LAPORAN PRAKTIKUM

BIOFARMASETIKA DAN FARMAKOKINETIK

OBJEK VI
ANALISIS OBAT DALAM MATRIKS BIOLOGI

OLEH

NAMA : ANNISA LATIFAH

NO BP : 1911012050
KELOMPOK :2
HARI/TANGGAL : RABU / 24 NOVEMBER 2021
ANGGOTA : 1. JENNIFER FEBRIANA (1911011008)
2. IFAH SOFIA (1911013011)
3. M AFIF BAIHAQI (1911012031)
4. RINI HATI DUHA (171109001)

LABORATORIUM BIOFARMASETIKA DAN FARMAKOKINETIKA

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS ANDALAS
PADANG
2021
ANALISIS OBAT DALAM MATRIKS BIOLOGI
I. TUJUAN PERCOBAAN
 Mahasiswa dapat memahami prinsip dan prosedur analisis obat dalam
matrik biologi

II. TEORI

Matrik biologi adalah bahan-bahan lain diluar analit dalam sampel biologi.
sampel biologi adalah sampel yang diambil dari bagian tubuh untuk tujuan
analisis, misalnya darah, urin, rambut, hati, ginjal dan bagian jaringan tubuh lain.
parameter farmakokinetik suatu obat dihitung dari konsentrasi obat dalam
cuplikan hayati yang sesuai, dapat berupa darah, urin, saliva dan cairan relevan
atau mengandung obat tetapi paling sering adalah darah atau urin (1).

Metode analisis yang digunakan untuk penentuan kadar obat

dalam serum hendaknya telah jernih berkenaan dengan hal-hal berikut seperti
lineritas, kepekaan, ketepatan, ketelitian dan stabilitas. Untuk menganalisis darah
total. Komponen sel darah harus dilisis demikian sehingga kandungannya
bercampur merata dengan sonikator atau ditentukan dalam jangka waktu
tertentu lalu di sonikasi. Plasma berbeda dengan serum, serum adalah
plasma yang fibrinogennya telah dihilangkan dengan proses penjedalan,
sedangkan plasma diperoleh dengan menambahkan suatu pencegahan penjedahan
ke dalam darah. Bila darah tidak diberi antikoagulan terjadilah penjendalan
dan bila contoh seperti dipusingkan maka beningnya adalah serum (1).

Teofilin merupakan zat yang berbentuk serbuk hablur, putih; tidak berbau;
rasa pahit; stabil di udara. Kelarutannya, sukar larut dalam air; tetapi lebih mudah
larut dalam air panas; mudah larut dalam larutan alkali hidroksida dan dalam
amonia; agak sukar larut dalam etanol, dalam kloroform dan dalam eter.Teofilin
mengandung satu molekul air hidrat atau anhidrat. Mengandung tidak kurang dari
97,0% dan tidak lebih dari 102,0% C7H8N4O2, dihitung terhadap zat kering (2)

Teofilin dimetabolisme oleh sitokrom p-450 dan kecepatan metabolisme

bervariasi luas diantara subjek-subjek. karena teofilin mempunyai kisaran terapi
yang sempit (10-20mg/l). perlu dilakukan pemantauan kadar teofilin dalam darah.
beberapa faktor yang menentukan kadar teofilin darah. Indikasi teofilin
diindikasikan sebagai terapi penunjang untuk asma yang gejala-gejalanya masih
sulit dikontrol oleh kombinasi agonis beta2 dan antiinflamasi,sediaan teofilin
lepas lambat juga bermanfaat untuk asma noktural. telah terbukti bisa
memperbaiki fungsi paru pada pasien-pasien ppc dengan memperbaiki
kontraktilitas dan kelemahan diafragma (3).

Teofilin merupakan obat bronkodilator yang digunakan pada penderita

asma; kadar terapetik teofilina dalam serum 5-20 µg/ ml dan efek toksik mulai
terlihat di atas kadar 20 µg/ ml. Dalam praktek teofilin diberikan dalam bentuk
dosis ganda sehingga rancangan dosis yang tepat sangat diperlukan dan rancangan
produk dalam bentuk pelepasan terkendali adalah salah satu solusinya. Parameter
farmakokinetik teofilin yang diamati adalah: luas area di bawah kurva (AUC),
kadar obat mencapai maksimum (Cp maks), waktu obat mencapai puncak (t
maks), tetapan laju absorpsi (ka), tetapan laju eliminasi (K), waktu paruh
eliminasi (t ½), dan waktu okupansi obat. Dengan mengetahui profil
farmakokinetika teofilin tersebut dapat dipakai untuk pertimbangan di dalam
pengaturan dosis (4).

Obat yang masuk ke dalam tubuh melalui berbagai rute pemberian

umumnya mengalami proses absorpsi, distribusi, dan pengikatan untuk sampai di
tempat kerja dan menimbulkan efek. Kemudian, dengan atau tanpa proses
biotransformasi, obat diekskresi dari dalam tubuh. Seluruh proses ini disebut
proses farmakokinetik dan berjalan serentak. Farmakokinetika menunjukkan
kinetika absorpsi obat, distribusi dan eliminasi, yakni ekskresi dan metabolisme.
Kecepatan dan tingkat obat diekskresikan melalui urin menggambarkan kecepatan
dan tingkat absorpsi obat dalam sirkulasi sistemik. Oleh sebab itu data ekskresi
obat melalui urin dapat digunakan untuk menentukan parameter farmakokinetika
dimana pada umumnya penentuan parameter farmakokinetika suatu obat
dilakukan menggunakan data kadar obat tersebut dalam darah atau saluran
sistemik (4).

Berdasarkan Food and Drug Administration (FDA), obat wajib untuk uji
bioekivalensi. Untuk itu diperlukan suatu metode analisis obat yang terpercaya
dalam matriks biologis yang sesuai. Metode analisis yang selektif dan sensitif
untuk penilaian secara kuantitatif suatu obat dan metabolitnya penting agar
berhasil menuntut uji praklinik dan/atau biofarmasetik dan uji farmakologi klinik.
Pengukuran analit dalam matriks biologis harus divalidasi. Validasi metode
bioanalisis mencakup semua prosedur yang menunjukkan bahwa metode khusus
yang digunakan untuk pengukuran kuantitatif analit yang berasal dalam matriks
biologis, seperti darah, plasma, serum, atau urine, dapat dipercaya dan dapat
dilakukan ulang (reproducible) untuk penggunaan yang diinginkan Validasi suatu
metode analisis perlu dilakukan sebelum metode tersebut digunakan untuk
penelitian lebih lanjut, seperti uji bioavailabilitas, bioekuivalensi, dan
farmakokinetik (5).

Pengukuran konsentrasi obat di darah, serum atau plasma adalah

pendekatan secara langsung yang paling baik untuk menilai farmakokinetik obat
tubuh. Darah mengandung elemen seluler mancakup sel darah merah,sel darah
putih, keeping darah dan protein seperti albumin dan globulin. Pada umunya
serum atau plasma digunakan untuk pengukuran obat. Untuk mendapatkan serum,
darah dibekukan dan serum diambil dari supernatant setelah disentrifugasi.
Plasma diperoleh dari supernatant darah yang disentrifugasi dengan ditambahkan
heparin. Oleh karena itu serum dan plasma tidak sama. Plasma mengalir keseluruh
jaringan tubuh termasuk semua elemen seluruh elemen seluler darah. Dengan
berasumsi bahwa obat di plasma dalam kesetimbangan equilibrium dengan
jaringan,perubahan konsentrasi obat akan merefleksi perubahan konsentrasi obat
di jaringan (6).

Parameter farmakokinetika obat dapat diperoleh berdasarkan hasil

pengukuran kadar obat utuh dan atau metabolitnya dalam cairan hayati (darah,
urin, saliva atau cairan tubuh lainnya). Oleh karena itu agar nilai-nilai parameter
kinetic obat dapat dipercaya; metode penetapan kadar harus memenuhi berbagai
kriteria yaitu meliputi perolehan kembali (recovery), presisi dan akurasi.
Persyaratan yang dituntut bagi suatu metode analisa adalah jia metode tersebut
dapat memberikan nila perolehan kembali yang tinggi (75-90% atau lebih),
kesalahan acak krang dari 10% (6).
 Intensitas efek farmakologis atau efek toksik suatu senyawa obat
seringkali dikaitkan dengan konsentrasi senyawa tersebut pada reseptor yang
biasanya terdapat dalam sel-sel jaringan. Karena sebagian besar dari sel-sel
jaringan diperfusi oleh cairan jaringan atau plasma, maka pemeriksaan kadar obat
dalam plasma merupakan suatu metode yang tepat dan sesuai untuk pemantauan
farmakokinetik klinik (7).

Sebelum uji praklinik dan uji farmakologi klinik dilakukan, maka suatu
metode analisis harus divalidasi terlebih dahulu sehingga diperoleh metode
analisis obat yang terpercaya dalam matriks biologis yang sesuai. Validasi metode
analisis mencakup semua prosedur yang menunjukkan bahwa metode khusus
yang digunakan untuk pengukuran kuantitatif analit yang berasal dalam matriks
biologis, seperti darah, plasma, serum, atau urin, dapat dipercaya dan dapat
dilakukan ulang untuk penggunaan yang diinginkan (7)

III. PROSEDUR PERCOBAAN

3.1. Bahan
1. Tablet teofilin
2. NaOH 0,1 N
3. Alkohol 70%
4. Na EDTA
5. HCI 0,1 N
6. Kloroform
7. Isopropil alkohol
8. Plasma kelinci/manusia
3.2. Alat
1. Labu ukur l00 mL
2. Pipet volume 0,1; 0,2; 1 dan 2 mL
3. pH meter
4. Alat suntik
5. Termostat
6. Vial
7. Alat sentrifugasi
8. Lemari pendingin
9. Pipet ukur 1 dan 5 mL
10. Kuvet, spektrofotometer
11. Kalkulator fx 3600
12. Stopwatch, kertas grafik semilog dan numerik
3.3. Pelaksanaan Percobaan
A. Perolehan kembali dan kesalahan
1. Buat larutan teofilin dalam plasma dengan kadar 2,5; 7,5 dan 12,5 µg/ml.
Tiap kadar 3 kali ulangan (replikasi)
2. Sebanyak 2 mL larutan obat dalam plasma ditambahkan ke dalam 0.4 mL
asam klorida 0,1 N dan 20,0 mL campuran kioroform – isopropyl alkohol
(20:10). Campuran dikocok selama 1 menit, lapisan air dipisahkan dan
fase organik disaring
3. Filtrat yang diperoleh dipipet sebanyak 10,0 mL dan dimasukkan ke
dalam tabung reaksi yang kering dan bersih
4. Hasil ekstraksi kemudian disaring kembali dengan penambahan 4,0 mL
larutan NaOH 0,1 N; dikocok selama 1 menit kemudian disentrifugasi
selama 10 menit dengan kecepatan 1500 rpm. Lapisan NaOH dipisahkan
5. Ukur serapan Larutan, hitung kadar dan SD
B. Penentuan panjang gelombang maksimum
1. Buat larutan teofilin dalam NaOH 0,1 N dengan konsentrasi 3,5 µg/ml
2. Ukur serapan larutan pada panjang gelombang 235 sampai 335 nm
menggunakan spektrofotometer
3. Buat spektrum serapan
C. Pembuatan kurva baku teofilin
1. Buat larutan baku induk teofilin dalam NaOH 0,1 N masing-masing
dengan konsentrasi 2,5; 3,0; 3,5; 4,0 dan 4,5 µg/ml
2. Masing-masing larutan diukur serapannya pada panjang gelombang
maksimum menggunakan spektrofotometer
3. Buat kurva baku teofilin
D. Prosedur penetapan kadar
Penetapan kadar dilakukan berdasarkan metoda Schack dan Waxler yang
dimodifikasi oleh Janne dan kawan-kawan serta Zudema
1. Buat larutan induk teofilin 10 mg/mL dalam natrium hidroksida 0,1 N
2. Dengan menggunakan larutan induk di atas, buat satu seri larutan dalam
plasma masingmasing dengan kadar 2,5; 5,0; 7,5; 10,0 dan 12,5 µg/ml
3. Dua mL larutan obat dalam plasma ditambahkan ke dalam 0,4 mL asam
klorida 0,1 N dan 20,0 mL campuran kloroform - isopropil alkohol (10 :
10). Campuran dikocok selama 1 menit, lapisan air dipisahkan dan fase
organik disaring
4. Hasil ekstraksi kemudian disaring kembali dengan penambahan 4,0 mL
larutan NaOH 0,1 N; dikocok selama 1 menit kemudian disentrifugasi
selama 10 menit dengan kecepatan 1500 rpm. Lapisan NaOH dipisahkan
5. Nilai absorpsi larutan diamati dengan menggunakan spektrofotometer
pada panjang gelombang maksimum
E. Penetapan jangka waktu respon tetap
1. Larutan teofilin dengan kadar 5,0 dan 10,0 µg/ml digunakan untuk
percobaan ini
2. Ukur- serapan larutan pada panjang gelombang maksimum tiap 5 menit
selama 1 jam
3. Buat kurva serapan versus waktu pada kertas grafik numerik dan tetapkan
waktu serapan tetap
F. Perhitungan perolehan kembali dan kesalahan
● Perolehan kembali
Hitunglah perolehan kembali dan kesalahan sisitemik untuk tiap besaran
kadar
 Perolehan kembali = Kadar Terukur x 100%
Kadar diketahui
Kesalahan sistematik adalah 100% dkurangi persentase perolehan kembali.
Perolehan kembali merupakan tolak ukur efisiensi analisis, sedangkan kesalahan
sistematik merupakan tolak ukur inakurasi penetapan kadar. Kesalahan ini dapat
berupa kesalahan konstan atau proporsional
● Kesalahan acak
Hitung kesalahan acak (random analytical error) untuk tiap besaran kadar.
Kesalahan acak = Simpangan Baku x 100%
Harga rata-rata
Kesalahan acak merupakan tolak ukur inpresisi suatu analisis dan dapat
bersifat negatif atau positif. Kesalahan acak identik dengan variabilitas
pengukuran dan dicerminkan oleh tetapan variasi
IV. HASIL dan PEMBAHASAN
4.1.HASIL
4.2. PEMBAHASAN
Analisis obat dalam cairan biologi ini ditujukan untuk banyak hal, seperti
memonitor mutu sediaan obat yang ada dalam perdagangan dengan studi
ketersediaan hayati, konfirmasi respon biologic dengan penelitian korelasi kadar
obat dalam plasma dengan respon farmakologik yang ditimbulkan, dan
membuktikan adanya racun pada kasus keracunan atau monitoring kadar obat
pada kasus overdosis.
Dalam percobaan ini difokuskan pada penetapan kadar teofilin dalam
plasma secara in-vitro. Agar hasil analisis dapat dipercayai, maka metode
penetapan kadar harus memenuhi kriteria antara lain nilai perolehan kembali yang
tinggi (75-90% atau lebih), kesalahan acak dan sistematis kecil dari 10%.
Disamping itu perlu juga diperhatikan sensitivitas dan selektivitas yang nilainya
tergantung pada alat yang digunakan dalam percobaan.
Sebelum melakukan penetapan kadar teofilin, hal pertama yang dilakukan
yaitu persiapan terlebih dahulu plasma yang akan dijadikan media pelarutan
teofilin. Penggunaan plasma ini merupakan salah satu model farmakokinetika dan
menentukan kadar suatu obat. Pemodelan ini bertujuan untuk menyerderhanakan
penelitian dari bentuk tubuh yang kompleks. Pembuatan plasma dilakukan dengan
cara nemambahkan antikoagulan ke dalam darah. Penambahan antikoagulan
bertujuan untuk mencegah terjadinya pembekuan sehingga plasma masih
mengandung fibrogen dengan kandungan serotonin yang tinggi. Selanjutnya darah
di vortex dalam waktu tertentu dengan kecepatan tertentu untuk memisahkan
antara serum dengan plasma. Cairan yang bewarna kuning muda yang merupakan
hasil vortex yang dinamakan dengan plasma.
Penetapan kadar sampel teofilin dilakukan dengan menggunakan alat
spektrofotometer UV-Vis. Untuk persipan, diperlukan penentuan panjang
gelombang maksimum dari teofilin terlebih dahulu dan didapatkan nilai serapan
maksimum dari teofilin terjadi pada 275 nm. Terlihat juga pada spektrum bahwa
nilai absorbansi mencapai puncak pada panjang gelombang ini. Panjang
gelombang yang didapatkan ini sudah sesuai dengan nilai panjang gelombang
teofilin pada literatur. Berdasarkan data kurva baku teofilin, didapatkan
persamaan regresi y = 0,2406x - 0,4033 dan R² = 0,8911. Persamaan regresi ini
yang kemudian digunakan untuk mencari konsentrasi sampel. Persamaan regresi
yang didapatkan ini kurang baik dan tidak cukup tepat, hal ini kita lihat dari nilai
koefisien determinasinya (R²). nilai R² seharusnya diharapkan mendekati satu dan
sekurang-kurangnya 0,9. Sebaiknya dilakukan pengulangan pada proses perolehan
kurva kalibrasi. Namun karena keterbatasan waktu pada saat percobaan,
pelaksanaannya dilanjutkan dengan menggunakan persamaan regresi yang sudah
didapatkan tadi.
Dengan menggunakan persamaan regresi, diperoleh konsentrasi dari sampel
pada sampel 2,5ppm = 16,714; 5ppm = 2,3661; 7,5ppm = 14,664 ; 10ppm =
2,6529; 12,5ppm = 15,566. Hasil yang didapatkan ini belum akurat dikarenakan
nilai kadar yang didapat memiliki perbedaan yang cukup besar pada beberapa
sampel. Selanjutnya juga dilakukan penetapan jangka waktu respon tetap pada
kadar 5ppm dan 10ppm. Penetapan jangka waktu respon tetap ini berguna untuk
mengukur kehandalan metode dari matriks
Analisa penetapan kadar teofilin dalam plasma ini dilakukan secara in-vitro.
Agar hasil analisis dapat dipercayai, maka metode penetapan kadar harus
memenuhi kriteria antara lain nilai perolehan kembali yang tinggi (75-90% atau
lebih), kesalahan acak dan sistematis kecil dari 10%. Disamping itu perlu juga
diperhatikan sensitivitas dan selektivitas yang nilainya tergantung pada alat yang
digunakan dalam percobaan.
Berdasarkan data hasil, didapatkan nilai perolehan kembali dari penetapan
kadar teofilin senilai 52,18%. Nilai ini belum memenuhi kriteria untuk nilai
perolehan kembali yang diharapkan yakni senilai lebih besar dari 75-90%.
Sedangkan untuk nilai kesalahan acak yang didapat dengan membandingkan
simpangan baku dan kadar rata-rata adalah senilai 8,854%. Dari nilai kesalahan
acak ini sudah cukup baik karena nilainya kecil dari 10% seperti yang diharapkan.
Dari data nilai perolehan kembali dan kesalahan sistematis, dapat diliahat
bahwa data-data yang diperoleh tidak valid. Apabila percobaan ini dilakukan di
laboratorium, ketidakvalidan ini dapat disebabkan karena beberapa faktor, antara
lain: kesalahan pada waktu pembuatan larutan, kesalahan pada alat/instrument
yang dgunakan, dan kesalahan pada praktikan sendiri. Dimana kurang teliti dalam
menganalisis data yang diperoleh. Oleh sebab itu, diperlukan ketelitian dalam
menggunakan alat dan mengamati data yang diperoleh selama percobaan
berlangsung.
V. KESIMPULAN DAN SARAN
5.1. Kesimpulan
1.
5.2. Saran
1.
 DAFTAR PUSTAKA

1) Shargel, Y. Biofarmasetika. UI press: Jakarta. 2002

2) Departemen Kesehatan Republik Indonesia.Farmakope Indonesia edisi
VI.Jakarta : Departemen Kesehatan Republik Indonesia ; 2020 .
3) Staf pengajar departemen farmakologi fakultas kedokteran universitas
Sriwijaya. Kumpulan Kuliah Farmakologi. Jakarta: EGC; 2009.
4) Parfati,Nani, Jenny C,Tan Kiauw, Doddy D.Q,dan Thomas .Studi
Farmakokinetika Teofilina Setelah Pemberian Oral Dosis Tunggal Tablet
Teofilina dan Aminofilina Lepas Kendali pada Subyek Normal. Media
Pharmaceutica Indonesiana .2018 ; 2(1) : 1-8.
5) Harahap,Yahdiana , Umar M,Christine Estherina . Validasi Metode
Analisis Cilostazol Dalam Plasma In Vitro Secara Kromatografi Cair
Kinerja Tinggi. .Majalah Ilmu Kefarmasian .2008 ; 5(1) :9-20.
6) Rohman A. Validasi dan Penjaminan Mutu (metode analisis kimia).
Yogyakarta: Universitas Gadjah Mada Press.; 2014.
7) Fauziah, F., Widya Kardela, R. R., & Silvi M. ). Avalidasi metode analisis
A-Mangostin Dalam Plasma Darah Manusia Secara In Vitro Dengan
Kromatografi Lapis Tipis Densitometri. J Farm Higea. 2017;9(2):96–7.