hasil yang lebih baik. Atas kritikan dan saran yang

diberikan, penulis mengucapkan terima kasih.

Padang, Mei 2022

Penulis
 RINGKASAN

PENGARUH FORMULASI NANOKRISTAL ASAM USNAT TERHADAP

EKSPRESI MATRIX METALLOPROTEINASE-13 DAN KOLAGEN
TIPE 2 PADA KELINCI OSTEOARTRITIS SERTA ANALISIS
NANOKRISTAL ASAM USNAT DALAM PLASMA DARAH

Rina Wahyuni

(dibawah bimbingan Henny Lucida, Erizal Zaini, Gusti Revilla)

Asam usnat merupakan metabolit sekunder yang dihasilkan dari Usnea sp.
Senyawa ini memiliki aktifitas farmakologi sebagai antibakteri, antivirus, anti-
inflamasi, analgetik, antipotozoa dan insektisida. Senyawa ini memiliki kelarutan
yang rendah didalam air, sehingga aktifitas terapinya menjadi tidak efektif.
Nanokristal merupakan strategi terbaru yang dikembangkan untuk meningkatkan
kelarutan senyawa obat melalui pengurangan ukuran partikel. Pengecilan ukuran
partikel akan meningkatkan luas permukaan, sehingga menyebabkan peningkatan
laju disolusi. Disamping itu, nanokristal memiliki stabilitas padatan yang lebih
tinggi.
Aktifitas anti-inflamasi asam usnat terhadap lipopolysaccharida (LPS)
yang diinduksi sel line RAW264,7 mampu menurunkan kadar Inos, COX-2, IL-1
β, IL-6 dan TNF-α. IL-1 β, IL-6 dan TNF-α akan memicu produksi MMP-13 dan
menghambat sintesa kolagen 2 pada osteoartitis. MMP-13 merupakan kelompok
enzim MMP yang menyebabkan kerusakan kartilago melalui aktiftasnya dalam
memecah kolagen tipe 2. Dengan demikian MMP-13 merupakan target terapi
dalam pengobatan osteoartritis.
Penelitian ini bertujuan untuk memformulasi nanokristal asam usnat
menggunakan poloksamer 188 sebagai stabilisator, kemudian dilakukan uji
aktifitas nanokristal terhadap ekspresi MMP-13 dan kolagen tipe 2 pada kelinci
osteoartritis. Formulasi nanokristal asam usnat menghasilkan partikel dengan
ukuran 358,77±21,18 nm, terdistribusi merata dengan nilai indeks polidispersitas
0,591±0,02, serta nilai zeta potensial -24,5±0,1. Analisis sifat termal dengan DSC
dan analisis derajat krstalinitas dengan XRD menunjukkan bahwa nanokristal
berada dalam struktur kristal yang stabil. Analisis morfologi dengan SEM
memperlihatkan karakteristik kristal prisma dari asam usnat dan adanya adsorbsi
partikel poloksamer 188 pada permukaan asam usnat. Analisis TEM
memperlihatkan inti kristal dari nanopartikel yang dilapisi molekul penstabil.
Kelarutan jenuh nanokristal asam usnat meningkat sebesar 38,647 kali
dibandingkan kelarutan asam usnat hasil isolasi, sedangkan efisiensi disolusi
meningkat sebanyak 2,755 kali.
Pengukuran aktifitas asam usnat terhadap ekspresi MMP-13 dan kolagen
tipe 2 dilakukan dengan metode immunohistokimia. Induksi osteoartritis dengan
monosodium iodo asetat (MIA) dilakukan selama 28 hari. Hewan dikelompokkan
kedalam 4 kelompok, dengan perlakuan yang berbeda. Kelompok kontrol positif
tidak mendapatkan terapi, kelompok 1 diberikan terapi asam usnat hasil isolasi,
kelompok 2 diberikan terapi dengan nanokristal asam usnat dan kelompok 4
diberikan terapi ibuprofen. Obat diberikan secara oral, satu kali sehari selama 14
hari. Hasil analisis menunjukkan nanokristal mempunyai aktifitas yang paling
tinggi terhadap kedua parameter, yaitu dalam menghambat produksi MMP-13 dan
meningkatkan ekspresi kolagen tipe 2. Dari hasil uji immunohistokimia ini
didapatkan kebaruan bahwa asam usnat memiliki aktifitas dalam menurunkan
ekpresi MMP-13 dan meningkatkan deposisi kolagen tipe 2, serta formulasi
nanokristal terbukti dapat meningkatkan aktifitas farmakologis akibat peningkatan
kelarutannya.
Tahap selanjutnya dalam penelitian ini adalah analisis nanokristal asam
usnat dalam plasma darah menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
(KCKT). Optimasi metode analisis dilakukan terhadap fasa gerak dan laju alir.
Fasa gerak terdiri dari asetonitril dan asam asetat 0,4% dengan sistem gradient,
dan laju alir 1 ml/menit. Ektraksi senyawa obat dari plasma dilakukan dengan
metode pengendapan protein, menggunakan pelarut organik asetonitril sebagai
pelarut pengendap. Validasi metode analisis dilakukan terhadap batas kuantitasi
lebih rendah (Lower Limit of Quantitation/LLOQ), linearitas, presisi dan akurasi.
LLOQ divalidasi pada konsentrasi 1,6 μg/ml. Uji linearitas menghasilkan
koefisien korelasi 0,9938. Presisi dan akurasi memenuhi persyaratan dimana nilai
%KV dan %akurasi untuk konsentrasi LLOQ <20%, sedangkan untuk konsentrasi
rendah (Quality Control Low/QCL) dan konsentrasi sedang (Quality Control
Medium/QCM) <15%. Metode analisis ini selanjutnya digunakan untuk
menentukan perolehan kembali nanokristal asam usnat dalam plasma darah.
Perolehan kembali nanokristal asam usnat dalam plasma darah pada konsentrasi
rendah, konsentrasi sedang dan konsentrasi tinggi berturut turut 65,699%;
75,046% dan 77,625%.
 SUMMARY

THE EFFECT OF USNIC ACID NANOCRYSTAL FORMULATION

ON MATRIX METALLOPROTEINASE-13 AND COLLAGEN 2
TO THE OSTEOARTHRITIS RABBIT AND ANALYSIS
OF USNIC ACID NANOCRYSTAL
IN BLOOD PLASMA

Rina Wahyuni

(Under the guidance of Henny Lucida, Erizal Zaini, Gusti Revilla)

Usnic acid is a secondary metabolite produced from Usnea sp. This

compound has pharmacological activities as antibacterial, antiviral, anti-
inflammation, analgetic, antiprotozoa and insecticide. This compound has a low
solubility in water, so its therapeutic activity becomes ineffective. Nanocrystals
are the recent strategy developed to increase the solubility of drug compounds by
reducing the particle size. Reducing the particle size will increase the surface area,
thus increase the dissolution rate. Beside that, nanocrystal has high solid state
stability.
The anti-inflammatory activity of usnic acid against lipopolysaccharida
(LPS) induced RAW264.7 cell line was able to reduce the levels of iNOS, COX-
2, IL-1β, IL-6 and TNF-α. IL-1β, IL-6 and TNF-α will trigger the production of
MMP-13 and inhibit the synthesis of collagen 2 in osteoarthtritis. MMP-13 is a
group of MMP enzyme caused cartilage damage through its activity in breaking
down collagen 2. Thus, MMP-13 is a therapeutic target in the treantment of
osteoarthtritis.
This studi conducted to formulate usnic acid nanocrystals using poloxamer
188 as a stabilizer, then analysed its activity on the expression of MMP-13 and
collagen 2 in osteoarthtritis rabbits. Nanocrystal prepared has particle size
358.77±21.18 nm, evenly distributed with a polydispersity index 0.591±0.02 and
zeta potential -24.4±0.1. thermal analysis with DSC and crystallinity analysis with
XRD showed that nanocrystals were in a stable crystal. Morphological analysis
with SEM showed a prismatic crystal of usnic acid and there were an adsorption
of poloxamer 188 on the surface paricle of usnic acid. TEM analysis revealed the
crystalline core of nanoparticles coated with a stabilizer molecules. The saturated
solubility of usnic acid nanocrystals increased 38.647 times compared to the
solubility of isolated usnic acid, while the dissolution efficiency increased 2.755
times.
The analysed of usnic acid activity to the expression of MMP-13 and
collagen 2 was carried out by immunohistochemcal methods. Osteoarthtritis
induced with monosodium iodo acetat (MIA) was performe for 28 days. Animals
were gruoped into 4 groups, with different teratments. The positive control group
didn’t take any therapy, group 1 was given isolate usnic acid, group 2 therapy
with usnic acid nanocrystals and group 4 was treated with ibuprofen. The drug
was given orally, once a day for 14 days, yhe results of the analysis showed that
nanocrystals has the highest activity against both parameters, in inhibttig the
production of MMP-13 and increasing the texpression of collagen 2. Form the
results of the immunohistochemical test, it was found that usnic acid has an
activitty in reducing MMP-13 expression and increasing collagen 2 deposition,
and the nanocrystal formulation shown the heighest pharmacological activity due
to the increased of solubility.
The next step in this reserach is analysis of usnic acid nanocrystals in
blood plasma using high performance liquid chromatography. Optimization of the
analytichal methode was carried out by mobile phase and flow rate system. The
mobile phase consisted of acetonitril and 0,4% acetic acid with a gradient system,
and flow rate 1 ml/minute. Extraction of drug compounds from plasma was
carried out by protein precipitation methode, with acetonitril as precipitant.
Analitycal methode validation was carried out by lower limit of quantitation
(LLOQ), linearity, precision and accuration. LLOQ was validated at a
concentration of 1.6 μg/ml. The linearity test resulted in a correlation coefficient
of 0.9938. Precision and accuracy detected that % coefficient of variancy and %
of accuration was < 20% for LLOQ concentration, and < 15% for low
concentration (Quality Control Low/QCL) and medium concentration (Quality
Control Medium/QCM). This analytical methode was used to determine the
recovery of usnic acid nanocrystals in blood plasma at low, medium and high
concentration was 65.699%, 75.046% and 77.625% respectively.
 ABSTRAK

PENGARUH FORMULASI NANOKRISTAL ASAM USNAT TERHADAP

EKSPRESI MATRIX METALLOPROTEINASE-13 DAN KOLAGEN
TIPE 2 PADA KELINCI OSTEOARTRITIS SERTA ANALISIS
NANOKRISTAL ASAM USNAT DALAM PLASMA DARAH

Rina Wahyuni

Asam usnat yang diisolasi dari tumbuhan Usnea sp merupakan senyawa

metabolit sekunder golongan dibenzofuran yang memiliki banyak aktifitas
farmakologis. Namun, penggunaannya dalam bidang pengobatan terbatas, karena
kelarutan yang rendah dalam air, sehingga memiliki biovailabilitas yeng rendah.
Penelitian ini bertujuan untuk melihat pengaruh formulasi nanokristal asam usnat
terhadap karakteristik fisikokimia, laju disolusi serta aktifitas anti-inflamasinya
terhadap ekspresi MMP-13 dan kolagen tipe 2 pada kelinci osteoartritis.
Selanjutnya dilakukan analisis nanokristal asam usnat dalam plasma darah.
Nanokristal dibuat dengan metode penggilingan basah menggunakan
poloksamer 188 sebagai satabilisator. Hasil karakterisasi fisiko kimia
menunjukkan karakteristik nanokristal, dengan ukuran partikel rata rata
358,77±21,18 nm. Laju disolusi meningkat 2,755 kali dibandingkan asam usnat
hasil isolasi. Analisis immunihistokimia terhadap ekspresi MMP-13 dan kolagen
tipe 2 menunjukkan terjadinya peningkatan aktifitas nanokristal asam usnat dalam
menghambat ekspresi MMP-13 dan meningkatkan ekspresi kolagen tipe 2,
dibandingkan terhadap aktifitas asam usnat murni dan ibuprofen.
Analisis nanokristal asam usnat dalam plasma dilakukan dengan metode
pengendapan protein, menggunakan asetonitril sebagai pengendap protein.
Analisis dilakukan dengan KCKT sistem gradient menggunakan fase gerak
asetonitrl dan asam asetat 0,4%. Analisis nanokristal asam usnat dalam plasma
menghasilkan perolehan kembali 65,699%; 75,046% dan 77,625% berturut turut
untuk konsentrasi rendah, menengah dan tinggi.

Kata kunci: asam usnat, nanokristal, MMP-13, Kolagen tipe 2, perolehan

kembali
 ABSTRACT

THE EFFECT OF USNIC ACID NANOCRYSTAL FORMULATION

ON MATRIX METALLOPROTEINASE-13 AND COLLAGEN 2
TO THE OSTEOARTHRITIS RABBIT AND ANALYSIS
OF USNIC ACID NANOCRYSTAL
IN BLOOD PLASMA

Rina Wahyuni

Usnic acid isolated from Usnea sp is a secondary metabolite compound of

the dibenzofuran group which has many pharmacological activities. However, its
use in medicine is limited, due to its low solubility in water, so it has low
bioavailability. This study aimed to examine the effect of the nanocrystal
formulation of usnic acid on its physicochemical characteristics, dissolution rate
and anti-inflammatory activity on the expression of MMP-13 and type 2 collagen
in osteoarthritis rabbits. Furthermore, the analysis of usnic acid nanocrystals in
blood plasma was carried out.
Nanocrystals were prepared by wet milling method using poloxamer 188
as a stabilizer. The results of physicochemical characterization showed the
characteristics of nanocrystals, with an average particle size of 358.77±21.18 nm.
The dissolution rate increased 2,755 times compared to the isolated usnic acid.
Immunihistochemical analysis of the expression of MMP-13 and type 2 collagen
showed an increase in the activity of usnic acid nanocrystals in inhibiting MMP-
13 expression and increasing the expression of type 2 collagen, compared to the
activity of pure usnic acid and ibuprofen.
Analysis of usnic acid nanocrystals in plasma was carried out by protein
precipitation method, with acetonitrile as the protein precipitate. The analysis was
carried out using HPLC with gradient system using acetonitrile and 0.4% acetic
acid as mobile phase. Analysis of usnic acid nanocrystals in plasma yielded a
recovery of 65.699%; 75.046% and 77.625% for low, medium and high
concentrations, respectively

Keyword: usnic acid, nanocrystal, MMP-13, type 2 collagen, recovery.

 DAFTAR ISI

KULIT LUAR.....................................................................................................ii
KULIT DALAM.................................................................................................iii
LEMBAR PERNYATAAN................................................................................iv
HALAMAN PENGESAHAN.............................................................................v
KATA PENGANTAR........................................................................................viii
UCAPAN TERIMA KASIH...............................................................................ix
RINGKASAN.....................................................................................................
SUMMARY........................................................................................................
ABSTRAK..........................................................................................................
ABSTRACT........................................................................................................
DAFTAR ISI.......................................................................................................
DAFTAR TABEL...............................................................................................
DAFTAR GAMBAR..........................................................................................
DAFTAR SINGKATAN....................................................................................
DAFTAR LAMPIRAN.......................................................................................
BAB I. PENDAHULUAN..................................................................................1
1.1 Latar Belakang...............................................................................1
1.2 Rumusan Masalah..........................................................................9
1.3 Tujuan Penelitian...........................................................................10
1.3.1 Tujuan Umum.......................................................................10
1.3.2 Tujuan Khusus......................................................................10
1.4 Manfaat Penelitian.........................................................................10
BAB II. TINJAUAN PUSTAKA........................................................................12
2.1 Asam Usnat....................................................................................12
2.1.1 Farmakokinetik Asam Usnat................................................12
2.2 Nanokristal.....................................................................................13
2.2.1 Teknologi Pembuatan Nanokristal.......................................14
2.2.2 Evaluasi Sifat Fisiko Kimia Nanokristal..............................19
2.2.3 Stabilisasi Nanokristal..........................................................21
 2.2.4 Karakteristik In Vivo Sediaan Oral Nanokristal..................24
2.3 Polaksamer.....................................................................................28
2.4 Inflamasi........................................................................................28
2.5 Kartilago........................................................................................33
2.6 Osteoarthritis..................................................................................35
2.6.1 Patofisiologi Osteoarthritis...................................................36
2.6.2 Mediator Inflamasi Osteoarthritis.........................................37
2.7 Matrix Mettalloproteinase (MMP).................................................40
2.8 Matrix Mettalloproteinase 13 (MMP-13)......................................42
2.9 Kolagen Tipe 2...............................................................................43
BAB III. KONSEPTUAL DAN HIPOTESIS PENELITIAN............................45
3.1 Kerangka Konseptual.....................................................................45
3.2 Hipotesis Penelitian.......................................................................47
BAB IV. METODE PENELITIAN....................................................................49
4.1 Jenis dan Desain Penelitian............................................................49
4.1.1 Jenis Penelitian.....................................................................49
4.1.2 Desain Penelitian..................................................................49
4.2 Rancangan Penelitian.....................................................................50
4.3 Populasi, Sampel dan Teknik Pengambilan Sampel......................51
4.3.1 Populasi................................................................................51
4.3.2 Sampel..................................................................................52
4.3.3 Besar dan Teknik Pengambilan Sampel...............................52
4.4 Klasifikasi Variabel dan Definisi Operasional..............................53
4.4.1 Klasifikasi Variabel..............................................................53
4.4.2 Definisi Operasional.............................................................54
4.5 Kerangka Operasional Penelitian...................................................55
4.5.1 Kerangka Operasional Isolasi Asam Usnat dari Tumbuhan
Kayu Angin..........................................................................55
4.5.2 Kerangka Operasional Formulasi Nanokristal Asam Usnat
dan Pengukuran Paremeter Farmakokinetik.........................55
 4.5.3 Kerangka Operasional Pengukuran Ekspresi MMP 13 Serta
Ekspresi Kolagen Tipe 2 Setelah Pemberian Asam Usnat...
..............................................................................................57
4.6 Lokasi dan Waktu Penelitian.........................................................58
4.7 Bahan Penelitian dan Instrumen Penelitian...................................58
4.7.1 Bahan Penelitian...................................................................58
4.7.2 Alat.......................................................................................58
4.7.3 Hewan Percobaan.................................................................59
4.8 Prosedur Penelitian dan Pengambilan Data...................................59
4.8.1 Isolasi dan Identifikasi Asam Usnat.....................................59
4.8.2 Pembuatan Nanokristal Asam Usnat....................................60
4.8.3 Karakterisasi Fisiko Kimia Nanokristal Asam Usanat.........61
4.8.3.1 Analisis Ukuran Partikel, Distribusi Ukuran Pertikel,
Indeks Polidispersitas dan Zeta Potensian................61
4.8.3.2 Analisis Spektrum FTIR...........................................61
4.8.3.3 Analisis Difraksi Sinar X..........................................61
4.8.3.4 Karakterisasi Morfologi Permukaan Partikel...........61
4.8.3.5 Karakterisasi TEM....................................................62
4.8.3.6 Analisis Termal.........................................................62
4.8.4 Penetapan Kadar Asam Usnat dalam Nanokristal................62
4.8.4.1 Pembuatan Larutan Induk Asam Usnat dalam
Kloroform.................................................................62
4.8.4.2 Penentuan Panjang Gelombang Serapan Maksimum
Asam Usnat dalam Kloroform..................................62
4.8.4.3 Pembuatan Kurva Kalibrasi Asam Usnat dalam
Kloroform.................................................................63
4.8.4.4 Penetapan Kadar Asam Usnat dalam Kloroform......
..................................................................................63
4.8.5 Penentuan Kelarutan Jenuh Asam Usnat..............................64
4.8.5.1 Pembuatan Larutan Induk Asam Usnat dalam
Aquabidest................................................................64
 4.8.5.2 Penentuan Panjang Gelombang Serapan Maksimum
Asam Usnat dalam Aquabidest.................................64
4.8.5.3 Pembuatan Kurva Kalibrasi Asam Usnat dalam
Aquabidest................................................................64
4.8.5.4 Penentuan Kelarutan Jenuh Asam Usnat..................64
4.8.6 Uji Pelepasan Obat In-Vitro (Uji Disolusi)..........................65
4.8.6.1 Pembuatan Medium Dapar Fosfat pH 7,4................65
4.8.6.2 Pembuatan Larutan Induk Asam Usnat dalam
Medium Disolusi......................................................65
4.8.6.3 Penentuan Panjang Gelombang Serapan Maksimum
Asam Usnat dalam Medium Disolusi.......................65
4.8.6.4 Pembuatan Kurva Kalibrasi Asam Usnat dalam
Medium Disolusi......................................................65
4.8.6.5 Penentuan Profil Disolusi Asam Usnat....................66
4.8.7 Penilaian Ekspresi Immunohistokimia MMP-13 dan Kolagen
Tipe II pada Jaringan Kartilago Kelinci Inflamasi...............66
4.8.7.1 Induksi OA...............................................................66
4.8.7.2 Pemerian Sediaan Uji...............................................67
4.8.7.3 Penilaian Ekspresi Immunohistokimia MMP-13 dan
Kolagen Tipe II.........................................................67
4.8.8 Optimasi dan Validasi Metode Analisis Asam Usnat dalam
Plasma secara KCKT............................................................68
4.8.8.1 Pembuatan Larutan Induk dan Fase Gerak...............68
4.8.8.1.1 Pembuatan Larutan Induk Asam Usnat.....
....................................................................68
4.8.8.1.2 Pembuatan Larutan Induk Kofein.............68
4.8.8.1.3 Pembuatan Larutan Induk Asam Asetat
0,4%............................................................68
4.8.8.2 Penyiapan Instrumen KCKT....................................69
4.8.8.3 Optimasi Kondisi KCKT..........................................69
4.8.8.3.1 Optimasi Fase Gerak.................................69
 4.8.8.3.2 Optimasi Laju Alir.....................................70
4.8.8.4 Validasi Metode Analisis Asam Usnat dalam Plasma
Darah........................................................................70
4.8.8.4.1 Penentuan Batas Kuantitasi Lebih Rendah
....................................................................71
4.8.8.4.2 Linearitas...................................................71
4.8.8.4.3 Uji Ketepatan (Akurasi) dan Keseksamaan
(Presisi).......................................................71
4.8.8.4.4 Uji Perolehan Kembali..............................72
4.9 Persyaratan Etik.............................................................................72
4.10Analisis Data..................................................................................73
BAB V. HASIL PENELITIAN...........................................................................74
5.1 Isolasi dan Identifikasi Asam Usnat..............................................74
5.2 Karakterisasi Fisikokimia Nanokristal Asam Usnat......................78
5.2.1 Analisis Gugus Fungsi dengan FTIR...................................78
5.2.2 Analisis Ukuran Partikel, Zeta Potensial, dan Indeks
Polidispersitas Nanokristal...................................................81
5.2.3 Analisis XRD........................................................................82
5.2.4 Analisis Morfologi Pemukaan dengan SEM........................83
5.2.5 Analisis dengan TEM...........................................................84
5.2.6 Analisis Sifat Termal dengan DSC.......................................86
5.2.7 Penetapan Kadar...................................................................88
5.2.8 Uji Kelarutan Jenuh..............................................................91
5.2.9 Uji Pelepasan Obat In Vitro (Uji Disolusi)..........................93
5.3 Ekspresi Immunohistokimia MMP 13 dan Kolagen Tipe II..........98
5.4 Analisis Nanokristal Asam Usnat dalam Plasma Darah................102
5.4.1 Optimasi Metode Analisis Asam Usnat secara KCKT.........102
5.4.1.1 Optimasi Fase Gerak dan Laju Alir..........................102
5.4.2 Validasi Metode Analisis Asam Usnat dalam Plasma Darah
secara KCKT........................................................................104
BAB VI. PEMBAHASAN
6.1 Isolasi dan Identifikasi Asam Usnat..............................................106
6.2 Formulasi Nanokristal Asam Usnat...............................................107
6.3 Karakterisasi Fisikokimia Nanokristal Asam Usnat......................108
6.3.1 Analisis Ukuran Partikel, Zeta Potensial, dan Indeks
Polidispersitas.......................................................................108
6.3.2 Analisis Gugus Fungsi dengan FTIR...................................109
6.3.3 Analisis Difraksi Sinar X......................................................110
6.3.4 Analisis SEM........................................................................112
6.3.5 Analisis TEM........................................................................113
6.3.6 Analisis DSC........................................................................113
6.4 Penentuan Kelarutan Jenuh Nanokristal Asam Usnat ..................115
6.5 Penentuan Profil Disolusi Nanokristal Asam Usnat......................115
6.6 Penilaian Ekspresi MMP 13 dan Kolagen Tipe II.........................117
6.7 Analisis Nanokristal Asam Usnat dalam Plasma Darah................120
6.7.1 Optimasi Metode Analisis Asam Usnat dalam Plasma Darah
secara KCKT........................................................................120
6.7.2 Validasi Metode Analisis Asam Usnat dalam Plasma Darah
secara KCKT........................................................................122
6.7.3
BAB VII. KESIMPULAN DAN SARAN..........................................................125
7.1 Kesimpulan....................................................................................125
7.2 Saran..............................................................................................125
DAFTAR PUSTAKA
LAMPIRAN
 DAFTAR TABEL

Tabel 4.1 Perbandingan Formula Asam Usnat..............................................60

Tabel 4.2 Komposisi Fasa Gerak Sistem Gradient Pada Proses Optimasi....70
Tabel 5.1 Hasil Identifikasi Kualitatif Asam Usnat Isolasi............................75
Tabel 5.2 Hasil Analisis Gugus Fungsi Spektrum FTIR Asam Usnat dan
Pembanding.................................................................................77
Tabel 5.3 Hasil Analisis Kuantitatif Asam Usnat Hasil Isolasi.....................78
Tabel 5.4 Ukuran Partikel Formula Nanokristal............................................81
Tabel 5.5 Data Spektrum Panjang Gelombang Asam Usnat dalam Kloroform
Pada Konsetrasi 6 µg/mL ..............................................................89
Tabel 5.6 Data Kurva Kalibrasi Asam Usnat Dalam Kloroform ..................89
Tabel 5.7 Hasil Penetapan Kadar Asam Usnat Dalam Nanokristal...............90
Tabel 5.8 Data Spektrum Panjang Gelombang Asam Usnat dalam Aquabidest
Pada Konsetrasi 10 µg/mL.............................................................91
Tabel 5.9 Data Kurva Kalibrasi Asam Usnat Dalam Aquabidest..................92
Tabel 5.10 Hasil Uji Kelarutan Jenuh Asam Usnat Dalam Aquabidest..........93
Table 5.11 Data Spektrum Panjang Gelombang Asam Usnat dalam Dapar
Fosfat pH 7,4 Konsetrasi 6 µg/mL.................................................94
Tabel 5.12 Data Kurva Kalibrasi Asam Usnat Dalam Dapar Fosfat pH 7,4. .
........................................................................................................94
Tabel 5.13 Kadar Asam Usnat Terdisolusi Selama 60 Menit..........................95
Tabel 5.14 Data Efisiensi Disolusi...................................................................96
Tabel 5.15 Nilai Koefisien Regresi Kinetika Pelepasan Obat Orde Nol, Orde
1, Higuchi, Korsmayer-Peppas......................................................98
Tabel 5.16 Persentase Intesitas warna Ekpspresi MMP-13 dan Kolagen Tipe
II……………………………………………………………….101
Tabel 5.17 Hasil Optimasi Laju Alir………………………………………104
Tabel 5.18 Hasil Pengukuran LLOQ Asam Usnat Hasil Isolasi Dalam Plasma
Darah…………………………………………………………..104
Tabel 5.19 Hasil % Recovery Nanokristal Asam Usnat Dalam Plasma Darah
………………………………………………………………….105
 DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1 Struktur Dasar Dari Polymeric Nanoparcles, Nanoemulsions,

Solid Lipid Nanoparticles, Nanostructured Lipid Carriers dan
Nanocrystals ...............................................................................14
Gambar 2.2 Pembentukan Nanokristals Menggunakan Planetary Mill Melalui
Mekanisme Yang Berbeda...........................................................17
Gambar 2.3 Teknik Formulasi Nanokristal.....................................................19
Gambar 2.4 Skema Ilustrasi Stabilisasi Elektrostatik, Sterik dan Elektrosterik
.....................................................................................................23
Gambar 2.5 Obat-Obat Dalam Bentuk Nanokristal Menghasilkan Perbedaan
Gradient Konsentrasi yang Tinggi, Sehingga Akan Menghasilkan
Peningkatan Absorpsi yang Signifikan........................................24
Gambar 2.6 Kiri: Obat Dengan Kelarutan Rendah (BCS II), Peningakatan
Bioavabilitas yang Dihasilkan Oleh Nanokristal........................25
Gambar 2.7 Fitur Nanokristal.........................................................................26
Gambar 2.8 Absorpsi Oral Obat-Obat Dalam Bentuk Mikrokristal Dibatasi
Oleh Disolusi yang Terbatas Baik Pada Keadaan Puasa Maupun
Pada Saat Peru Berisi, Sedangkan Obsorbsi Obat-Obat Dalam
Bentuk Nanokristal Tergantung Kepada Permeabelitas Membran
.......................................................................................................27
Gambar 2.9 Molekul Pluronic Block Copolimer............................................28
Gambar 2.10 Tahap Awal Respon Inflamasi Lokal..........................................31
Gambar 2.11 Patofisiologi Osteoartritis............................................................36
Gambar 2.12 Peranan Sitokin Pro Inflamasi Dalam Patofisiologi Osteoarth
-ritis..............................................................................................39
Gambar 2.13 Jalur Regulasi MMP-13 Pada Sel Kondosit Yang Mengalami
Osteoartritis..................................................................................42
Gambar 2.14 Proses Degradasi Kolagen Tipe II Pada Kertilago dan Matriks
Ekstraseluler.................................................................................44
Gambar 5.1 Asam Usnat Hasil Isolasi dari Usnea sp......................................75
Gambar 5.2 Spektrum FTIR Asam Usnat Hasil Isolasi dan Pembanding.......76
Gambar 5.3 Kromatogram Asam Usnat Pembanding Dengan Fasa Gerak
Asetonitril : Asam Usnat 0,4% (88:12)........................................77
Gambar 5.4 Kromatogram Asam Usnat Isolasi Dengan Fasa Gerak Asetonitril
: Asam Asetat 0,4% (88:12)..........................................................78
Gambar 5.5 Spektrum FTIR.............................................................................79
Gambar 5.6 Spektrum FTIR Polaksamer 188..................................................80
Gambar 5.7 Spektrum FTIR Nanokristal Asam Usnat Polaksamer 188..........80
Gambar 5.8 Difraktogram Asam Usnat...........................................................82
Gambar 5.9 Difraktogram Poloksamer 188.....................................................82
Gambar 5.10 Difraktogram Nanokristal............................................................83
Gambar 5.11 Morfologi Asam Usnat.................................................................84
Gambar 5.12 Morfologi Nanokristal Asam Usnat-Polaksamer 188..................85
Gambar 5.13 Kurva Distribusi Ukuran Partikel Hasil Analisis TEM................86
Gambar 5.14 Termogram Asam Usnat..............................................................86
Gambar 5.15 Termogram Polaksamer 188........................................................87
Gambar 5.16 Termogram Nanokristal Asam Usnat...........................................87
Gambar 5.17 Spektrum Panjang Gelombang Serapan Maksimum Asam Usnat
Dalam Kloroform Pada Konsentrasi 6µg/mL..............................88
Gambar 5.18 Kurva Kalibrasi Asam Usnat Dalam Nanokristal.......................90
Gambar 5.19 Spektrum Panjang Gelombang Serapan Maksimum Asam Usnat
Dalam Aquabidest Pada Konsentrasi 10µg/mL..........................91
Gambar 5.20 Kurva Kalibrasi Asam Usnat Dalam Aquabidest........................92
Gambar 5.21 Spektrum Panjang Gelombang Serapan Maksimum Asam Usnat
Dalam Pelarut Dapar Fosfat pH Pada Konsentrasi 6 µg/mL
(288,6 nm)...................................................................................93
Gambar 5.22 Kurva Kalibrasi Asam Usnat Dalam Dapar Fosfat pH 7,4.........94
Gambar 5.23 Kurva Profil Disolusi Asam Usnat dan Nanokristal...................95
Gambar 5.24 Grafik Kinetika Pelepasan Obat Orde Nol..................................96
Gambar 5.25 Grafik Kinetika Pelepasan Obat Orde 1......................................97
Gambar 5.26 Grafik Kinetika Pelepasan Obat Menurut Persamaan Higuchi
.....................................................................................................97
Gambar 5.27 Grafik Kinetika Pelepasan Obat Menurut Persamaan Korsmeyer-
Peppas.........................................................................................98
Gambar 5.28 Pewarnaan Immunohistokimia MMP-13...................................99
Gambar 5.29 Pewarnaan Immunohistokimia Kolagen Tipe II……………100
Gambar 5.30 Histogram Ekspersi MMP-13 Pada Jaringan Krtilago Sendi Lutut
………………………………………………………………..101
Gambar 5.31 Histogram Ekspersi Kolagen Tipe II Pada Jaringan Krtilago Sendi
Lutut…………………………………………………………..101
Gambar 5.32 Kromatogram Senyawa Asam Usnat Hasil Isolasi dan IS yang
Dielusi Dengan Fase Gerak 1 dan 2 Pada Laju Alir 1 mL/menit
……………………………………………………………. 102
Gambar 5.33 Kromatogram Senyawa Asam Usnat Hasil Isolasi dan IS dengan
Kecepatan Alir 1 mL/menit dan Kecepatan Alir 1,2 mL/menit
………………………………………………………………..103
Gambar 5.34 Kurva Kalibrasi Larutan Asam Usnat Dalam Plasma Dengan
KCKT……………………………………………………….105
Gambar 6.1 Kromatogram Hasil Ekstraksi Plasma Dengan Perbandingan
Asetonitril : Plasma (3:1) Menggunakan Sistem Gradient Dengan
Fase Terpilih ………………………………………………..122
 DAFTAR SINGKATAN
ADAMTS = a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin
BCS II = biopharmaceutical classification system II
AFM = Atomic Force Microscopy
COX-2 = cyclooxidase-2
DLS = Dynamic Light Scattering
FACIT = fibril associated
HLB = Hidrophilic Lipophilic Balance
HO-1 = Hemooksigenase-1
HPC = high performance computing
HPH = High Pressure Homogenization
IHK = Imonohistominia
IL-6 = interleukin 6
IL-1β = interleukin 1β
IL-10 = interleukin 10
iNOS = inducible nitric oxide synthase
IS = internal standar

KCKT = Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

LPS = lipopolisakarida
MMP = matrix metalloproteinase
MMP 13 = matrix metalloproteinase 13
mRNA = Messenger-RNA
NF-κB = nuclear factor kappa B
NO = nitric oxide
PCS = Photon Correlation Spectroscopy
PEI = Poly(ethylene imine)
PSA = Particle Size Analyzer
PVP = Polivinil Pirolidon
qRT-PCR = Real Time Polymerase
ROS = produksi reactive oxygen species
SDS = Sodium Duodecyl Sulfat
SEM = Scanning Electron Microscopy
TEM = Transmission Electron Microscopy
TIMP = tissue inhibitor of metalloproteinase
TNF-α = Tumor Necrosis Factor-α
UV-Vis = Ultra Violet-Visible
 DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1 Skema Kerja Isolasi Asam Usnat dari Usnea sp……………140

Lampiran 2 Skema Kerja Formulasi Nanokristal Asam Usnat- Polaxsamer
188…………………………………………………………..141
Lampiran 3 Skema Kerja Induksi OA dan Terapi Hewan Coba…………142
Lampiran 4 Skema Kerja Uji Immunohistokimia Terhadap MMP-13 dan
Kolagen Tipe 2 Terhadap Jaringan Kartilago Sendi Lutut…143
Lampiran 5 Skema Kerja Optimasi dan Validasi Metode Analisis Asam
Usnat…………………………………………………………144
Lampiran 6 Certificate Of Analysis (CoA) poloksamer 188…………….145
Lampiran 7 Hasil Identifikasi Herbarium Kayu Angin…………………146
Lampiran 8 Sertifikat Analisis Ibuprofen………………………………..147
Lampiran 9 Nanosuspensi Hasil Wet Grinding……………………………….148
Lampiran 10 Nanokristal Asam Usnat-Poloksamer 188 .................………148
Lampiran 11 Overlay spektrum FTIR asam usnat hasil isolasi, poloksamer 188
dan nanokristal asam usnat………………………………….149
Lampiran 12 Data hasil PSA nanokristal formula 1 …………………………………150
Lampiran 12 Data hasil PSA nanokristal formula 1 (Lanjutan)…………..151
Lampiran 12 Data hasil PSA nanokristal formula 1 (Lanjutan)…………..152
Lampiran 13 Data hasil PSA nanokristal formula 2 …………………………………153
Lampiran 13 Data hasil PSA nanokristal formula 2 (Lanjutan)…………..154
Lampiran 13 Data hasil PSA nanokristal formula 2 (Lanjutan)…………..155
Lampiran 14 Data hasil PSA nanokristal formula 3 …………………………………156
Lampiran 14 Data hasil PSA nanokristal formula 3 (Lanjutan)…………..157
Lampiran 14 Data hasil PSA nanokristal formula 3 (Lanjutan)…………..158
Lampiran 15 Data pengukuran zeta potensial nanokristal formula 2 ……159
Lampiran 15 Data pengukuran zeta potensial nanokristal formula 2 (Lanjutan)
……………………………………………………………….160
Lampiran 16 Overlay difraktogram XRD asam usnat hasil isolasi, poloksamer
188 dan Nanokristal ………………………………………..161
Lampiran 17 Overlay Termogram DSC asam usnat hasil isolasi, poloksamer
188 dan Nanokristal ………………………………………..162
Lampiran 18 Ukuran kristal asam usnat hasil isolasi, poloksamer 188 dan
nanokristal ………………………………………………….163
Lampiran 19 Derajat kristalinitas asam usnat hasil isolasi, poloksamer 188 dan
nanokristal…………………………………………………..164
Lampiran 20 Contoh teknik pengukuran area terwarnai untuk penilaian Immu
-nohistokimia MMP-13 Pada Sendi Femur Hewan Coba Pada
Perbesaran Objektif 40x Menggunakan Software Image J…166
Lampiran 20 Lanjutan …………………………………………………….167
Lampiran 21 Contoh teknik pengukuran area terwarnai untuk penilaian
immunohistokimia collagen 2 pada sendi femur hewan coba
pada perbesaran objektif 40x menggunakana software image J
……………………………………………………………….168
Lampiran 21 Lanjutan …………………………………………………….169
Lampiran 22 Data persentase penilaian immunohistokimia MMP-13 dan
Kolagen Tipe 2 Pada Jaringan Kartilago ………………….170
Lampiran 23 Diagram hasil penilaian immunohistokimia MMP-13 dankolagen
tipe 2 pada jaringan kartilago………………………………171
Lampiran 24 Hasil uji disolusi asam usnat hasil isolasi dan nanokristal asam
usnat …………………………………………………………172
Lampiran 25 Hasil uji linearitas asam usnat ……………………………..173
Lampiran 26 Hasil uji akurasi dan presisi within-run asam usnat……….174
Lampiran 27 Hasil uji akurasi dan presisi between-run asam usnat …….175
Lampiran 28 Perolehan kembali nanokristal asam usnat dalam plasma darah
………………………………………………………………176
Lampiran 29 Surat keterangan lulus kaji etik…………………………….177
Lampiran 30 Uji statistik t-pair test kelarutan jenuh ……………………………….178
Lampiran 31 Uji anova MMP-13…………………………………………179
Lampiran 32 Uji anova kolagen tipe 2 …………………………………..181