IDENTIFIKASI ESCHERICHIA COSLI SUB TYPE ENTEROTOXIGENIC

(ETEC) DARI SAMPEL MAKANAN DENGAN TEKNIK PCR

(POLYMERASE CHAIN REACTION)

Proposal Karya Tulis

Disusun untuk memenuhi salah satu syarat
Menyusun Karya Tulis Ilmiah

Disusun Oleh :

DEBY ANGGRYANI
B20016

PROGRAM STUDI D-III TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIS

POLITEKNIK MEDICA FARMA HUSADA
MATARAM
2022
 PERSETUJUAN PEMBIMBING

IDENTIFIKASI ESCHERICHIA COLI SUB TYPE ENTEROTOXIGENIC

(ETEC) DARI SAMPEL MAKANAN DENGAN TEKNIK PCR
(POLYMERASE CHAIN REACTION)

Proposla Karya Tulis Ilmiah

Disusun Oleh :

DEBY ANGGRYANI
NIM: B20016

Komisi Nama Tanda Tanggal

Pembimbing Tangan

Edy Kurniawan, S.Si., M.Pd

Pembimbing I
NIK : 36.085.2013.015
.................. …. Desember 2022

Dhika Juliana Sukmana, S.Si., M.Sc

Pembimbing II
NIK : 36.085.2019.072
.................. …. Desember 2022

Telah dinyatakan memenuhi syarat

pada tanggal, Desember 2022

Ketua Program Studi D-III Teknologi Laboratorium Medis

Politeknik Medica Farma Husada Mataram

Ika Nurfajri Mentari, S.ST., M.Kes

NIK : 36.085.2014.02

ii
 KATA PENGANTAR

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa yang
telah melimpahkan Rahmat dan Karunia-Nya sehingga penulis diberikan
kesehatan untuk dapat menyelesaikan Proposal Karya Tulis Ilmiah yang berjudul
“Identifikasi Bakteri Escherichia coli Sub Type Enterotoxigenic (ETEC) pada
sampel makanan dengan teknik PCR” dengan baik. Adapun tujuan penulisan
dalam menyelesaikan tugas akhir ini adalah sebagai salah satu persyaratan
akademis untuk menyelesaikan program studi D-III Teknologi Laboratorium
Medis di Politeknik Medica Farma Husada Mataram.
Dalam penyusunan Proposal Karya Tulis Ilmiah ini, banyak mendapatkan
bimbingan dan bantuan dari berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis
menyampaikan terimakasih kepada:
1. Bapak Dr. Syamsuriansyah, M.M,. M. Kes selaku Direktur Politeknik Medica
Farma Husada Mataram yang telah memberikan kesempatan untuk menimba
ilmu di Politeknik Medica Farma Husada Mataram.
2. Ibu apt Ajeng Dian Pertiwi, M.Farm. selaku Wakil Direktur I “Politeknik
Medica Farma Husada” Mataram.
3. Ibu Sri Rahmawati, S.Farm., M.Pd. selaku Wakil Direktur II “Politeknik
Medica Farma Husada” Mataram.
4. Dr. Alfisahrin, M.Si selaku Direktur III Politeknik “Medica Farma Husada”
Mataram.
5. Ibu Ika Nurfajri Mentari, S.ST., M.Kes Selaku Ketua Program Studi D-III
Teknologi Laboratorium Medik telah memberikan arahan dan masukan serta
dukungan selama penyusunan Karya Tulis Ilmiah ini.
6. Bapak Edy Kurniawan,S.Si., M.Pd selaku Dosen Pembimbing I yang telah
memberikan arahan dan masukan serta dukungan selama penyusunan Karya
Tulis Ilmiah ini.
7. Ibu Dhika Juliana Sukmana, S.Si., M.Sc selaku Dosen Pembibing II yang
telah memberikan arahan dan masukan serta dukungan selama penyususnan
karya Tulis Ilmiah ini.

iii
8. Teristimewa, kedua Orang Tua tercinta Bapak Ahyar dan Ibu Hadijah yang
telah memberikan motivasi dan semangat yang sangat luar biasa.
9. Segenap dosen dan seluruh civitas akademik Politeknik Medica Farma Husada
Mataram yang telah memberikan motivasi dan semangat.
Penulis menyadari bahwa dalam penulisan Proposal Karya Tulis Ilmiah ini
masih sangat jauh dari kesempurnaan. Oleh karena itu, penulis mengharapkan
kritik dan saran yang membangun, demi penyempurnaan Proposal Karya Tulis
Ilmiah ini.

Mataram, 2022

Deby Anggryani

iv
 DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ...................................................................................... i

PERSETUJUAN PEMBIMBING....................................................................................ii
KATA PENGANTAR......................................................................................................iii
DAFTAR ISI.......................................................................................................................v
BAB I PENDAHULUAN...................................................................................................1
A. Latar Belakang.......................................................................................................1
B. Rumusan Masalah..................................................................................................3
C. Tujuan Penelitian...................................................................................................3
D. Ruang Lingkup.......................................................................................................4
E. Manfaat Penelitian..................................................................................................4
BAB II TINJAUAN PUSTAKA........................................................................................5
A. Tinjauan Teori........................................................................................................5
B. Bakteri Escehrichia Coli........................................................................................6
C. Polymerase Chain Reaction (PCR)......................................................................11
D. Kerangka Konsep.................................................................................................15
BAB III METODE PENELITIAN.................................................................................16
A. Jenis Penelitian.....................................................................................................16
B. Tempat Dan Waktu Penelitian..............................................................................16
C. Variabel Penelitian...............................................................................................16
D. Populasi Dan Sampel...........................................................................................17
E. Instrumen Penelitian.............................................................................................18
F. Prosedur/Cara Kerja.............................................................................................19
G. Teknik Pengumpulan Data...................................................................................20
H. Alur Kerja............................................................................................................20
I. Analisis Data........................................................................................................20
DAFTAR PUSTAKA.......................................................................................................21

v
 BAB I
PENDAHULUAN

A. Latar Belakang
Makanan merupakan kebutuhan pokok yang penting bagi manusia.
Namun saat ini melalui makanan dapat menimbulkan masalah, salah satunya
adalah penyakit yang dapat disebarkan melalui makanan seperti diare atau
keracunan makanan. Penelitian yang dilakukan dibeberapa negara industri
menunjukkan lebih dari 60% food borne disease disebabkan karena buruknya
kemampuan penjamah makanan atau food handler untuk mengolah makanan
(Gitaswari & Budayanti, 2019).
Food borne disease yang umum dijumpai antara lain yaitu diare, typus,
kolera, dan sebagainya. Dari Data Dinas Kesehatan Kota Mataram,
masyarakat Kota Mataram khususnya Kecamatan Ampenan, Cakranegara, dan
Dasan Cermen bahkan diseluruh Kota Mataram terdapat 236 kasus diare dan
90% kasus diare disebabkan oleh mikroba (Dikes, 2009).
Salah satu bakteri patogen yang menjadi penyebab diare ialah bakteri
Esherichia Coli. Bakteri Escherichia coli, atau biasa disingkat E. coli adalah
salah satu spesies utama bakteri gram negatif umumnya merupakan flora
normal saluran pencernaan manusia dan hewan serta penting dalam
pencernaan makanan. Pada umumnya, bakteri yang ditemukan oleh Theodor
Escherich ini hidup pada tinja, dan dapat menyebabkan masalah kesehatan,
seperti diare, muntaber dan masalah pencernaan lainnya (Titiek, 2007).
Bakteri dan parasit lebih sering menyebabkan diare dibandingkan virus
di beberapa negara berkembang. Bakteri patogen tersering penyebab diare
adalah Escherichia coli, Shigella, Campylobacter dan Salmonella bersama
dengan Vibrio cholera. Diarrheagenic Escherichia coli (DEC) merupakan
penyebab diare tersering dan memiliki beberapa subtipe. Masing-masing
subtipe Esherichia coli yang dapat menyebabkab diare dilihat berdasarkan
faktor virulen spesifik dan fenotipnya. Subtipe DEC diantaranya adalah
Enterotoxigenic Esherichia coli (ETEC), Enteropatogenic Escherichia coli

1
(EPEC), Enteroinvasive Esheriachia coli (EIEC), Escherichia coli (EAEC),
Enterohemorrhagic Esherichia coli (EHEC) , diffusely adherent Esherichia
coli (DAEC) (Gitaswari & Budayanti, 2019).
Enterotoxigenic Esherichia coli (ETEC) adalah salah satu subtipe E.coli
yang menjadi penyebab diare pada traveler, Enteropatogenic Escherichia coli
(EPEC) yang tergolong jarang menyebabkan diare pada orang dewasa dan
sering menyerang anak-anak dibawah dua tahun, Enteroinvasive Esheriachia
coli (EIEC) sebagai penyebab diare yang disertai demam, Enteroaggregative
Escherichia coli (EAEC) sebagai penyebab watery diarrhea pada anak.
Enterohemorrhagic Esherichia coli (EHEC) sebagai penyebab diare berdarah,
hemorrhragic colitis berat,dan hemolytic uremic syndrome pada 6-8% kasus,
dan yang terakhir adalah diffusely adherent Esherichia coli (DAEC)
(Gitaswari & Budayanti, 2019)
Adanya beberapa tipe Esherichia coli yang sudah resisten terhadap
antibiotik menyebabkan pemilihan antibiotik merupakan hal yang krusial
mengingat beberapa komplikasi dapat ditimbulkan pada infeksi diarrhaegenic
Esherichia coli (DEC) seperti anemia hemolitik,trobositopenia, dan gagal
ginjal akut. Disamping itu, penggunaan antibiotik yang tidak tepat dapat
meningkatkan produksi toksin pada beberapa tipe dari DEC tersebut, seperti
pada peningkatan produksi shig-toxins (Stx) dapat memperburuk hemolytic
uremic syndrome (HUS) dan menimbulkan komplikasi. Prevalensi subtipe
Esherichia coli sebagai penyebab diare di berbagai daerah masih belum
diketahui secara pasti. Infeksi dengan beberapa tipe dari DEC dapat
menyebabkan akibat yang fatal terutama pada anak-anak dan usia lanjut
karena dapat menyebabkan beberapa komplikasi seperti hemolytic uremic
syndrome (HUS) dan hemorrhagic colitis (HC) (Gitaswari & Budayanti,
2019).
Identifikasi beberapa jenis DEC (diarrhaegenic Escherichia coli)
memiliki keuntungan dalam pengobatan bagi pasien diare dengan
menggunakan beberapa pemeriksaan molekuler, salah satunya adalah
Polymerase Chain Reaction (PCR). Melihat permasalahan tersebut, maka

2
 pengenalan subtipe yang saat ini mendominasi, penelitian ini hanya dilakukan
untuk mengidentifikasi satu subtipe dengan menggunakan metode PCR
unipleks. Subtipe Escherichia coli tersebut adalah tipe ETEC. Secara umum
PCR adalah teknologi canggih yang dapat mendeksi DNA dengan cara
amplifikasi DNA. Hasil pemeriksaan PCR dapat membantu untuk
menegakkan diagnosa sepanjang pemeriksaan tersebut dikerjakan dengan cara
yang benar dan sesuai dengan standar internasional. Keunggulan PCR
dikatakan sangat tinggi. Hal ini didasarkan atas spesifitas, efisiensi dan
keakuratannya. Masalah yang berkenaan dengan PCR yaitu biaya PCR yang
masih tergolong tinggi (Gitaswari & Budayanti, 2019).
Reaksi berantai polymerase (Polymerase Chain Reaction, PCR) adalah
suatu metode enzimatis untuk amplifikasi DNA dengan cara in vitro. PCR ini
pertama kali dikembangkan pada tahun 1985 oleh Kary B. Mullis. Amplifikasi
DNA pada PCR dapat dicapai bila menggunakan primer oligonukleotida
pendek yang berfungsi mengawali sintesis rantai DNA. PCR memungkinkan
dilakukannya pelipatgandaan suatu fragmen DNA. Umumnya primer yang
digunakan pada PCR terdiri dari 20-30 nukleotida. DNA template (cetakan)
yaitu fragmen DNA yang akan dilipatgandakan dan berasal dari patogen yang
terdapat dalam spesimen klinik. Enzim DNA polimerase merupakan enzim
termostabil Taq dari bakteri termofilik Thermus aquaticus.
Deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP) menempel pada ujung primer ketika
proses pemanjangan dan ion magnesium menstimulasi aktivasi polimerase
(Yusuf, 2010)
B. Rumusan Masalah
Apakah terdapat bakteri Esherichia coli sub type enterotoxigenic (ETEC)
dari sampel makanan ?
C. Tujuan Penelitian
Penelitian ini secara umum bertujuan mengetahui Escherichia coli sub
type enterotoxigenic (ETEC) dari sampel makanan.

3
D. Ruang Lingkup
Ruang lingkup penelitian ini adalah dibidang Bakteriologi dan Biologi
Molekuler tentang Identifikasi Esherichia coli sub type enterotoxigenic
(ETEC) dari sampel makanan dengan teknik PCR.
E. Manfaat Penelitian
1. Bagi Institusi dan Pendidikan
a. Menambah pengetahuan dan pengalaman dalam melakukan penelitian
terutama yang berkaitan dengan bidang Bakteriologi dan Biologi
Molekuler.
b. Menambah pengetahuan mengenai Identifikasi Escherichia coli sub
type enterotoxigenic (ETEC) dari sampel makanan dengan teknik
PCR.
c. Penelitian ini dapat dijadikan sebagai sumber referensi baru karya tulis
ilmiah.
2. Bagi Masyarakat
Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi kepada
masyarakat tentang Identifikasi Escherichia coli sub type enterotoxigenic
(ETEC) dari sampel makanan dengan teknik PCR.
3. Bagi Peneliti
Penelitian bermanfaat guna menambah pengetahuan tentang cara
pengujian bakteri Escherichia coli sub type enterotoxigenic (ETEC) dari
sampel makanan dengan teknik PCR.

4
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

A. Tinjauan Teori
1. Makanan
Makanan adalah bahan, biasanya berasal dari hewan atau
tumbuhan yang dimakan oleh makhluk hidup agar mendapatkan tenaga
dan nutrisi. Menurut Notoadmodjo, makanan berfungsi untuk memelihara
proses tubuh dalam pertumbuhan dan perkembangan serta mengganti
jaringan tubuh yang rusak, memperoleh energy untuk melakukan aktivitas
sehari hari, mengatur metabolisme dan berbagai keseimbangan air,
mineral, dan cairan tubuh terhadap berbagai penyakit yang lain juga
berperang didalam mekanisme pertahanan tubuh terhadap berbagai
penyakit (Amalia, 2017).
Makanan yang telah terkontaminasi sangat berbahaya dan tidak
aman untuk dikonsumsi karena dapat menyebabkan gangguan pencernaan,
seperti mual, muntah, diare, infeksi, bahkan keracunan. Beberapa
mikroorganisme dapat memproduksi toksin yang sangat berbahaya dan
dapat menyebabkan kematian, misalkan Clostridium botulinum dan
Clostridium perfringens (Amalia, 2017).
Makanan yang sehat adalah makanan hygiene yang tidak
mengandung kuman penyakit dan tidak mengandung racun yang dapat
membahayakan kesehatan. Oleh karena itu, untuk menghindari
terkontaminasinya makanan olahan, perilaku higienis dalam pengolahan
makanan sangat penting. Perilaku higienis dapat diartikan sebagai perilaku
yang bertujuan untuk mencegah atau meminimalisir terkontaminasinya
makanan oleh mikroorganisme. Dengan demikian dapat diketahui bahwa
makanan higienis adalah makanan yang bebas dari mikroorganisme
penyebab penyakit, baik dari proses pengolahan hingga penghidangannya
(Tuhu, 2010).

5
 2. Penjamah
Penjamah adalah seorang tenaga kerja yang menjamah mulai dari
persiapan, mengolah, dan menyimpan, mengangkut maupun dalam
penyajian makanan. Pengetahuan, sikap dan tindakan seorang penjamah
mempengaruhi kualitas makanan yang disajikan penjamah yang sedang
flu, diare dan demam sebaiknya tidak dilibatkan dulu dalam proses
pengolahan makanan. Jika terjadi lika, penjamah harus menutup luka
dengan pelindung kedap air misalnya, plester atau sarung tangan plastic
(Widyastuti dan Nurdyansyah, 2017).
Sayarat-syarat penjamah (Depkes, 2003):
a. Menjaga kebersihan rambut, tangan, kuku, dan pakaian. Memakai
tutup kepala dan celemek.
b. Mencuci tangan setiap kali menangani makanan atau minuman.
c. Menjamah makanan atau minuman harus memakai alat/perlengkapan
atau dengan alas tangan.
d. Tidak merokok dan menggaruk badan.
e. Tidak bercakap-cakap saat mengolah makanan dan minuman.
f. Mencuci tangan setiap mengolah makanan dan minuman.
B. Bakteri Escehrichia Coli
1. Bakteri Escherichia coli
Bakteri Escherichia coli, atau biasa disingkat E.coli adalah salah
satu spesies utama bakteri gram negative umumnya merupakan flora
normal saluran pencernaan manusia dan hewan serta penting dalam
pencemaran makanan. Pada umumnya, bakteri yang ditemukan oleh
Theodor Escherichia ini hidup pada tinja, dan dapat menyebabkan masalah
kesehatan, seperti diare, muntaber dan masalah pencernaan lainnya
(Titiek, 2007).

6
2. Klasifikasi Escherichia Coli
Kerajaan : Bacteria
Filum : Proteobacteria
Kelas : Gama proteobacteria
Family : Enterobacteriaceae
Genus : Eschechia
Species : E.coli
Ordo : Enterobacteriales (Sanger dan Post, 2005).
3. Etiologi Dan Patheogenesis
E.coli sebagai agen yang dihubungkan dengan gastroenteritis anak.
Karena sifat organisme E.coli yang dearegenik. Mekanisme bagaimana
E.coli menimbulkan diare khas melibatkan perletakan organisme pada
reseptor glikoprotein atau glikolipid, di besertai dengan produksi beberapa
bahan beracun yang menjejas sel-sel usus atau mengganggu fungsi usus.
Gen untuk sifat-sifat virulens dan untuk resisten antibiotik sering
ditentukan plasmid atau bakteriofaq yang dapat dipindahkan (Jawetz dkk,
2005).
4. Klasifikasi E. Coli berdasarkan sifat-sifat virulensinya :
a. E. coli Enteropatogenic (EPEC)
Adalah penyebab penting diare pada bayi, khususnya dinegara
berkembang dan tidak membahayakan pada sebagian orang dewasa.
Mungkin ditularkan melalui air yang digunakan mencuci botol.
Karenanya, botol susu bayi sebaiknya direbus dahulu setelah dicuci
untuk mencegah diare. EPEC melekat pada sel mukosa usus kecil.
Akibat dari infeksi EPEC adalah diare cair, yang biasanya sendiri
tetapi juga menjadi kronik. Masa inkubasinya 8-24 jam dengan rata-
rata-rata 11 jam. Gejala yang dapat ditimbulkan apabila terinfeksi E.
Coli jenis ini antara lain : panas dingin, sakit kepala, kram usus, diare
berair (Whittein, 2011).

7
b. E. coli Enteroinvasif (EIEC)
E. coli ini berperilaku seperti Shigella dalam kapasitasnya
menginvasi epitel usus dan menghasilkan penyakit seperti disentri.
EIEC melekat pada dan menginvasi epitel usus. Perilaku seperti
Shigella ini terjadi karena E. coli ini memiliki virulensi plasmid besar
yang sangat terkait dengan plasmid yang membantu Shigella, dengan
sifat invasinya. Seperti pada Shigella, sekelompok kecil polipeptida
yang dikode pada plasmid ini adalah penting untuk invasi epitel
menyebabkan kematian sel dan respons radang cepat ( secara klinis
dikenali sebagai kolitis ) (Radji, 2011).
c. E. coli Enterotoksigenic (ETEC)
Adalah penyebab yang sering dari diare wisatawan dan sangat
penting menyebabkan diare pada bayi dinegara berkembang. Faktor
kolonisasi ETEC yang spesifik untuk manusia menimbulkan peletakan
ETEC pada sel epitel usus kecil. Beberapa strain ETEC menghasilkan
eksotoksin tidak tahan panas. Orang-orang yang tinggal didaerah
pinggiran dimana organismen semacam ini (LT), umumnya memiliki
anti bodi dan jarang mengalami pemaparan kembali E. coli penghasil
LT. sedangkan ETEC menghasilkan enterotoksin tahan panas (STa)
dapat menimbulkan diare yang berat. Masa inkubasinya 8-44 jam
dengan rata-rata 26 jam. Gejala yang ditimbulkan apabila terinfeksi E.
coli jenis ini antara lain diare, muntah-muntah,dehigrasi, shock (Radji,
2011).
d. E. coli Enterohemoragik (EHEC)
Bakteri yang sangat berbahaya karena bakteri ini hidup dalam
daging mentah, pada air limbah rumah ayam potong. Menghasilkan
verotoksin yaitu suatu sel ginjal dari monyet hijau Afrika. Bentuk
diare sangat berat dengan sindroma uremia hemolitik, suatu penyakit
akibat gagal ginjal akut, anemia hemolitik mikriangioptik, dan
trombositopenia. Banyak kasus kolitis hemoragik dan komplikasinya
dapat dicegah dengan memasak daging sapi sampai matang.

8
 e. E. Coli Enteroagregatik (EAEC)
Menyebabkan diare akut dan kronik pada masyarakat sedang
berkembang. Bakteri ini ditandai dengan pola khas pelekatannya pada
sel manusia. Bahaya terbesar sehubungan dengan air minum tersebut
telah tercemar oleh buangan atau kotoran manusia atau hewan (Radji,
2011).
5. Epidemiologi
Di negara yang sedang berkembang berbagai serogrup diaregenik
E. coli sering menyebabkan infeksi pada usia beberapa tahun pertama.
Frekuensi penyakit ini bertambah selama bulan-bulan panas dalam daerah
beriklim sedang dan selama bulan-bulan musim penghujan di daerah
beriklim tropis. Kebanyakan strain E. coli (kecuali EHEC dan mungkin
beberapa EPEC) memerlukan inoculum organisme yang besar untuk
menimbulkan penyakit ; penyebaran dari orang ke orang tidak khas, tetapi
penyakit yang di sebarkan makanan atau air lazim. Infeksi paling mungkin
terjadi bila pengolahan makanan atau praktek-praktek pembuangan
sampah suboptimal. Organisme EHEC dan EPEC ditularkan dari orang ke
orang juga melalui makanan, memberi kesan bahwa penelanan sejumlah
organisme yang lebih sedikit ini cukup untuk menimbulkan penyakit.
Hamburger yang kurang dimasak merupakan penyebab yang paling sering
ledakan serangan EHEC yang disebarkan makanan (Radji, 2011).
6. Faktor yang mempengaruhi pertumbuhan Escherichia Coli
Kemampuan mikroorganisme untuk tumbuh dan tetap hidup
merupakan hal yang penting dalam ekosistem pangan. Suatu pengetahuan
dan pengertian tentang faktor yang mempengaruhi kemampuan tersebut
sangat penting untuk mengendalikan hubungan antara mikroorganisme,
makanan, dan manusia (Radji, 2011).
Beberapa faktor utama yang mempengaruhi pertumbuhan E. coli
meliputi suhu, aktivitas air, PH, dan Ketersediaan Oksigen (Suardana, I.
W, 2009)

9
a. Suhu
Suhu sangat mempengaruhi pertumbuhan suatu spesies bakteri.
Bakteri dapat digolongkan menjadi 3 kelompok berdasarkan suhu
yaitu psikrofilik, mesofilik, dan termofilik. Sebagian besar bakteri
adalah mesofilik dengan suhu optimal untuk berbagai bentuk yang
hidup bebas sebesar 30℃. Suhu selain berpengaruh pada laju
pertumbuhan juga dapat membunuh mikroorganisme jika terlalu
ekstrim, E. coli dapat tumbuh pada range temperatur 10℃-40℃
dengan suhu optimum untuk pertumbuhannya adalah 37℃. E. coli
dapat mati dengan pemasakan makanan pada temperatur 70℃ (World
Health Organinization, 2005).
b. Aktivitas
Semua organisme membutuhkan air untuk kehidupannya. Air
berperan dalam reaksi metabolic dalam sel dan keluar sel. Semua
kegiatan ini membutuhkan air dalam bentuk cair dan apabila air
tersebut mengalami kristalisasi dan membentuk es atau terikat secara
kimiawi dalam larutan gula atau garam, maka air tersebut tidak dapat
digunakan oleh mikroorganisme. Air murni mempunyai Jenis
mikroorganisme yang berbeda membutuhkan jumlah air yang berbeda
pula untuk pertumbuhannya. Bakteri umumnya tumbuh dan
berkembang biak hanya dalam media dengan aktivitas air tinggi
(Suardana dan Swacita, 2009: 27). E. coli dapat berkembang biak pada
makanan dengan nilai aktivitas air minium 0,95 (World Health
Organinization, 2005).
c. pH
Derajat keasaman (pH) optimal secara empirik harus
ditentukan untuk masing-masing spesies. Berdasarkan derajat
keasaman, bakteri dapat dibagi menjadi 3 kelompok yaitu netrofilik
(Ph 6,0-8,0), asidofilik (pH optimal serendah 3,0), dan alkalofilik (pH
optimal setinggi 10,5). Akan tetapi sebgian besar organisme tumbuh
dengan baik pada pH 6,0-8,0 (netrofilik), E. coli dapat hidup di

10
 lingkungan makanan yang asam pada pH dibawah 4,4 (World Health
Organinization, 2005).
d. Ketersediaan oksigen
Pertumbuhan bakteri juga dipengaruhi oleh gas-gas utama
salah satunya adalah oksigen. Berdasarkan kebutuhan terhadap
oksigen, bakteri dapat dikelompokkan menjadi 4 yaitu aerobic (bakteri
memerlukan oksigen), anaerobic (bakteri tidak memerlukan oksigen),
anaerob fakultatif (bakteri dapat tumbuh pada keadaan aerob dan
anaerob), dan anaerob obligat (bakteri dapat tumbuh dengan baik pada
keadaaan sedikit oksigen). Berdasarkan kebutuhan oksigen, E. coli
termasuk bakteri gram negative yang bersifat anaerob fakultatif
sehingga E. coli yang muncul didaerah infeksi seperti abses abdomen
dengan cepat mengonsumsi seluruh persediaan oksigen dan mengubah
metabolisme anaerob, menghasilkan lingkungan yang anaerob dan
menyebabkan bakteri anaerob yang muncul dapat tumbuh dan
menimbulkan penyakit (Jawetz, 2005).
C. Polymerase Chain Reaction (PCR)
PCR (Polymerase Chain Reaction) adalah suatu metode enzimatis untuk
amplifikasi DNA dengan cara in vitro. Pada proses PCR diperlukan beberapa
komponen utama, yaitu DNA cetakan, Oligonukleotida primer,
Deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP), Enzim DNA polimerase, dan
komponen pendukung lain adalah senyawa buffer. Pada proses PCR
menggunakan alat termosiklus. Sebuah mesin yang memiliki kemampuan
untuk memanaskan sekaligus mendinginkan tabung reaksi dan mengatur
temperature untuk tiap tahapan reaksi. Ada tiga tahapan penting dalam proses
PCR yang selalu terulang dalam 30-40 siklus dan berlangsung dengan cepat
yaitu denaturasi, anneling, dan pemanjangan untai DNA. Produk PCR dapat
diidentifikasi melalui ukurannya dengan menggunakan elektroforesis gel
agarosa. Teknik PCR dapat dibagi kedalam beberapa jenis diantaranya : PCR-
RFLP, PCR-RAPD, nested-PCR, Quantintative-PCR, RT-PCR dan inverse-

11
PCR. Keunggulan PCR dikatakan sangat tinggi. Hal ini didasarkan atas
spesifitas, efisiensi dan keakuratannya.
Adapun penjelasan mengenai jenis PCR yaitu sebagai berikut :
1. Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLG); metode ini
digunakan untuk membedakan organisme berdasarkan analisis model
derifat dari perbedaan DNA.
2. Inverse-PCR, metode ini digunakan ketika hanya satu sekuen internal
yang diketahui. Template didigensi dengan enzim restriksi yang
memotong bagian luar daerah yang akan diamplifikasi, fragmen retriksi
yang dihasilkan ditempelkan dengan ligase dan amplifikasi dengan
menggunakan sekuen primer yang memiliki titik ujung yang memiliki
jarak yang jauh satu sama lain dengan segmen eksternal yang telah
tergabung. Metode ini khusus dingunakan untuk mengidentifikasi “sekuen
antara” dari beragam gen.
3. Nested-PCR, proses ini memungkinkan untuk mengurangi kontaminasi
pada produk selama amplifikasi dari penyatuan primer yang tidak
diperlukan. Dua set primer digunakan untuk mendukung metode ini, set
kedua mengamplifikasi target kedua selama proses pertama berlangsung.
Sekuens DNA target dari satu set primer yang disebut primer inner
disimpan di antara sekuens target set kedua dari primer yang disebut
sebagai outer primer. Pada prakteknya, reaksi pertama dari PCR
menggunakan outer primer, maka reaksi PCR kedua dilakukan dengan
inner primer atau nested primer menggunakan hasil dari produk reaksi
yang pertama sebagai target amplifikasi. Nestad primer akan menyatu
dengan produk PCR yang pertama dan menghasilkan produk yang lebih
pendek daripada produk yang pertama.
4. Quantitative-PCR; digunakan untuk pengukuran berulang dari hasil
produk PCR. Metode ini secara tidak langsung digunakan untuk mengukur
kuantitas, dimulai dari jumlah DNA, cDNA, atau RNA. Hasil dari metode
ini juga menampilkan copy dari sampel.

12
5. Reverse Transcriptase (RT-PCR); metode ini digunakan untuk
amplifikasi, isolasi atau identifikasi sekuen dari sel atau jaringan RNA.
Metode ini dibantu oleh reverse transciptase (mengubah RNA menjadi
cDNA), mencakup pemetaan, menggabarkan kapan dan dimana gen
diekspresikan.
6. Random Amplified polymorphic DNA (RAPD) bertujuan untuk mendeteksi
polimorfisme pada tingkat DNA. Metode ini dikembangkan oleh welsh
and Mc Clelland (1990) dengan cara mengkombinasikan teknik PCR
menggunakan primer – primer dengan sekuens acak untuk keperluan
amplifikasi lokus acak dari genom.
Ada tiga tahapan penting dalam proses PCR yang selalu terulang dalam 30-40
siklus dan berlangsung dengan cepat :
1) Denaturasi
Di dalam proses PCR, denaturasi awal dilakukan sebelum enzim
taq polymerase ditambahkan ke dalam tabung reaksi. Denaturasi DNA
merupakan proses pembentukan DNA untai tunggal. Ini biasanya
berlangsung selama 3 menit, untuk meyakinkan bahwa molekul DNA
terdenaturasi menjadi DNA untai tunggal. Denaturasi yang tidak lengkap
mengakibatkan DNA mengalami renaturasi (membentuk DNA untai
ganda lagi) secara cepat, dan ini mengakibatkan gagalnya proses PCR.
Adapun waktu denaturasi yang terlalu lama dapat mengurangi aktifitas
enzim taq polymerase. Aktifitas enzim tersebut mempunyai waktu paruh
lebih dari 2 jam, 40 menit, 5 menit masing-masing pada suhu 92,5 ; 95 dan
97,5℃.
2) Anneling (penempelan primer)
Kriteria yang umum digunakan untuk merancang primer yang baik
adalah bahwa primer sebaiknya berukuran 18 – 25 basa, mengandung 50 –
60 % G=C dan untuk kedua primer tersebut sebaiknya sama. Sekuens
DNA dalam masing-masing primer itu sendiri juga sebaiknya tidak saling
berkomplemen, karena hal ini akan mengakibatkan terbentuknya struktur
sekunder pada primer tersebut dan mengurangi efisiensi PCR.

13
 Waktu annealing yang biasa digunakan dalam PCR adalah 30 – 45
detik. Semakin panjang ukuran primer, semakin tinggi temperaturnya.
Kisaran temperatur penempelan yang digunakan adalah antara 36℃
sampai dengan 72℃, namun suhu yang biasa dilakukan itu adalah antara
50 – 60℃.
3) Pemanjangan primer (Extention)
Selama tahap ini Taq polymerase memulai aktiviasnya
memperpanjang DNA primer dari ujung 3. Kecepatan penyusunan
nukleotida oleh enzim tersebut pada suhu 72℃ diperkirakan 35 – 100
nukleotida/detik, bergantung pada buffer, pH, konsentrasi garam dan
molekul DNA target. Dengan demikian untuk produk PCR dengan
panjang 2000 pasang basa, waktu 1 menit sudah lebih dari cukup untuk
tahap perpanjangan primer ini. Biasanya di akhiri siklus PCR waktu yang
digunakan untuk tahap ini diperpanjang sampai 5 menit sehingga seluruh
produk PCR diharapkan terbentuk DNA untai ganda.
Reaksi-reaksi tersebut di atas diulangi lagi dari 25 – 30 kali
(siklus) sehingga pada akhir siklus akan diperoleh moleku-molekul DNA
rantai ganda yang baru yang merupakan hasil polymerase dalam jumlah
yang jauh lebih banyak dibandingkan dengan jumlah DNA cetakan yang
digunakan. Banyaknya siklus amplifikasi tergantung pada konsentrasi
DNA target dalam campuran reaksi.
Produk PCR dapat diidentifikasi melalui ukurannya dengan
menggunakan elektroforesis gel agarosa. Metode ini terdiri atas
menginjeksi DNA dalam gel agarosa. Metode ini terdiri atas menginjeksi
DNA ke dalam gel agarosa dan menyatukan gel agarosa dan menyatukan
gel tersebut dengan listrik. Hasilnya untai DNA kecil pindah dengan cepat
dan untai yang besar dantara gel menunjukkan hasil positif.
4) Elektroforesis
Elektroforesis adalah suatu cara analisis kimiawi yang didasarkan pada
pergerakan molekul-molekul protein bermuatan di dalam medan listrik
(titik isoelektrik). Pergerakan molekul dalam medan listrik dipengaruhi

14
oleh bentuk, ukuran, besar muatan dan sifat kimia dari molekul (Rostini &
Rita, 2018). Pemisahan dilakukan berdasarkan perbedaan ukuran berat
molekul dan muatan listrik yang dikandung oleh molekul-molekul
tersebut. Bila arus listrik dialirkan pada suatu medium penyangga yang
telah berisi protein plasma maka komponen-komponen protein tersebut
akan mulai bermigrasi (Rostini & Rita, 2018).

15
D. Kerangka Konsep
Adapun kerangka konsep penelitian dapat dilihat pada gambar dibawah ini.

Makanan
Faktor-Faktor

- Higienitas
Kontaminasi Mikroba - Food Handler
- Penjamah
- Pertumbuhan
E. coli
E.Coli

PCR

EPEC EIEC ETEC EHEC EAEC

Hasil

Keterangan:
: Diteliti

: Tidak Diteliti

16
 BAB III
METODE PENELITIAN
A. Jenis Penelitian
Jenis penelitian ini merupakan penelitian deskriptif eksploratif
menggunakan PCR (polymerase chain reaction) di bagian lain. penelitian ini
menggunakan PCR konvensional, merupakan suatu metode biologi molekuler
berbasis reaksi rantai polimerase.
B. Tempat Dan Waktu Penelitian
Adapun tempat dan waktu penelitian adalah sebagai berikut:
1. Waktu penelitian
Penelitian dilakukan pada bulan Januari 2023
2. Tempat penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium RSUD Provinsi NTB
C. Variabel Penelitian
1. Variabel penelitian :
a. Variabel Bebas adalah variabel yang mempengaruhi atau menjadi
sebab perubahannya atau timbulnya variabel terikat (dependen)
(Sugiyono, 2015).
Variabel bebas penelitian ini adalah sampel makanan yang positif E.
coli.
b. Variabel Terikat adalah variabel yang dipengaruhi yang menjadi
akibat, karena variabel bebas (Sugiyono, 2015).
Variabel terikat penelitian ini adalah menentukan serotype/subtype
ETEC dengan Teknik PCR (Polymerase Chain Reaction).
2. Definisi operasional :
a. PCR (Polymerase Chain Reaction) adalah teknologi canggih yang
dapat mendeteksi DNA dengan cara amplifikasi DNA. Teknik
amplifikasi DNA untuk mendeteksi ETEC.
b. Bakteri Escherichia coli adalah bakteri gram negatif nominal family
enterobacteriaceae yang diidentifikasi melalui sampel makanan,
Makanan positif yang terkontaminasi E. coli.

17
 c. E. coli Subtype Enterotoxigenic (ETEC) adalah bakteri paling sering
penyebab diare.
D. Populasi Dan Sampel
1. Populasi

Menurut Bungin (2013) populasi penelitian merupakan

keseluruhan (universal) dari objek penelitian yang dapat berupa manusia,
hewan, tumbuh-tumbuhan, udara, gejala, peristiwa, sikap hidup, dan
sebagainya. Sedangkan menurut Sugiyono (2014: 115) bahwa “ populasi
adalah wilayah generalisasi yang terjadi atas objeksubjek yang mempunyai
kualitas dan karakteristik tertentu yang diterapkan oleh peneliti untuk
dipelajari dan kemudian ditarik kesimpulannya. Populasi pada penelitian
ini adalah pada makanan yang terkontaminasi oleh bakteri.

2. Sampel

Sampel adalah sebagian dari populasi yang akan diteliti (Burhan

Bungin, 2013). Menurut Sugiyono (2014:116), definisi sampel yaitu
sebagai berikut, “sampel adalah bagian dari jumlah dan karakteristik yang
dimilki oleh populasi tersebut”. Dari pengertian tersebut dapat
disimpulkan bahwa Sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah
pada sampel makanan yang positif mengandung bakteri Escherichia coli.
E. Instrumen Penelitian
Instrumen penelitian merupakan alat-alat yang digunakan untuk
mengumpulkan data (Notoatmodjo, 2010).
1. Alat :
Alat yang di butuhkan dalam proses PCR (Polymerase Chain
Reaction) adalah, Seperangkat alat PCR (Biometra T-Personal),
Elektroforesis (Biometra T-Personal), Kit isolasi DNA bakteri, (Geneaid),
Primer set (untuk bakteri), 1xMaster Mix untuk amplifikasi DNA
(Bioline), Mikropipet (Ecopipette), Ultrasentrifugate, Freezer, APD
lengkap (Masker, Sarung Tangan, Jas Lab, Nurse Cap/Penutup Kepala).

18
 2. Bahan :
Kemudian bahan yang di perlukan yaitu, Sampel bakteri
Escherichia coli (yang ditemukan), Aquades, Etanol 70% antibiotic
ciprofloxacin, ddH20, Gel agarose, TBE buffer, Loading dye dan etidium
bromide (EtBr).
F. Prosedur/Cara Kerja
a. Pengambilan Koloni dan Isolasi DNA
Sampel dalam bentuk padat dilakukan striking 4 kuadran pada plate
Mac Conkey (MC), dikultur dalam waktu 18-24 jam pada suhu 37 ℃.
Sampel kemudian dikonfirmasi dengan pengecatan gram, uji katalase, dan
uji biokimia, lalu dimasukkan kedalam Phosphate Buffer Saline (PBS).
Isolasi DNA dilakukan dengan metode boiling selama 10 menit sejumlah
10 mL yang sudah dilarutkan dengan buffer TE pada suhu 99℃.
Selanjutnya suspense disentrifugasi selama 1 menit dengan kecepatan
8000 rpm untuk didapatkan DNA murni. DNA disimpan dalam suhu -
20℃ digunakan sebagai template pada PCR. (Gitaswari & Budayanti,
2019).
b. Polymerase Chain Reaction (PCR)
Polymerase Chain Reaction (PCR) dilakukan menggunakan mesin
PCR combi block (whatman biometra Germany). Prosesnya meliputi 3
tahap meliputi yaitu denaturasi, annealing dan ekstensi (elongasi). Proses
ini dikerjakan pada sampel DNA genomik bakteri yang telah
diisolasi.DNA murni dimasukkan dalam program PCR dengan mencampur
ReadyMix dan taq polymerase dengan primer ETEC sebagai produk PCR.
Mendeteksi gen ETEC dengan produk gen LT menggunakan Primer elt
Forward: 5’ –ACG GCG TTA CTA TCC TCT C-3’ & Reverse: 5’ TGG
TCT CGG TCA GAT ATG TG-3’. (Gitaswari & Budayanti, 2019).
Suhu annealing yang ditetapkan adalah 55℃. Volume reaksi akhir
sebanyak 10µL mengandung 0,8µL template DNA, MasterMix Kappa
Biosystem 5µL, H20 3,2µL, primer forward 0,5µL dan primer Reverse
0,5µL (Gitaswari & Budayanti, 2019).

19
 c. Elektroforesis
Masing-masing 2 µL produk PCR diambil untuk elektroforesis dengan
tegangan listrik 50 volt selama 60 menit. Gambaran hasil dibaca dengan
Gel-Doc Bio-Rad. (Gitaswari & Budayanti, 2019).
G. Teknik Pengambilan Sampel
Purposive sampling atau purposive examining menurut (sugiyono
2016:148) adalah teknik penentuan sampel penelitian dengan pertimbangan
tertentu yang bertujuan agar informasi yang diperoleh lebih representative.
H. Teknik Pengumpulan Data
Data dalam penelitian ini merupakan data primer yaitu penelitian langsung
untuk mengetahui Escherichia coli sub type enterotoxigenic (ETEC) dari
sampel makanan. Data primer adalah data yang diperoleh atau dikumpulkan
langsung di lapangan oleh orang yang melakukan penelitian atau yang
bersangkutan yang memerlukan.

20
I. Alur Kerja
Isolasi Bakteri E. coli

Seleksi Bakteri E. coli

berdasarkan karakteristik
morfologi koloni

Identifikasi Bakteri E. coli

dengan Teknik PCR
(Polymerase Chain Reaction)
dan Elektroforesis untuk
menentukan ada atau tidaknya
bakteri E. coli enterotoxigenic
(ETEC)

Hasil Isolat Bakteri E. coli yang

Teridintifikasi

J. Analisis Data
Analisis data penelitian ini menggunakan analisis data kualitatif. Analisa
kualitatif yaitu dengan cara mengindetifikasi jenis isolat bakteri E. coli.
Sebelum dianalisis, sebelumnya akan diuji apakah data memenuhi persyaratan
asumsi, yaitu asumsi normalitas data.

21
 DAFTAR PUSTAKA

Amalia, W. . (2017). Analisis Sistem Pengelenggaraan Makanan Dan Hubungan

Asupan Energi Dan Zat Gizi Makro Dengan Status Gizi Pada Santri Di
Pondok Pesantren Daarul Rahman. Skripsi Program Studi Ilmu Gizi
Fakultas Ilmu-Ilmu Kesehatan Universitas Esa.
Depkes. (2003). Tentang Pedoman Persyaratan Hygiene Sanitasi Makanan
Jajanan.
Dikes. (2009). Tentang Penderita Penyakit Diare Dikota Mataram Meningkat.
Gitaswari, D. A. I., & Budayanti, S. (2019). IDENTIFIKASI SUBTIPE
Enterotoxigenic Escherichia coli DAN Enteroaggregative Escherichia coli
DARI SPESIMEN USAP DUBUR PENJAMAH MAKANAN DI
DENPASAR MENGGUNAKAN POLYMERASE CHAIN REACTION. E-
Jurnal Medika Udayana, 8(1), 7. https://doi.org/10.24922/eum.v8i1.45223
Radji, M. (2011). Deteksi Cepat Bakteri Escerichia Coli Dalam Sampel Air
Dengan Metode Polymerase Chain Reaction Menggunakan Primer 16E1 Dan
16E2. Makara, Sains, 14(1), 39–43.
Rostini, T., & Rita, C. (2018). Elektroforesis Protein Serum Pasien Dengan Kadar
Protein Normal. Indonesian Journal of Clinical Pathology and Medical
Laboratory, 15(3), 87. https://doi.org/10.24293/ijcpml.v15i3.962
sanger dan post. (2005). Praktek Pengolahan Pangan Yang Baik, Pelatihan
Pengendalian Mutu Dan Keamanan Pangan Bagi Pengajar, Kerjasama
Pusat Study Pangan Dan Gizi IPB Dengan Dikjen DIKTI, Departemen
Pendidikan Dan Kebudayaan.
Suardana, I. W, dan I. B. N. S. (2009). Higien Makanan.Kajian Teori Dan
Prinsip Dasar.
Sugiyono. (2015). Metode_Penelitian_Pendidikan_Sugiyono_20.pdf.

22
Titiek. (2007). Cemaran Mikroba Pada Produk Pertanian, Penyakit Yang
Ditimbulkan dan Pencegahannya. Jurnal Litbang Pertanian, 26(2).
Tuhu, N. (2010). Kemajuan Tekhnologi Dan Pola Hidup Manusia Dalam
Prespektif Social Budaya. Jurnal Perkembangan Pendidikan:Fondasi Dan
Amplikasi, 2(1), 34–35.
Whittein. (2011). Mikrobiologi Dasar Edisi Kelima Jilid 2.
Widyastuti dan Nurdyansyah. (2017). Pentingnya Hygiene Penjamah Makanan.
World Health Organinization. (2005). WORLD HEALTH ORGANIZATON.
Yusuf, Z. K. (2010). Polymerase Chain Reaction (PCR). Clinical Veterinary
Advisor: The Horse, 953. https://doi.org/10.3109/9780203997352.211

23