[Type here]

PEDOMAN NEXT-GENERATION SEQUENCING

(NGS) ILLUMINA UNTUK IMPLEMENTASI
SURVEILANS SARS-CoV-2

2022

Internal use only

#Document 032022-5
 PEDOMAN NEXT-GENERATION SEQUENCING
(NGS) ILLUMINA UNTUK IMPLEMENTASI
SURVEILANS SARS-CoV-2

Tim Penyusun

Aldo Al Deanov, S.Si. (PT. Pandu Biosains)

Fitrah Nur Rabbany, S.Si. (PT. Pandu Biosains)
M. Taufiq Soekarno, S.Si. (PT. Pandu Biosains)
M. Luthfi Abdurachman, S.Pi (PT. Pandu Biosains)
Safitriani, S.Si. (PT. Pandu Biosains)
Sarah Adinda Puteri, S.Si. (PT. Pandu Biosains)
Dr. Retno Lestari, M.Si. (Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam, Universitas Indonesia)

Kontributor
drg. Emma Rahmawati, MKM (Laboratorium Kesehatan Prov. Jawa Barat)
dr. Gunadi, PhD, SpBA (Fakultas Kedokteran, Kesehatan Masyarakat dan
Keperawatan, Universitas Gadjah Mada)
dr. Ryan Bayusantika Ristandi, Sp.PK.,MMRS. (Laboratorium Kesehatan Prov. Jawa
Barat dan Bidang Pencegahan & Pengendalian Penyakit Dinas Kesehatan Provinsi
Jawa Barat)
Drh. Safarina G. Malik, M.S., Ph.D. (Mochtar-Riady Institute for Nanotechnology)
Dr. dr. Vivi Setiawaty, M.Biomed. (Kementerian Kesehatan RI)
dr. Yekti Hediningsih SpPK, MSi.Med (Balai Labkes PAK Prov. Jawa Tengah)

2022

Internal use only

#Document 032022-5
 KATA PENGANTAR

Puji syukur kami panjatkan ke hadirat Tuhan Yang Maha Esa. Berkat rahmat dan
karunia-Nya, penulis dapat menyusun pedoman yang berjudul "Pedoman
Implementasi Surveilans SARS-CoV-2 dengan Next-Generation Sequencing
Illumina”.

Tim Penyusun turut mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada pihak-
pihak yang telah membantu menjadi kontributor dalam penerbitan Pedoman
Implementasi Surveilans SARS-CoV-2 dengan Next-Generation Sequencing Illumina
ini. Terima kasih kami sampaikan kepada:
1. drg. Ema Rahmawati, MKM (Laboratorium Kesehatan Prov. Jawa Barat)
2. dr. Gunadi, PhD, SpBA (Fakultas Kedokteran, Kesehatan Masyarakat dan
Keperawatan, Universitas Gadjah Mada)
3. dr. Ryan Bayusantika Ristandi, Sp.PK.,MMRS. (Laboratorium Kesehatan Prov.
Jawa Barat dan Bidang Pencegahan & Pengendalian Penyakit Dinas
Kesehatan Provinsi Jawa Barat)
4. Drh. Safarina G. Malik, M.S., Ph.D. (Mochtar-Riady Institute for
Nanotechnology)
5. Dr. dr. Vivi Setiawaty, M.Biomed. (Kementerian Kesehatan RI)
6. dr. Yekti Hediningsih SpPK, MSi.Med (Balai Labkes PAK Prov. Jawa Tengah)

Pedoman ini berisi panduan serta informasi terkait konsep pengerjaan Whole-
Genome Sequencing (WGS) SARS-CoV-2 hingga penjelasan alur kerja yang detail di
laboratorium mulai dari ekstraksi RNA sampai analisis data.

Semoga buku Pedoman ini dapat bermanfaat bagi para praktisi dan berkontribusi
dalam membantu percepatan penanganan pandemi saat ini serta mendorong
kemajuan perkembangan iptek laboratorium di Indonesia. Koreksi dan saran dari
semua pihak sangat diharapkan demi perbaikan buku pedoman ini.

Jakarta, 8 Februari 2022

Tim Penyusun

Internal use only

#Document 032022-5
 DAFTAR ISI

Halaman Judul ..................................................................................................... i

Tim Penyusun dan Kontributor.............................................................................. ii

Kata Pengantar ................................................................................................... iii

Daftar Isi ............................................................................................................ iv

BAGIAN I: OVERVIEW ........................................................................................ 1

BAGIAN II: ALUR KERJA WGS SARS-CoV-2 dengan KIT COVIDSeq .................... 3

Gambaran Umum Alur Kerja WGS SARS-CoV-2 dengan COVIDSeq................... 3

Detail Alur Kerja WGS SARS-CoV-2 dengan COVIDSeq..................................... 4

Komponen Bahan .......................................................................................... 4
Pelaksanaan Kerja ........................................................................................ 5

BAGIAN III: PROSEDUR MiSeq DENATURASI DAN DILUSI ............................... 17

BAGIAN IV: PROSEDUR POST RUN-WASH (PENCUCIAN INSTRUMEN SETELAH

SELESAI SEQUENCING) .................................................................................. 15

BAGIAN IV: PROSEDUR ANALISIS DATA WHOLE-GENOME SEQUENCING

SARS-CoV-2 MENGGUNAKAN DRAGEN COVID LINEAGE APPS BSSH ............ 22

BAGIAN V: PROSEDUR UPLOAD FASTA FILE SEQUENCE SARS-CoV-2 ke

GISAID ............................................................................................................. 26

DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 28

LAMPIRAN I: LIST ALAT DAN BAHAN ............................................................... 35

LAMPIRAN II: LIST KEBUTUHAN CONSUMABLES RUNNING COVIDSeq .......... 31

LAMPIRAN III: PENYIMPANAN REAGEN COVIDSeq ......................................... 33

Internal use only

#Document 032022-5
 BAGIAN I: OVERVIEW

Panduan ini menjelaskan cara mendeteksi virus SARS-CoV-2 menggunakan salah

satu dari dua kit Research Use Only (RUO) Illumina: Illumina COVIDSeq Test (3072
sampel) atau Illumina COVIDSeq Assay (96 Sampel). Illumina COVIDSeq Test
mendukung pemrosesan sampel untuk pengurutan throughput tinggi (High-
Troughput/HT), sedangkan Illumina COVIDSeq Assay berorientasi pada pemrosesan
sampel untuk pengurutan throughput rendah (Low-Throughput/LT). Pengurutan HT
dapat memproses jumlah sampel yang lebih banyak dibandingkan LT dalam satu kali
pengujian.

Illumina COVIDSeq Test dapat memfasilitasi preparasi hingga 3072 sampel

menggunakan NovaSeq 6000 (RUO) Sequencing System atau hingga 384 sampel
menggunakan NextSeq 500/550 dan NextSeq 2000 Sequencing System (RUO).
Sementara itu, Illumina COVIDSeq Assay menawarkan persiapan hingga 96 sampel
menggunakan MiSeq Sequencing System (RUO). Berikut tabel perbandingan antara
Illumina COVIDSeq Test dan Illumina COVIDSeq Assay.

Tabel 1. Perbandingan Opsi Kit Illumina COVIDSeq (RUO)

Kedua kit Illumina COVIDSeq Test (3072 sampel) dan Illumina COVIDSeq Assay (96
Sampel) sama-sama menggunakan:
- Sampel ekstraksi RNA dari spesimen nasofaring (NP), orofaring (OP), dan swab
hidung yang diambil dari individu yang memenuhi kriteria klinis atau epidemiologis
SARS-CoV-2 menggunakan kit ekstraksi RNA. Kit ekstraksi yang direkomendasikan
dan telah divalidasi oleh Illumina ialah Kit Mini QIAamp Viral RNA (QIAGEN) dan Kit
Quick-DNA/RNA Viral Magbead (Zymo Research).

Internal use only

#Document 032022-5
- Deteksi kualitatif RNA SARS-CoV-2 menggunakan DRAGEN COVIDSeq pipeline
Illumina secara lokal atau dengan aplikasi DRAGEN COVIDSeq di BaseSpace
Sequence Hub (Cloud-based).

DRAGEN COVID Pipeline dengan COVID Lineage Tools secara lokal atau dengan
aplikasi DRAGEN COVID Lineage di BaseSpace Sequence Hub dapat juga
digunakan untuk analisis Whole-Genome Sequencing SARS-CoV-2 yang dapat
membantu surveilans karakteristik genom virus SARS-CoV-2 di Indonesia.

Rekomendasi Input Sampel

Illumina COVIDSeq Test (3072 sampel) dan Illumina COVIDSeq Assay (96 Sampel)
mendukung sampel pasien yang berasal dari NP/OP, dan swab hidung.
• Spesimen disimpan dalam jangka waktu penyimpanan sesuai instruksi dari
pabrik pembuat medium transport virus. Waktu penyimpanan spesimen yang
melebihi waktu yang disarankan dapat berdampak negatif pada hasil tes.
• Faktor spesimen berikut dapat memengaruhi hasil deteksi SARS-CoV-2:
- Metode pengumpulan sampel, faktor pasien, dan/atau stadium infeksi.
- Degradasi RNA virus selama pengiriman dan penyimpanan. Degradasi RNA
dapat menghasilkan hasil negatif palsu.
• Catatan: Disarankan menggunakan sampel pasien yang diketahui positif
terinfeksi SARS-CoV-2 dengan CT < 30. Hal ini bertujuan agar viral load
yang didapatkan cukup banyak, sehingga dapat dipastikan virus terdeteksi.

Internal use only

#Document 032022-5
#Document 032022-5
BAGIAN II: ALUR KERJA WGS SARS-COV-2 dengan KIT COVIDSeq Assay/Test

Ruang Ruang Ruang PCR Ruang Preparasi

Ekstraksi Preparasi PCR dan NGS NGS

Ekstraksi Tambahkan Jalankan

sampel EPH3 program
COVID Anneal di
PCR
Sintesis cDNA
Start Tambahkan FSM Jalankan
dan RVT program
Covidseq
FSS di
Amplify cDNA PCR
Tagment PCR
Siapkan 2 PCR plate Amplicon
(COV1 dan COV2) Jalankan
program Siapkan PCR
Buat mastermix untuk Covidseq Plate Baru,
masing-masing plate PCR di masukkan 10 uL
(IPM, CPP1, CPP2) PCR amplikon dari
Pelaksana COV1 dan Cov2
an hari
pertama Buat Mix EBLT,
TB1dan NFW
Jalankan
program
Covidseq Post
TAG di Tagmentation
PCR Clean Up

Jalankan Amplify
program Tagmented
Covidseq Amplicon
TAG PCR
di PCR Pool and Clean
Up Library

Pengecekan
kualias Library
dan normalisasi
Run WGS
Library
dengan libraryDenaturasi
NGS dan dilusi library

Internal use only

#Document 032022-5
#Document 032022-5
Gambaran Umum Alur Kerja WGS SARS-CoV-2 dengan COVIDSeq Assay/Test

Detail Alur Kerja WGS SARS-CoV-2 dengan COVIDSeq Assay/Test

Komponen Bahan
Ilumina COVIDSeq RUO Test Kit (3072 spesimen) / Illumina COVIDSeq Assay (96
spesimen)

Komponen-Komponen yang harus disiapkan :

- Sarung tangan nitril – bebas powder dan sekali pakai
- Micropipet (volume 0.5 – 10 µL, 2 – 20 µL, 10 – 100 µL, 100 – 1000 µL)
- Baha habis pakai – 1,5 mL mikrosentrifus tube steril (bisa dengan tabung 2,0
mL), tabung falcon 15 mL, filter tip steril, 96 deep-well PCR plate, microplate
adhesive seal
- Reagen ekstraksi RNA - QIAamp Viral RNA Mini Kit atau Quick-DNA/RNA Viral
MagBead Extraction Kit
- Reagen annealing RNA - EPH3 (Elution Prime Fragment 3HC Mix)
- Reagen sintesis rantai awal (first strand) cDNA - FSM (First Strand Mix) dan
RVT (Reverse Transcriptase)
- Reagen amplifikasi cDNA - IPM (Illumina PCR Mix), CPP1 (COVIDSeq Primer
Pool 1), CPP2 (COVIDSeq Primer Pool 2), Nuclease-free water
- Reagen untuk Tagmentasi amplikon PCR - EBLTS (Enrichment BLT), TB1
(Tagmentation Buffer 1), Nuclease-free water
- Reagen untuk pencucian pasca Tagmentasi - ST2 (Stop Tagment Buffer 2),
TWB (Tagmentation Wash Buffer)

Internal use only

#Document 032022-5
#Document 032022-5
 - Reagen untuk amplifikasi amplikon hasil Tagmentasi - EPM (Enhanced PCR
Mix), Index adapters (IDT for Illumina-PCR Indexes Set 1, 2, 3, 4), Nuclease-
free water
- Reagen untuk pool dan pencucian library - ITB (Illumina Tune Beads)/IPB
(Illumina Purification Beads), RSB (Resuspension Buffer), 80% etanol (EtOH),
[Illumina COVIDSeq Test (RUO)] PCR 8-tube strip
- Reagen untuk kuantifikasi dan normalisasi library - Qubit dsDNA HS Assay kit
dan Qubit Assay Tubes
- Mesin Sekuensing – MiSeq NGS Ilumina
- Mesin Thermal Cycler (PCR) – PCR Konvensional
- Alat Elektroforesis dan UV transluminator – Agaros gel powder, TBE 10 x,
nucleic acid staining gel, DNA marker (100 bp)

Pelaksanaan Kerja

I. Ekstraksi RNA
Ekstraksi RNA mengikuti prosedur ekstraksi RNA Kit yang digunakan. Pada saat
elusi digunakan volume setengah reaksi.

II. Annealing RNA

(Klik untuk memutar video langkah alur kerja)

Pada tahap ini dilakukan annealing dari RNA hasil ekstraksi menggunakan
hexamer acak untuk persiapan proses sintesis cDNA.
- Langkah pertama adalah thawing (pencairan) dari mix EPH3 pada temperatur
ruang (sekitar 25o C), lalu mix tersebut dihomogenisasi dengan cara tabung
dibolak-balik beberapa kali (tube inversion).
- Dilakukan pengaturan program COVIDSeq Anneal pada mesin thermal cycler
(PCR), sebagai berikut :
• Preheat lid option dipilih.
• Volume reaksi diatur untuk 17 µL.
• Siklus PCR diatur pada suhu 65 o C selama 3 menit dan hold (untuk
storage) pada suhu 4 o C.

- Prosedur annealing:
• Plate PCR disiapkan dan dilabel sebagai cDNA1.
• Sebanyak 8,5 µL EPH3 ditambahkan ke dalam setiap sumur (well).
• Sebanyak 8,5 µL sampel yang telah didilusi ditambahkan ke dalam
setiap sumur.
• Kemudian plate disegel (sealed) dan dilakukan pencampuran
menggunakan shaker dengan kecepatan 1600 rpm selama 1 menit.
• Sentrifugasi dilakukan dengan kecepatan 1000 x g selama 1 menit.

Internal use only

#Document 032022-5
#Document 032022-5
 • Kemudian plate diletakkan ke dalam mesin PCR yang telah diprogram
sebelumnya, lalu program COVIDSeq Annual dijalankan.

III. Sintesis Rantai Awal (First Strand) cDNA

(Klik untuk memutar video langkah alur kerja)

Pada tahap ini dilakukan reverse transcriptase fragments primed RNA dengan
hexamer acak menjadi rantai awal cDNA menggunakan enzim reverse
transcriptase.
- Langkah pertama adalah reagen FSM dithawing pada temperatur ruang.
Tabung dibolak-balik beberapa kali (inversion), dan temperatur tabung dijaga
tetap stabil dan dingin (diletakkan di atas es). Kemudian reagen RVT disiapkan,
sebelum digunakan tabung dibolak-balik beberapa kali. Campuran/mix tersebut
harus selalu dijaga dalam keadaan dingin (diletakkan di atas es).
- Program COVIDSeq FSS diatur dan disimpan pada mesin PCR, sebagai
berikut :
• Preheat lid option dipilih.
• Volume reaksi diatur untuk 25 µL.
• Siklus PCR diatur sebagai berikut:
a) 25 o C selama 5 menit
b) 50 o C selama 10 menit
c) 80 o C selama 5 menit
d) Hold (storage) pada suhu 4 o C

- Prosedur sintesis :
• Di dalam tabung mikrosentrifus 1,5 mL disiapkan First Strand cDNA Master
Mix dengan komposisi FSM (9 µL x jumlah sampel) + RVT (1 µL x jumlah
sampel).
• Sebanyak 8 µL master mix ditambahkan ke dalam setiap well plate cDNA1.
• Kemudian plate disegel (sealed) dan dilakukan pencampuran
menggunakan shaker dengan kecepatan 1600 rpm selama 1 menit..
• Sentrifugasi dilakukan dengan kecepatan 1000 x g selama 1 menit.
• Kemudian plate diletakkan ke dalam mesin PCR yang telah diprogram
sebelumnya, lalu program COVIDSeq FSS dijalankan. Jika proses terhenti,
plate dapat disegel dan disimpan pada suhu -20 o C (sampel dapat bertahan
7 hari).

IV. Amplifikasi cDNA

(Klik untuk memutar video langkah alur kerja)

Pada tahap ini, untuk mengamplifikasi cDNA, dilakukan dua jenis reaksi PCR
yang berbeda.

Internal use only

#Document 032022-5
#Document 032022-5
- Langkah pertama IPM disiapkan, di-thawing hingga mencapai suhu ruang,
kemudian dilakukan homogenisasi mix tersebut dengan membolak-balikkan
tabung (inversion). Dalam setiap tahapan, kondisi tabung harus dipertahankan
agar tetap dalam dalam keadaan dingin sampai bahan digunakan.
- Disiapkan campuran/mix CPP1 dan CPP2 setelah di-thawing dan temepratur
harus selalu dijaga dalam keadaan dingin.
- Protokol COVIDSeq PCR pada mesin PCR diatur sebagai berikut :
• Preheat lid option dipilih.
• Volume reaksi diatur untuk 25 µL
• Siklus PCR diatur sebagai berikut:
a) 98 o C selama 3 menit
b) 98 o C selama 15 detik 35 siklus
o
c) 63 C selama 5 menit
d) Hold (storage) pada suhu 4 o C

- Prosedur amplifikasi :
• 2 plate PCR disiapkan dan diberi kode sebagai COV1 dan COV2. Kedua
plate ini merepresentasikan dua jenis reaksi PCR dari setiap sampel dan
kontrol pada plate cDNA1 (sampel dibuat duplo).
• Dalam tabung 15 mL dibuat COVIDSeq PCR 1 dan COVIDSeq PCR 2
Master Mix. Jumlah masing-masing volume sesuai dengan jumlah
sampel. Adapun volume reaksi sebagai berikut :

• Sebanyak 20 µL Master Mix COVIDSeq PCR 1 ditambahkan ke dalam

setiap well dalam plate COV1, sesuai dengan well yang ada di plate
cDNA1.
• 5 µL first strand cDNA dari setiap well dalam plate cDNA1 ditambahkan
ke dalam well yang sesuai pada plate COV1.
• 20 µL Master Mix COVIDSeq PCR 2 ditambahkan ke dalam setiap well
dalam plate COV2, sesuai dengan setiap well yang ada di plate cDNA1
• 5 µL cDNA dari setiap well dalam plate cDNA1 ditambahkan ke dalam
well yang sesuai pada plate COV2.
• Tutup dan shaker dengan kecepatan 1600 rpm selama 1 menit.
• Sentrifugasi dengan kecepatan 1000 x g selama 1 menit.
• Kemudian plate diletakkan ke dalam mesin PCR yang telah diprogram
sebelumnya, dan program COVIDSeq PCR dijalankan. Jika proses
terhenti, maka plate dapat disegel dan disimpan pada kulkas -20 o C
(sampel dapat bertahan 3 hari).

Internal use only

#Document 032022-5
#Document 032022-5
V. Tagmentasi Amplikon PCR
(Klik untuk memutar video langkah alur kerja)

Pada tahap ini digunakan mix EBLTS untuk men-tagmentasi amplikon PCR,
yang merupakan proses penggabungan fragmen-fragmen dan tag-tag dari
amplikon PCR dengan sekuen adapter. Persiapannya adalah sebagai berikut:
- Reagen EBLTS dan TB1 disiapkan. Reagen EBLTS disimpan pada temperatur
sekitar 2 o C. Sebelum digunakan, reagen EBLTS dan TB1 dipindahkan agar
suhu mencapai temperatur ruang, lalu masing-masing divortex hingga bahan
tercampur merata. Butiran bead dipastikan selalu terendam dalam cairan buffer.
Jika bead melekat di bagian sisi atau tutup 96-well plate, dilakukan sentifugasi
dengan kecepatan 500 x g selama 1 menit, kemudian diresuspensi dengan cara
pippeting.
- Apabila plate COV1 dan COV2 membeku, dilakukan thawing, segel diperiksa
dan digunakan shaker dengan kecepatan 1600 rpm selama 1 menit untuk
mencampur. Setelah itu dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 1000 x g
selama 1 menit.
- Program COVIDSeq TAG pada mesin PCR diatur sebagai berikut :
• Preheat lid option dipilih
• Volume reaksi diatur sebanyak 50 µL.
• Siklus diatur pada suhu 55 o C selama 5 menit dan hold (storage) pada suhu
10 o C.

- Prosedur tagmentasi :
• Plate PCR disiapkan dan diberi kode TAG1.
• Mastermix COV1 dan COV2 dibuat, yaitu dengan cara :
a) 10 µL dari setiap well pada plate COV1 dimasukkan ke dalam well yang
sesuai pada plate TAG1.
b) 10 µL dari setiap well pada plate COV2 dimasukkan ke dalam setiap well
pada plate TAG1 yang berisi COV1.
• Pada tabung 15 mL, disiapkan Tagmentation Master Mix. Masing-masing
volume dikalikan sesuai dengan jumlah sampel.
a) TB1 (12 µL)
b) EBLTS (4 µL)
c) Nuclease-free water (20 µL)
• 30 µL master ditambahkan mix pada setiap well dalam plate TAG1.
• Plate ditutup dan dishaker dengan kecepatan 1600 rpm selama 1 menit.
• Plate diletakkan ke dalam mesin PCR yang telah diprogram sebelumnya dan
program COVIDSeq TAG dijalankan.

Internal use only

#Document 032022-5
#Document 032022-5
VI. Pencucian Pasca Tagmentasi
(Klik untuk memutar video langkah alur kerja)

Pencucian amplikon-amplikon yang sudah di-tag dengan adapter sebelum

proses amplifikasi PCR dilakukan melalui tahapan sebagai berikut.
- Buffer ST2 dan TWB disiapkan. Buffer ST2 disimpan pada suhu ruang,
sementara buffer TWB disimpan pada kulkas 2-8 o C. Sebelum digunakan,
buffer ST2 dan TWB di-dispense (pipet up and down) secara perlahan untuk
meminimalisir terbentuknya busa (foaming) (klik untuk memutar video best
practices handle TWB). Buffer TWB di-dispense langsung bersama butiran
beads.
- Prosedur pencucian :
• Plate TAG1 disentrifugasi dengan kecepatan 500 x g selama 1 menit.
• 10 µL buffer ST2 ditambahkan ke dalam setiap well pada plate TAG1.
• Plate ditutup dan dishaker dengan kecepatan 1600 rpm selama 1 menit.
• Selanjutnya diinkubasi pada temperatur ruang selama 5 menit.
• Plate disentrifugasi dengan kecepatan 500 x g selama 1 menit.
• Plate diletakkan pada magnetic stand dan ditunggu sampai warna cairan
menjadi bening (3 menit).
• Dipastikan tidak ada gelembung pada tutup. Apabila muncul gelembung,
plate dapat disentrifugasi dengan kecepatan 500 x g selama 1 menit,
kemudian diletakkan kembali pada magnetic stand, dan diinkubasi
selama 3 menit.
• Semua supernatant dibuang.
• Pencucian bead dilakukan dengan tahapan berikut.
a) Bead dari magnetic stand dilepaskan
b) 100 µL TWB ditambahkan pada setiap well
c) Plate ditutup dan di-shaker dengan kecepatan 1600 rpm selama 1
menit
d) Plate disentrifugasi dengan kecepatan 500 x g selama 1 menit
e) Plate diletakkan pada magnetic stand dan ditunggu hingga warna
cairan menjadi bening (3 menit)
f) Pada pencucian pertama, semua supernatant dibuang dari setiap
well.
• Pada pencucian bead tahap kedua, supernatant ditinggalkan di dalam
plate, untuk menjaga bead dari pengeringan yang berlebihan.

VII. Amplifikasi Amplikon yang Sudah Ditagmentasi

(Klik untuk memutar video langkah alur kerja)

Pada tahap ini dilakukan amplifikasi terhadap amplikon-amplikon yang sudah

ditagmentasi menggunakan program PCR. Pada saat PCR, ditambahkan

Internal use only

#Document 032022-5
#Document 032022-5
 pasangan 10 bp Adapter Index 1 (i7), Adapter Index 2 (i5), dan sekuens-sekuens
tambahan yang disesuaikan untuk sekuensing kluster.
- Pertama-tama, dilakukan thawing mix EPM, invert mix, dan kondisikan tetap
dalam keadaan dingin.
- Disiapkan set Index Adapter (Index 1,2,3,4). Index Adapter di-thawing hingga
suhu mencapai temperatur ruang, vortex mix tersebut, kemudian disentrifugasi
dengan kecepatan 1000 x g selama 1 menit.
Perhatian! Jangan menambahkan sampel ke dalam lubang (well) plate
Index. Plate Index hanya sekali pakai dan tidak bisa digunakan ulang.
(Klik untuk memutar video best practices plate index).
- Setelah siap, setiap kemasan plate Index Adapter dibuka. Plate PCR baru wajib
digunakan untuk setiap set Index yang berbeda.
a) 96-well PCR plate baru digabungkan di atas plate Index Adapter dan
penutup aluminium ditekan.
b) Plate PCR disisihkan.
- Program COVIDSeq TAG PCR pada mesin PCR diatur sebagai berikut :
• Preheat lid option dipilih dan diatur pada suhu 100 o C.
• Volume reaksi sebanyak 50 µL diatur
• Siklus PCR diatur sebagai berikut :
a) 72 o C selama 3 menit.
b) 98 o C selama 3 menit
c) 98 o C selama 20 detik
d) 60 o C selama 30 detik 7 siklus
e) 72 o C selama 1 menit
f) 72 o C selama 3 menit
g) Hold (storage) pada suhu 10 o C

- Prosedur amplifikasi :
• Pada tabung 15 mL disiapkan EPM Master Mix. Kalikan volume reagen
sesuai dengan jumlah sampel.
a) EPM (24 µL)
b) Nuclease-free water (24 µL)
• Mix tersebut divortex
• Plate TAG1 diletakkan pada magnetic stand dan TWB disisihkan.
• Pipet 20 µL digunakan untuk memisahkan TWB yang tersisa.
• Plate TAG1 dipisahkan dari magnetic stand.
• 40 µL master mix PCR ditambahkan ke dalam setiap well.
• 10 µL Index Adapter ditambahkan ke dalam setiap well plate PCR.
• Plate ditutup dan di-shaker dengan kecepatan 1600 rpm selama 1 menit.
• Apabila cairan tampak pada tutup (seal), maka plate disentrifugasi dengan
kecepatan 500 x g selama 1 menit.
• Semua bead dipastikan sudah diresuspensi. Untuk merusespensi, volume
pipet diatur menjadi 35 µL, tuas ditekan ke bawah, lalu dilakukan pippeting
mix secara perlahan.

Internal use only

#Document 032022-5
#Document 032022-5
 • Plate diletakkan ke dalam mesin PCR dan program COVIDSeq TAG PCR
dijalankan.

VIII. Pooling dan Clean Up (Pencucian) Libraries

Pada tahap ini libraries dari setiap 96-deep well plate disatukan ke dalam tabung
1,5 mL. Libraries yang memiliki ukuran optimal akan berikatan dengan butiran
magnet (magnet beads), sementara fragment yang terlalu kecil atau besar akan
dicuci.
- Pertama-tama, ITB (Illumina Tune Beads)/IPB (Illumina Purification Beads)
divortex sebelum digunakan. Vortex perlu dilakukan cukup kencang untuk
memastikan magnet tercampur merata. Untuk mix ITB suhu perlu dikondisikan
sesuai dengan temperatur ruang (RT). (Klik untuk memutar video preparasi
ITB/IPB).
- Disiapkan mix RSB. Lalu, mix tersebut diamkan selama 30 menit agar suhu
sama dengan temperatur ruang. Selanjutnya, mix divortex, dan diinverting
sebelum digunakan.
- Disiapkan 2,5 mL 80% EtOH dari Etanol Absolut untuk setiap tabung libraries
yang akan di-pooling.
- Prosedur Pooling :
• Plate TAG1 disentrifugasi dengan kecepatan 500 rpm selama 1 menit.
• Plate diletakkan pada magnetic stand dan ditunggu hingga warna
menjadi jernih (sekitar 3 menit).
• Untuk pooling libraries dilakukan melalui tahapan berikut: (Klik untuk
memutar video langkah alur kerja)
a) Tabung 1,7 mL disiapkan dan diberi kode pooled ITB/pooled IPB.
b) 5 µL library ditransfer dari setiap well plate TAG1 ke dalam PCR 8-
tube strip, sehingga diperoleh volume 60 µL pooled library per baris.
Lalu 55 µL pooled library ditransfer dari setiap well PCR 8-tube strip
ke dalam pooled ITB/pooled IPB.
• Tabung pooled ITB/pooled IPB divortex, kemudian disentrifugasi sesaat,
agar mix merata.
• Mix ITB/IPB dimasukkan ke dalam tabung pooled ITB/pooled IPB.
Volume ITB/IPB adalah volume pooled ITB/pooled IPB dikali 0,9.
• Mix kemudian divortex dan diinkubasi pada suhu ruang selama 5 menit.
• Mix diletakkan pada magnetic stand, kemudian ditunggu hingga
warnanya menjadi jernih (sekitar 5 menit). (Klik untuk memutar video
langkah alur kerja)
• Semua supernatant dibuang
• Beads dibilas, dengan tahapan berikut ini :
a) Beads dibiarkan berada pada magnetic stand, lalu 1000 µL 80%
EtOH ditambahkan ke dalam masing-masing tabung.
b) Setelah itu ditunggu selama 30 detik.
c) Semua supernatant dibuang.

Internal use only

#Document 032022-5
#Document 032022-5
 • Beads dicuci hingga 2 kali.
• Pipet 20 µL digunakauntuk membuang sisa EtOH.
• 55 µL RBS (35 µL RBS untuk 48 sampel/run) ditambahkan
• Mix divortex, lalu disentrifugasi sesaat.
• Mix diinkubasi pada suhu ruang selama 2 menit.
• Mix diletakkan kembali pada magnetic stand selama 2 menit, hingga
warnanya menjadi jernih.
• 50 µL (30 µL untuk 48 sampel/run) supernatant ditransfer dari setiap
tabung pooled ITB/pooled IPB ke dalam tabung mikrosentrifus baru.

IX. Kuantifikasi dan Normalisasi Libraries

- 2 µL library pool dianalisa dengan Qubit dsDNA HS Assay Kit. Jika hasil
analisa keluar dari range standard, dilusi hingga konsentrasi 1 : 10, lalu library
pool dianalisa kembali.
- Molaritas dikalkulasi berdasarkan rumus di bawah ini. 400 bp digunakan
sebagai rerata ukuran library.

Internal use only

#Document 032022-5
#Document 032022-5
 BAGIAN III: PROSEDUR MiSeq DENATURASI DAN DILUSI
STANDAR NORMALISASI
Protokol ini digunakan untuk melakukan denaturasi dan dilusi dari library yang telah
dinormalisasi menggunakan normalisasi standar kuantifikasi dan prosedur quality
control yang telah direkomendasikan pada tahap preparasi library.
CHEMISTRY Konsentrasi library
MiSeq Reagen Kit V3 4 nM library- menghasilkan loading
konsentrasi 6-20 pM
MiSeq Reagen Kit V2 4 nM library- menghasilkan loading
konsentrasi 6-20 pM
2 nM library- menghasilkan loading
konsentrasi 6-10 pM
Dalam tahap denaturasi ini harus dipastikan bahwa konsentrasi NaOH tidak lebih dari
0,001 (1 mM) pada konsentrasi akhir setelah didilusi dengan HT1. Konsentrasi terlalu
Tinggi dari NaOH akan menghambat proses hibridisasi dari library ke flow cell

PERSIAPAN DILUSI NaOH SEGAR

1. Kedua larutan larutan berikut dicampur ke dalam mikrosentrifus tube.
a. Laboratory-grade water (800µl)
b. Stock 10 N NaOH (200 µl)
Dari campuran tersebut akan dihasilkan 1 mL 1 N NaOH
2. Tube tersebut divortex beberapa kali sampai terhomogenisasi
3. Kedua larutan berikut dicampur ke dalam mikrosentrifus tube.
c. Laboratory-grade water (800µl)
d. Stock 1 N NaOH (200 µl)
Dari campuran tersebut akan dihasilkan 1 mL 0.2 N NaOH
4. Tube tersebut divortex beberapa kali sampai terhomogenisasi

CATATAN:
Larutan dilusi segar wajib digunakan (larutan yang dibuat segar dan
maksimal disimpan dalam waktu 12 jam)

Persiapan HT1
1. HT1 dikeluarkan dari kulkas -20 C kemudian di-thawing pada suhu ruang
2. HT1 disimpan pada suhu 4 C hingga siap melakukan denaturasi dan dilusi
terhadap library kita
Denaturasi Library (4 nM)
1. Kedua larutan berikut dicampur ke dalam mikrosentrifus tube.
a. 4 nM library (5 µL)
b. 0,2 N NaOH (5 µL)
2. Mix larutan divortex, kemudian disentrifugasi pada 280 x G selama 1 menit

Internal use only

#Document 032022-5
#Document 032022-5
 3. Mix larutan diinkubasi pada suhu ruang selama 5 menit
4. 990 µL HT1 yang sudah di-thawing kemudian ditambahkan ke dalam tube
berisi library yang sebelumnya telah didenaturasi

Pada tahap ini akan dihasilkan larutan Denatured library dengan 20 pM

sebanyak 1 mL

Denaturasi dan Dilusi 20 pM Library

1. Library didilusi ke dalam konsentrasi yang diinginkan menggunakan tabel

panduan berikut:
Konsentrasi 6 pM 8 pM 10 pM 12 pM 15 pM 20 pM
20 pM 180 µL 240 µL 300 µL 360 µL 450 µL 600 µL
library
HT1 420 µL 360 µL 300 µL 240 µL 150 µL 0 µL

2. Larutan di-invert, kemudian disentrifugasi

3. Penambahan kontrol PhiX dapat dilihat pada prosedur Denaturasi dan
Dilusi PhiX Control pada laman Illumina
Denaturasi Library (2 nM)
1. Larutan di bawah berikut dicampur ke dalam mikrosentrifus tube.
- 2 nM library (5 µL)
- 0.2 N NaOH (5 µL)
2. Mix larutan kemudian divortex dan disentrifugasi pada kecepatan 280 x G
selama 1 menit
3. Larutan diinkubasi pada suhu ruang selama 5 menit
4. 990 µL HT1 yang sudah di-thawing kemudian ditambahkan ke dalam tube
mengandung library yang sebelumnya telah didenaturasi

Denature dan Dilute 10 pM Library

1. Library didilusi ke dalam konsentrasi yang diinginkan menggunakan tabel
panduan berikut:

Konsentrasi 6 pM 8 pM 10 pM
10 pM library 360 µL 480 µL 600 µL
HT1 240 µL 120 µL 0 µL

4. Larutan di-invert, kemudian disentrifugasi

5. Penambahan kontrol PhiX dapat dilihat pada prosedur Denaturasi dan
Dilusi PhiX Control pada laman Illumina
Informasi Tambahan: Video Best Practices Persiapan Running dengan MiSeq

Internal use only

#Document 032022-5
#Document 032022-5
 BAGIAN IV: PROSEDUR POST RUN-WASH
(PENCUCIAN MESIN SETELAH SELESAI SEKUENSING)

Post-run wash adalah prosedur pencucian instrumen yang wajib dilakukan setelah
proses sekuensing selesai. Prosedur pencucian memerlukan waktu ±20 menit.
Post run wash dilakukan tepat setelah semua proses sekuensing selesai. Siapkan
peralatan yang dibutuhkan untuk proses post-run wash sebelum memulai prosedur
post-run wash.

CATATAN
Biarkan flow cell yang sebelumnya terpakai tetap di dalam mesin. Flow cell
akan digunakan pada proses post-run wash.
Adapaun tujuan proses pencucian rutin pada mesin ialah untuk :
1. Membilas berbagai macam reagen yang ada di dalam selang pada instrumen
2. Mencegah adanya penumpukan garam dan terbentuknya kristalisasi pada
bagian fluidic
3. Mencegah adanya cross-contamination

ALAT DAN BAHAN

1. Larutan Tween 20
2. Laboratory-grade water (ddH2O)
3. NaOCl (digunakan saat ingin melakukan template line wash)
4. Miseq tube (digunakan saat ingin melakukan template line wash).

CARA KERJA
1. Larutan Tween 20 dan laboratory grade-water disiapkan:
a. 5 mL 100% larutan Tween 20 ditambahkan ke dalam 45 mL laboratory-
grade water, sehingga akan menghasilkan 10% larutan Tween 20
b. 25 mL 10% larutan Tween 20 ditambahkan ke dalam 475 mL laboratory-
grade water, sehingga akan menghasilkan 0.5% larutan Tween 20
c. Larutan wash tersebut di-invert sebanyak 5 kali.

2. Alat dan bahan yang diperlukan disiapkan untuk melakukan pencucian

a. 6 mL larutan wash ditambahkan ke dalam setiap reservoir pada wash tray
b. 350 mL larutan wash ditambahkan ke dalam 500 mL wash bottle

3. Setelah proses sekuensing selesai, pilih opsi “Start Wash”

- Sippers di dalam reagen chiller akan otomatis terangkat oleh software

Internal use only

#Document 032022-5
#Document 032022-5
 - Opsi “perform optional template line wash” jangan dipilih pada layar
monitor karena instrumen akan menjalankan prosedur yang berbeda untuk
opsi tersebut.
4. Pintu kompartemen reagen dan pintu reagen chiller dibuka, lalu reagen
cartridge yang sudah digunakan dari chiller dikeluarkan
5. Wash tray dimasukkan ke dalam reagen chiller, kemudian tutup pintu reagen
chiller
6. Sipper dari PR2 bottle dan waste bottle dinaikkan hingga naik sempurna
7. PR2 bottle ditukar dengan wash bottle
8. Waste bottle dikeluarkan dari reagen chiller kemudian dibuang isinya. Waste
bottle dikembalikan ke dalam kompartemen.

CATATAN
PR2 bottle dibuang setiap sesudah melakukan proses sekuensing,
DILARANG menggunakan kembali larutan PR2
9. Handle sipper diturunkan secara perlahan, dan sipper dipastikan telah
terpasang sempurna
10. Pintu kompartemen reagen ditutup
11. Opsi “Next” dipilih.

Setelah proses pencucian selesai, flow cell, wash tray, dan wash bottle
tetap ditinggalkan di dalam instrumen

CATATAN
Sipper akan tetap berada di posisi turun (normal). Wash solution yang tidak
terpakai ditinggalkan ke dalam wash tray dan wash bottle untuk mencegah
pengeringan pada sipper.

Internal use only

#Document 032022-5
#Document 032022-5
 BAGIAN IV: PROSEDUR ANALISIS DATA WHOLE-GENOME
SEQUENCING SARS-CoV-2 MENGGUNAKAN DRAGEN COVID
LINEAGE APPS BSSH

Pengambilan data hasil sekuensing di sistem MiSeq

1. Menu Document pada windows dibuka
2. DATA (D) > Illumina > MiSeq Output > folder hasil run (nama folder
menunjukkan tanggal run sequencing) > Data > Intensities > BaseCall dipilih
3. Semua file dipilih sesuai dengan nama sampel yang berformat fastq.gz
4. File yang telah dipilih disalin dan dipaste ke dalam flash disk/memory eksternal.
Daftar baru akun basespace untuk dapat menggunakan aplikasi Covid Lineage
Apps
1. Web browser dibuka (direkomendasikan menggunakan Chrome)
2. Penelusuran dilakukan dengan keyword Basespace Illlumina
3. Tautan BaseSpace Illumina (https://basespace.illumina.com) diklik
4. Akun baru dibuat dengan pilihan “Don’t have account?” yang dipilih
5. Form pendaftaran diisi.
6. Create Account dipilih
7. Selanjutnya Basespace akan mengirimkan email verifikasi ke alamat email
yang didaftarkan.
8. Email dibuka, tautan yang masuk ke email diklik untuk memverifikasi alamat
email.
Pembuatan project baru di Basespace sebagai tempat penyimpanan file input
dan data hasil analisis
1. Pada Home Basespace, menu Projects dipilih

2. Kemudian ikon File > New > Project dipilih

Internal use only

#Document 032022-5
#Document 032022-5
 3. Nama Project > Klik Create (kolom description bisa dikosongkan) dibuat
4. Project baru yang telah dibuat dibuat, kemudian kode project yang terdapat di
bagian ujung alamat website basespace project dikopikan untuk selanjutnya
disisipkan di powersheel.

Pengupload-an data hasil sekuensing ke basespace menggunakan Basespace

CLI
1. bs CLI di https://launch.basespace.illumina.com/CLI/latest/amd64-
windows/bs.exe di-download

2. Tombol Shift+mouse kanan diklik di folder tempat penyimpanan bs.exe.

3. Open PowerShell window here dipilih

Internal use only

#Document 032022-5
#Document 032022-5
 4. .\bs diketik kemudian enter ditekan

5. .\bs auth diketik

6. Link authentication yang muncul dari PowerShell disalin, chrome dibuka dan
link authentication di-paste dan enter diklik, kemudian yes diklik.
7. Document dibuka di komputer, folder baru dibuat di DATA (D), semua file fastq
yang akan di-upload disimpan di folder baru tersebut.
8. PowerShell dibuka kembali lalu .\bs dataset upload -p (no ID project d BSSH,
penulisan tanpa tanda kurung) --recursive (copy alamat folder tempat
menyimpan .fastq file, misal D:\Covidseq) diketik
9. Exp. .\bs dataset upload -p 257169914 --recursive D:\Covidseq
10. Enter diklik, fastq file akan otomatis ter-upload ke BSSH. Ditunggu sampai
semua file ter-upload.
Analisis data dengan menggunakan Dragen Covid Lineage
1. Setelah semua data ter-upload, sign in ke akun basespace dilakukan.
2. Kemudian menu Apps dipilih.

3. Kemudian Apps Dragen Covid Lineage dicari dan dipilih.

4. Setelah apps terbuka, LAUNCH APPLICATION dipilih

Internal use only

#Document 032022-5
#Document 032022-5
5. Kemudian pertanyaan diisi dengan:
a. Save Result to > nama project yang telah dibuat dipilih.
b. Input type > project dipilih.
c. Input project > lokasi project tempat menyimpan seluruh file fastq yang telah
ter-upload dipilih. Kemudian klik kotak kecil disamping tulisan I
acknowledge and agree that (i) this is a BaseSpace Labs App, (ii) I am using
it AS-IS without any warranty of any kind, (iii) Illumina has no obligation to
provide any technical support for this App, and (iv) Illumina has no liability
for my use of this App, including without limitation, any loss of data, incorrect
results, or any costs, liabilities, or damages that result from use of this App.
d. Kemudian LAUNCH APPLICATION diklik

Internal use only

#Document 032022-5
#Document 032022-5
BAGIAN V: PROSEDUR UPLOAD FASTA FILE SEQUENCE SARS-
CoV-2 ke GISAID

1. Akun baru di website GISAID ( https://www.gisaid.org/ ) dibuat.

2. Menu EpiCoV dipilih.
3. Pilihan untuk upload data ada dua yaitu Single Upload atau Batch Upload.
Batch Upload dipilih.

4. Download Instructions and Template diklik untuk mengunduh file template

informasi sample untuk di-upload ke GISAID.

5. Proses pengupload-an sekuen Covid19 di GISAID membutuhkan 2 file input,

yaitu fasta file (berisi kumpulan sekuen genom semua sampel) dan file
Metadata (berisi informasi terkait sampel-sampel yang disekuensing). Berikut
ini merupakan tahapan dalam membuat kedua file tersebut.

Internal use only

#Document 032022-5
#Document 032022-5
 a. File Fasta
- Fasta file hasil analisis di basespace diunduh.
- Aplikasi BIOEDIT diunduh dan diinstal untuk membuka dan mengedit file
fasta. (https://bioedit.software.informer.com/download/)
- BIOEDIT dibuka
- File fasta yang telah diunduh dibuka dengan cara menu file > open > file
fasta hasil analisis yang telah di-download dipilih > open

- Setelah terbuka akan tampilan bioedit seperti berikut akan terlihat:

- Selanjutnya sampel yang memiliki % non-N base <90% (dapat dilihat di tabel
hasil analisis Dragen Covid Lineage Basespace) dipilih dan dihapus. Nama
sampel yang akan dihapus dipilih > Delete sequence(s) diklik.

Internal use only

#Document 032022-5
#Document 032022-5
- Nama masing-masing sampel mengikuti format hCoV-19/Indonesia/kode
provinsi-nama institusi-kode spesimen/tahun spesimen diambil diganti.

- Sebagai contoh, untuk asal spesimen dari provinsi Jawa Tengah, dari
laboratorium kesehatan, kode spesimen 38M, dan spesimen diambil pada tahun
2021, maka nomenklatur virusnya diberi nama menjadi hCoV-19/Indonesia/JT-
Labkes-38M/2021. Untuk mengubah nama double klik pada kode sample >
pada kolom nama diganti dengan nama spesimen yang sesuai dengan format.

- Setelah selesai, hasil pekerjaan dengan disave dengan menu save diklik > exit
untuk keluar dari aplikasi.

Internal use only

#Document 032022-5
#Document 032022-5
b. File Metadata
- Template metadata di GISAID diunduh
(https://www.epicov.org/epi3/frontend#3a0efd).
- File template metadata dibuka > sheet submission dibuka > kolom sesuai
dengan informasi terkait sampel mengikuti format yang dijelaskan pada tabel
berikut.

Internal use only

#Document 032022-5
Submitter mandatory Diisi dengan nama ID GISAID pengupload
FASTA mandatory Diisi dengan nama file Fasta gabungan seluruh sequence sampel
filename (contoh : all_sequences.fasta )
Virus name mandatory Diisi dengan nama masing-masing sample, mengikuti format hCoV-
19/Indonesia/kode provinsi-nama institusi-kode spesimen/tahun
spesimen diambil
Kode provinsi dapat dilihat melalui link :
https://www.iso.org/obp/ui/#iso:code:3166:ID
Type mandatory Diisi dengan "betacoronavirus"
Passage mandatory Diisi denga asal sample, jika diperoleh dari swab langsung diisi
details/history dengan Original, jika diperoleh dari hasil kultur siisi dengan Vero
Collection mandatory Diisi tanggal pengambilan sample dengan format Tahun-Bulan-
date Tanggal
Location mandatory Diisi lokasi pengambilan sample dengan format Nama
Benua/Negara/Provinsi contoh : Asia / Indonesia / Jawa Tengah.
Additional
location Dapat diisi asal Kabupaten atau riwayat perjalanan
information
Host mandatory Diisi dengan sumber sample. Human, Environment, Canine, Manis
javanica, Rhinolophus affinis, etc
Additional
Dapat diisi adanya penyakit komorbid misalnya Diabetes atau
host
immunocompromise dsb
information
Sampling Dapat diisi apakah spesimen berasal dari active surveillance,
Strategy Surveilans ILI/ARI/SARI, Clinical Trial, S Gene Failure, dsb
Gender mandatory
Diisi dengan jenis kelamin pasien (Male, Female, or unknown)
Patient age mandatory Diisi dengan usia pasien (65 or 7 months, or unknown)
Diisi dengan kondisi pasien saat pengambilan sample. (Hospitalized,
Patient status mandatory Released, Live, Deceased, or unknown)
Specimen Diisi dengan Sputum / nasopharyngeal swab / oropharyngeal swab /
source blood / feces / alveolar lavage fluid / organ / tracheal swab / urine
Bila spesimen berasal dari outbreak, maka diisi kapan outbreak
Outbreak terjadi, dimana dan apakah ada cluster
Last
Diisi bila tersedia informasi
vaccinated

Treatment Diisi bila tersedia informasi (nama obat dan dosis)

Sequencing
Diisi dengan teknologi NGS yang digunakan (Illumina Miseq)
technology mandatory
Diisi metode assembly yang digunakan, misalkan : CLC Genomics
Assembly Workbench 12, Geneious 10.2.4, SPAdes/MEGAHIT v1.2.9, UGENE
method v. 33, dll

Coverage Diisi bila tersedia informasi

Originating
Diisi dengan nama laboratorium tempat asal spesimen
lab mandatory
Address mandatory Diisi dengan alamat laboratorium tempat asal spesimen
Sample ID
given by the
Diisi bila tersedia informasi
originating
laboratory
Submitting
Diisi dengan nama laboratorium tempat dilakukan sekuensing.
lab mandatory

Address mandatory Diisi dengan alamat laboratorium tempat dilakukan sekuensing.

Internal use only

#Document 032022-5
Sample ID
given by the
Diisi sesuai kode spesimen
submitting
laboratory
Diisi dengan nama list tim yang melakukan proses sekuensing dan
kepala institusi serta perwakilan laboratorium pengirim spesimen
(disepakati antara laboratorium yang mengerjakan sekuensing
Authors mandatory dengan laboratorium pengirim)
leave
kolom ini jangan diisi
Comment empty
Comment leave
kolom ini jangan diisi
Icon empty

6. Setelah kedua file telah siap, kedua file tersebut diupload pada website
GISAID.
- Untuk upload file metadata, Choose File diklik pada kolom Metadata as
Excel atau CSV.

Internal use only

#Document 032022-5
- Untuk mengupload file FASTA, pilihan Choose File diklik pada kolom
Sequences as FASTA.

- Kemudian Verify and Submit diklik.

Internal use only

#Document 032022-5
 DAFTAR PUSTAKA

BaseSpace Sequence Hub Illumina. 2022.

https://basespace.illumina.com/dashboard
Fibriani A, Stephanie R, Alfiantie AA, Siregar ALF, Pradani GAP, Yamahoki N, Purba
WS, Alamanda CNC, Rahmawati E, Rachman RW, Robiani R, Ristandi RB.
Analysis of SARS-CoV-2 Genomes from West Java, Indonesia. Viruses.
2021;13(10):2097.

GISAID. 2022. GISAID EpiCoVTM Data Batch Upload Instructions.

https://www.gisaid.org/

Gunadi, Wibawa H, Hakim MS, Marcellus, Trisnawati I, Khair RE, Triasih R, Irene,
Afiahayati, Iskandar K, Siswanto, Anggorowati N, Daniwijaya EW, Supriyati E,
Nugrahaningsih DAA, Budiono E, Retnowulan H, Puspadewi Y, Puspitawati I,
Sianipar O, Afandy D, Simanjaya S, Widitjiarso W, Puspitarani DA, Fahri F,
Riawan U, Fauzi AR, Kalim AS, Ananda NR, Setyati A, Setyowireni D,
Laksanawati IS, Arguni E, Nuryastuti T, Wibawa T; the Yogyakarta-Central
Java COVID-19 study group. Molecular epidemiology of SARS-CoV-2 isolated
from COVID-19 family clusters. BMC Med Genomics. 2021;14(1):144.

Gunadi, Wibawa H, Marcellus, Hakim MS, Daniwijaya EW, Rizki LP, Supriyati E,
Nugrahaningsih DAA, Afiahayati, Siswanto, Iskandar K, Anggorowati N, Kalim
AS, Puspitarani DA, Athollah K, Arguni E, Nuryastuti T, Wibawa T. Full-length
genome characterization and phylogenetic analysis of SARS-CoV-2 virus
strains from Yogyakarta and Central Java, Indonesia. PeerJ. 2020;8:e10575.
Gunadi, Hakim MS, Wibawa H, Marcellus, Setiawaty V, Slamet, Trisnawati I,
Supriyati E, El Khair R, Iskandar K, Afiahayati, Siswanto, Irene, Anggorowati
N, Daniwijaya EW, Nugrahaningsih DAA, Puspadewi Y, Puspitarani DA, Tania
I, Vujira KA, Ardlyamustaqim MB, Gabriela GC, Eryvinka LS, Nirmala BC,
Geometri ET, Darutama AA, Kuswandani AA, Lestari, Irianingsih SH,
Khoiriyah S, Lestari I, Ananda NR, Arguni E, Nuryastuti T, Wibawa T. Is the
Infection of the SARS-CoV-2 Delta Variant Associated With the Outcomes of
COVID-19 Patients? Front Med (Lausanne). 2021;8:780611.

Gunadi, Hakim MS, Wibawa H, Marcellus, Trisnawati I, Supriyati E, Afiahayati, Khair

RE, Iskandar K, Siswanto, Irene, Anggorowati N, Daniwijaya EW,
Nugrahaningsih DAA, Puspadewi Y, Simanjaya S, Puspitarani DA, Hanifin
HF, Setiawan AA, Tania I, Amalia CS, Artayasa IPA, Rachman H, Mulyawan
H, Ananda NR, Arguni E, Nuryastuti T, Wibawa T. Association between
prognostic factors and the outcomes of patients infected with SARS-CoV-2
harboring multiple spike protein mutations. Sci Rep. 2021;11(1):21352.

Internal use only

#Document 032022-5
Illumina COVIDSeq Assay: Product Explanation. 2022.
https://sapac.illumina.com/products/by-type/clinical-research-
products/covidseq-assay.html

Illumina COVIDSeq RUO Reference Guide. 2021.

https://sapac.support.illumina.com/content/dam/illumina-
support/documents/documentation/chemistry_documentation/Illumina-
COVIDSeq-Test/illumina-covidseq-ruo-kits-reference-guide-1000000126053-
07.PDF

Video Anneal RNA Illumina. 2021. http://y2u.be/OibkNTuJVAo

Video Sintesis cDNA Illumina. 2021. http://y2u.be/MVCYXn6SArc

Video Amplifikasi cDNA Illumina. 2021. http://y2u.be/Msar3i22aTg

Video Tagmentasi Amplikon PCR Illumina. 2021. http://y2u.be/AArVg0iTAIA

Video Pencucian Pasca Tagmentasi Illumina. 2021. http://y2u.be/ScU3AG8Sozw

Video Best Practice Handle TWB Illumina. 2021. http://y2u.be/riAbJ4w-3bU

Video Amplifikasi Amplikon yang Sudah Ditagmentasi Illumina. 2021.

http://y2u.be/KgYIxmu-WC8

Video Best Practice Handle Plate Index Illumina. 2021. http://y2u.be/B3BT9Vbe4yk

Video Preparasi ITB/IPB Illumina. 2021. http://y2u.be/E_2yqZwV36o

Video Pool dan Clean-up Libraries Part 1 Illumina. 2021. http://y2u.be/0oCpN1tOetw

Video Pool dan Clean-up Libraries Part 2 Illumina. 2021.

http://y2u.be/KUnMGYm7F9o

Video MiSeq Hands-on PT. Pandu Biosains. 2021. http://y2u.be/3TYUpyeldIc

Internal use only

#Document 032022-5
 LAMPIRAN I: LIST ALAT DAN BAHAN

Tahap Alat Bahan

Thermal cyler (PCR)
Vortex
Annealing RNA Plate shaker
Micropipettes 2 – 20 µL
Plate centrifuge
Thermal cyler (PCR)
Vortex
Sintesis Rantai Awal (First
Plate shaker
Strand) cDNA
Plate centrifuge
Micropipettes 2 – 20 µL / 10
– 100 µL
Micropipettes 0.5 - 10 µL
Thermal cyler (PCR)
Vortex
Plate shaker
Amplifikasi cDNA Plate centrifuge
Micropipettes 2 – 20 µL
Thermal cyler (PCR)
Vortex
Plate shaker
Tagmentasi Amplikon Plate centrifuge
PCR
Micropipettes 2 – 20 µL
Micropipettes 10 – 100 µL
Magnetic stand
Pencucian Pasca
Tagmentasi Vortex
Plate shaker
EPH3 (Elution Prime
Fragment 3HC Mix)
96-well PCR Plate
Microseal 'B' adhesive seals
Micropipettes tips
putih/kuning
Reservoir
FSM HT (First Strand Mix
HT)
RVT HT (Reverse
Transcriptase HT)
1.7 ml tubes (1 per 96-well
sample plate)
Microseal 'B' adhesive seal
Micropipettes tips putih dan
kuning
Reservoir
IPM HT (Illumina PCR Mix
HT)
CPP1 HT (COVIDSeq
Primer Pool 1 HT)
CPP2 HT (COVIDSeq
Primer Pool 2 HT)
Nuclease-free water (NFW)
15 ml tube (2 buah untuk 4
96-well sample plates)
96-well PCR plates (3 buah)
Microseal 'B' adhesive seal
Micropipettes tips
putih/kuning
EBLTS HT (Enrichment BLT
HT)
TB1 HT (Tagmentation
Buffer 1 HT)
Nuclease-free water
1.7 ml tube
15 ml tube (satu buah untuk
4 96-well sample plates)
Microseal 'B' adhesive seal
Micropipettes tips putih dan
kuning
Reservoir
ST2 HT (Stop Tagment
Buffer 2 HT)
TWB HT (Tagmentation
Wash Buffer HT)
Microseal 'B' adhesive seal

Internal use only

#Document 032022-5

Plate centrifuge
Micropipettes 2 – 20 µL
Micropipettes 10 – 100 µL /
20 - 200 µL
Thermal cyler (PCR)
Magnetic stand
Vortex
Amplifikasi Amplikon
yang Sudah Ditagmentasi
Plate shaker
Plate centrifuge
Micropipettes 2 – 20 µL
Micropipettes 10 – 100 µL
Magnetic stand
Vortex
Pooling dan Clean Up
Plate shaker
(Pencucian) Libraries
Plate centrifuge
Micropipettes 2 – 20 µL
Micropipettes 10 – 100 µL
Qubit
Kuantifikasi dan
Micropipettes 0.5 - 10 µL / 2
Normalisasi Libraries – 20 µL
Vortex
Mikrosentrifus
Denature dan Dilute Micropipettes 2 – 20 µL
Micropipettes 100 – 1000 µL
Gelas ukur
MiSeq tube (digunakan saat
Post-wash after run ingin melakukan template
line wash)
Micropipettes tips medium
putih dan kuning
Stopwatch
Reservoir
EPM HT (Enhanced PCR
Mix HT)
Index adapters (IDT for
Illumina-PCR Indexes Set 1,
2, 3, 4)
Nuclease-free water
15 ml tubes (satu buah
untuk dua 96-well sample
plates)
96-well PCR plate
Micropipettes tips putih dan
kuning
Reservoir
ITB (Illumina Tune
Beads)/IPB (Illumina
Purification Beads)
RSB HT (Resuspension
Buffer HT)
80% ethanol (EtOH) yang
dibuat fresh
1.7 ml tube (dua buah untuk
96-well sample plate)
PCR 8-tube strip
Micropipettes tips putih dan
kuning
Stopwatch
Library pool
Micropipettes tips
small/medium (putih/kuning)
Qubit dsDNA HS Assay Kit
Qubit tubes
HT1 buffer
NaOH 0.2 N (dibuat fresh)
Aquades/Nuclease Free-
Water (NFW)
Micropipettes tips putih dan
biru
Larutan tween 20
Laboratory-grade water
(ddH2O)
NaOCl (digunakan saat
ingin melakukan template
line wash)
Internal use only
#Document 032022-5
 LAMPIRAN II: LIST KEBUTUHAN CONSUMABLES RUNNING
COVIDSeq

1. Tahap Ekstraksi – Clean Up (Pencucian) Libraries

96 48
Untuk 384
Item samples samples/ Unit Unit
(1 instansi)
/run run
Tube 1.5
mL 10 10 Tubes 40 Tubes
(LoBind)*
Tube 5 mL
5 5 Tubes 20 Tubes
Eppendorf
PCR plate 4 4 Plates 16 Plates
Microseal
10 10 Sheets 40 Sheets
B*
PCR Strip
1 1 Strips 4 Strips
Tube 8
Reservoir 7 7 Pcs 28 Pcs

Tips 1000* 2 2 Rack 8 Rack

Tips 200* 10 5 Rack 40 Rack
Tips 20* 5 3 Rack 20 Rack
Tips 10* 10 5 Rack 40 Rack

NFW* 5 2.5 mL 20 mL
Ethanol
3 3 mL 12 mL
Absolute*
QIAamp
Viral RNA 96 48 Rxn 384 Rxn
Mini kit
*) hitungan termasuk overage/lebihan

2. Tahap Denature dan Dilute

NextSeq per run MiSeq per run (24

Item Unit
(384 samples) samples)
NaOH* 20 20 uL
TrisCl* 20 - uL
NFW* 100 100 ul
Tube 1.5 mL 5 5 Tubes
Qubit dsDNA HS 12 6 Rxn
Qubit Tube 12 6 Tubes
*) hitungan termasuk overage/lebihan

Internal use only

#Document 032022-5
 LAMPIRAN III: PENYIMPANAN REAGEN COVIDSeq

Tahapan Reagen Storage Perlakuan sebelum digunakan

Anneal RNA EPH3 ˗20 ˚ C Cairkan disuhu ruang, bolak balik tube untuk menghomogenkan larutan
Sintesis cDNA FSM ˗20 ˚ C Cairkan disuhu ruang, bolak balik tube untuk menghomogenkan larutan, setelah cair simpan diatas
ice gel sampai siap digunakan.
RVT ˗20 ˚ C Cairannya tidak akan beku, bolak balik untuk menghomogenkan, simpan selalu diatas ice gel
sampai siap digunakan.
Amplify cDNA CCP1 ˗20 ˚ C Cairkan disuhu ruang, Vortex untuk menghomogenkan larutan, setelah cair simpan diatas ice gel
sampai siap digunakan.
CCP2 ˗20 ˚ C Cairkan disuhu ruang, Vortex untuk menghomogenkan larutan, setelah cair simpan diatas ice gel
sampai siap digunakan.
IPM ˗20 ˚ C Cairkan disuhu ruang, bolak balik tube untuk menghomogenkan larutan, setelah cair simpan diatas
ice gel sampai siap digunakan.
NFW Suhu ruang Bisa digunakan langsung
Tagment PCR EBLTS 4˚C Diamkan disuhu ruang minimal 30 menit sebelum digunakan, setiap akan digunakan vortex selama
Amplicons 1 menit untuk menghomogenkan
TB1 ˗20 ˚ C Diamkan disuhu ruang, vortex untuk menghomogenkan
NFW Suhu ruang Bisa digunakan langsung
Post ST2 Suhu ruang Vortex sebelum digunakan
Tagmentation
TWB 4˚C Vortex sebelum digunakan
Clean Up
Amplify EPM ˗20 ˚ C Cairkan disuhu ruang, bolak balik tube untuk menghomogenkan larutan, setelah cair simpan diatas
Tagmented ice gel sampai siap digunakan.
Amplicons Index adapters plate ˗20 ˚ C Cairkan disuhu ruang, homogenkan dengan up dan down pippetting sebelum digunakan
NFW Suhu ruang Bisa digunakan langsung
Pool and Clean ITB/IPB Suhu ruang Setiap akan digunakan vortex selama 1 menit untuk menghomogenkan
Up Libraries
RSB 4˚C Diamkan disuhu ruang minimal 30 menit sebelum digunakan, vortex untuk menghomogenkan

Internal use only

#Document 032022-5
Quantify and Qubit Reagen, 4˚C Diamkan disuhu ruang minimal 30 menit sebelum digunakan, vortex kemudian spindown
Normalize Standard 1 dan
Libraries standard 2

Qubit Buffer 4˚C Diamkan disuhu ruang minimal 30 menit sebelum digunakan.
MiSeq MiSeq Cartridge ˗20 ˚ C Rendam di waterbath selama 1.5 jam, invert 10 kali, kemudian tap di meja datar 10 kali.
Sequencing
Flow cell 4˚C Diamkan disuhu ruang minimal 15 menit sebelum digunakan, cuci flowcell dengan akuades, dan
Reagen
keringkan dengan Kim wapes.
PR2 Buffer 5˚C Diamkan disuhu ruang minimal 15 menit sebelum digunakan

Internal use only

#Document 032022-5