Subscribe to DeepL Pro to translate larger documents.

Visit 60:501-510
Hortikultura, Lingkungan, dan Bioteknologi (2019) www.DeepL.com/pro for more information.

https://doi.org/10.1007/s13580-019-00150-8

LAPORAN PENELITIAN

Modifikasi metode kriopreservasi droplet-vitrifikasi untuk

meningkatkan tingkat kelangsungan hidup akar adventif Panax
ginseng
Kim-Cuong Le1 - Haeng-Hoon Kim2 - So-Young Park1

Diterima: 18 Januari 2019 / Direvisi: 23 April 2019 / Diterima: 30 April 2019 / Dipublikasikan secara online: 8 Juli 2019
© Masyarakat Ilmu Hortikultura Korea 2019

Abstrak
Panax ginseng Meyer adalah tanaman obat penting yang menghasilkan senyawa bioaktif. Metode vitrifikasi tetesan
dikembangkan untuk kriopreservasi kultur akar adventif ginseng gunung, dan variasi prosedur ini diuji untuk menentukan
efeknya pada tingkat pertumbuhan kembali dan respons stres osmotik. Laju pertumbuhan kembali akar diperiksa setelah
mengekspos segmen akar pada dua perlakuan pra-kultur, tiga larutan pemuatan, dan dua larutan vitrifikasi dengan periode
pemaparan yang berbeda. Segmen eksplan akar adventif yang dipotong pada pra-kultur dengan 0,3 M sukrosa
menghasilkan tingkat pertumbuhan kembali tertinggi setelah kriopreservasi. Pemuatan selama 20 menit dengan 17,5%
(b/v) sukrosa dan 17,5% (b/v) gliserol pada suhu kamar meningkatkan laju pertumbuhan kembali akar adventif yang
diawetkan secara kriopreservasi empat kali lipat, dibandingkan dengan sampel yang tidak dimuat. Perlakuan yang melibatkan
larutan vitrifikasi yang berbeda dan periode pemaparan dibandingkan, dan tingkat pertumbuhan kembali tertinggi (15%)
setelah kriopreservasi dicapai dengan menginkubasi akar adventif dalam larutan vitrifikasi tanaman yang dimodifikasi 3
yang mengandung 40% (b/v) gliserol dan 40% (b/v) sukrosa selama 10 menit pada suhu kamar, yang menunjukkan bahwa
ujung akar adventif ginseng peka terhadap tekanan osmotik. Studi lebih lanjut diperlukan untuk mengembangkan solusi
vitrifikasi yang optimal yang meningkatkan tingkat kelangsungan hidup akar adventif ginseng gunung yang diawetkan
secara kriopreservasi.

Kata kunci Akar adventif - Kriopreservasi - Vitrifikasi tetesan - Panax ginseng - Konservasi jangka panjang - Vitrifikasi

1 Pendahuluan 1 Departemen Ilmu Hortikultura, Divisi Ilmu Hewan,

Hortikultura dan Pangan, Universitas Nasional Chungbuk,
Panax ginseng Meyer, umumnya dikenal sebagai ginseng, Cheongju 28466, Republik Korea
adalah tanaman obat yang penting (Lee 1998). Ginseng 2 Departemen Sumber Daya Kesejahteraan ,
digunakan dalam pengobatan tradisional di banyak negara Universitas Nasional Sunchon, Suncheon, Jeonnam 57922,
Republik Korea
Asia karena aktivitas farmakologisnya yang beragam, yang
meliputi efek anti-tumor, anti-diabetes, anti-penuaan, dan
anti-stres (Xie et al. 2006; Lü et al. 2009). Lebih dari 150
ginsenosides, senyawa bioaktif utama yang diproduksi oleh
tanaman ini, telah diisolasi dari ginseng. Senyawa-senyawa
ini diklasifikasikan menjadi

Dikomunikasikan oleh Inhwa Yeam.

🖂 So-Young Park
soypark7@cbnu.ac.kr

13
502 Hortikultura, Lingkungan, dan Bioteknologi (2019) 60:501-510

kelompok protopanaxadiol, protopanaxatriol, dan asam

oleanolik, berdasarkan strukturnya (Christensen 2008).
Telah ada uji coba skala pilot yang berhasil untuk
produksi komersial ginsenosides dari kultur akar adventif
(Hahn et al. 2003). Sejumlah penelitian terbaru berfokus
pada pengembangan jalur akar adventif baru yang
meningkatkan produksi ginsenosida (Kim et al. 2013).
Namun, memelihara kultur akar adventif dan jalur akar
baru yang dikembangkan dalam uji coba skala pilot
mungkin sulit, dan menimbulkan risiko kehilangan kultur
akibat kontaminasi; selain itu, kultur jangka panjang dapat
mengubah produksi senyawa bioaktif, yang mengarah
pada perubahan kualitas dan kuantitas metabolit (Kiselev
dkk. 2011; Fu dkk. 2012; Turgut-Kara dan Kahraman
2015). Oleh karena itu, kriopreservasi untuk menyimpan
bahan biologis dalam nitrogen cair pada suhu sangat rendah
(-196°C) sangat direkomendasikan, meskipun mahal
untuk penyimpanan jangka panjang (Engelmann dan
Dussert 2013; Kulus dan Zalewska 2014). Dalam
beberapa dekade terakhir, berbagai jenis kultur akar
berbulu obat telah berhasil dikriopreservasi dengan teknik
enkapsulasi-dehidrasi Vinca minor (Hirata et al. 2002),
Maesa lanceolata,

13
Hortikultura, Lingkungan, dan Bioteknologi (2019) 60:501-510
dan Medicago truncatula (Lambert dan Geelen 2008; Lam
bert dkk. 2009); enkapsulasi-vitrifikasi Eruca sativa,
Astragalus membranaceus, dan Gentiana macrophylla (Xue
dkk. 2008); dan vitrifikasi Angelica acutiloba (Yoshi-
matsu dkk. 2000), Atropa belladonna (Touno dkk. 2006),
dan Rubia akane (Park dkk. 2014).
Hanya ada sedikit penelitian sebelumnya mengenai
kriopreservasi kultur akar adventif (Jung et al. 2001; da
Silva Cordeiro et al. 2015). Oh dkk. (2009) menggunakan
metode vitrifikasi untuk kriopreservasi akar adventif dan
menemukan bahwa 12% akar selamat dari perendaman
dalam nitrogen cair. Metode vitrifikasi tetesan (Panis et al.
2005) merupakan salah satu dari tujuh teknik kriopreservasi
yang telah dikembangkan. Metode ini meningkatkan
kemungkinan bertahannya banyak bahan tanaman setelah
penyimpanan jangka panjang pada suhu sangat rendah
(Kim et al. 2010; Yi et al. 2012).
Prosedur vitrifikasi tetesan melibatkan modifikasi
metode vitrifikasi dalam beberapa cara. Eksplan diolah
terlebih dahulu dalam larutan yang diperkaya sukrosa,
didehidrasi dalam larutan pembebanan dan larutan
vitrifikasi, ditempatkan pada strip aluminium foil dengan
setetes larutan vitrifikasi, dan langsung dibenamkan ke
dalam nitrogen cair. Konduktivitas termal yang tinggi dari
aluminium foil meningkatkan laju pembekuan dan
pencairan; penggunaan strip foil juga meminimalkan
kerusakan yang terjadi p a d a sampel selama penyisipan
atau ekstraksi dari tabung kriogenik. Namun demikian,
metode vitrifikasi tetesan tidak digunakan secara luas
karena membutuhkan keterampilan teknis tingkat tinggi
(Kulus dan Zalewska 2014). Dalam penelitian ini, metode
droplet-vitrifikasi digunakan untuk meningkatkan
kriopreservasi galur akar adventif ginseng yang langka dan
berharga untuk meningkatkan penyimpanan jangka
panjang.
2 Bahan dan metode
2.1 Kultur akar adventif ginseng gunung
Pembentukan akar adventif ginseng liar (P. ginseng
Meyer) diinduksi melalui kultur kalus. Akar yang
berkembang biak dipelihara dalam media 0,75 × MS,
ditambah dengan 0,25 M asam indol-3-butirat (IBA) dan
Tabel 1 Komponen larutan
Solusi Komposisi (%, w/v)
pemuatan dan vitrifikasi
yang digunakan dalam
percobaan kriopreservasi C3 15,0 G + 15,0 S
akar adventif ginseng
C4 17,5 G + 17,5 DETIK
C6 20,0 G + 20,0 S
B5 40,0 G + 40,0 S
50 g L−1 sukrosa, pada suhu 24 ± 1 °C dalam gelap. pH
media disesuaikan menjadi 5,8 sebelum diautoklaf pada
suhu 121°C selama 20 menit. Akar adventif disubkultur
setiap 40 hari, dan ujung akar yang berumur 3 minggu
digunakan sebagai bahan dalam perlakuan kriopreservasi.
2.2 Teknik vitrifikasi tetesan
Ujung akar, dengan panjang 2-3 mm, dilepaskan dari akar
adventif P. ginseng yang berumur 3 minggu. Ujung akar
(20 segmen, empat ulangan) segera direndam dalam 15 mL
media liq-uid 0,75× MS yang dilengkapi dengan 0,3 M
sukrosa dan dikultur awal selama 24 jam di atas pengocok
berputar pada 100 rpm. Segmen yang telah dikultur
dipindahkan ke larutan pemuatan C4, yang mengandung
17,5% sukrosa dan 17,5% gliserol (b/vw/v) (Tabel 1),
selama 20 menit pada suhu kamar. Setelah krioproteksi
dengan C4, segmen akar didehidrasi dalam larutan
vitrifikasi B5, yang mengandung 40% sukrosa dan 40%
gliserol (b/v) (Tabel 1), selama 10 menit dengan
pengocokan terus menerus pada kecepatan 100 rpm pada
suhu kamar. Sebelum proses dehidrasi berakhir, ujung akar
disusun di atas kertas timah (6 × 30 mm; 10 segmen akar
per strip). Ujung akar ditutup dengan setetes larutan
vitrifikasi B5 dan segera direndam dalam nitrogen cair
setidaknya selama 30 menit. Ujung akar dihangatkan
kembali dengan menempatkan strip foil dalam 15 mL
larutan bongkar muat, dipanaskan hingga 40 ° C, dan
dikocok perlahan selama kurang lebih 30 detik untuk
melepaskan ujung akar dari foil. Selanjutnya, 15 mL
larutan bongkar segar yang mengandung sukrosa 0,8 M
ditambahkan dan ujung akar diinkubasi pada suhu kamar
selama 20 menit. Segmen-segmen tersebut dikeringkan
dengan kertas saring dan ditempatkan pada media padat
0,75× MS, ditambah dengan 0,25 M IBA, 50 g L−1 sukrosa,
dan 0,2
Gelrite, pada suhu 24 ± 1 °C dalam gelap.
Pada setiap langkah dalam proses kriopreservasi dan
penghangatan ulang, setengah dari segmen akar
dipindahkan ke tabung baru yang berisi 15 mL larutan
bongkar muat dan diinkubasi pada suhu kamar selama 20
menit. Ujung akar kemudian dikeringkan dan ditumbuhkan
pada media MS padat untuk menentukan tahap utama yang
menentukan kelangsungan hidup akar ginseng setelah
kriopreservasi.
Konsentrasi total Catatan Referensi
krioprotektan (%, b/v)
30.0 30% PVS3 Kim dkk. (2009a)
35.0 35% PVS3 Kim dkk. (2009a)
40.0 40% PVS3 Kim dkk. (2009a)
80.0 80% PVS3 Kim dkk. (2009b)
13
504 Hortikultura, Lingkungan, dan Bioteknologi (2019) 60:501-510
A3 37.5 G + 15.0 90.0 90% PVS2 Kim dkk. (2009b)
D
M
S
O

1
5
,
0

E
G

2
2
,
5

G gliserol, S sukrosa, DMSO

dimetilsulfoksida EG etilen
glikol

13
Hortikultura, Lingkungan, dan Bioteknologi (2019) 60:501-510
2.3 Perawatan pra-kultur
Untuk mempelajari pengaruh pra-kultur terhadap tingkat
kelangsungan hidup setelah kriopreservasi, ujung akar
tidak dikultur, dikultur pada 0,3 M sukrosa selama 24 jam,
atau dikultur pada 0,3 M sukrosa selama 24 jam dan
kemudian ditransfer ke 0,5 M sukrosa selama 5 jam.
Perlakuan kriopreservasi dan penghangatan ulang
selanjutnya mengikuti metodologi yang dijelaskan di atas.
2.4 Memuat perawatan solusi
Tiga larutan pemuatan yang berbeda yang mengandung
konsentrasi sukrosa dan gliserol yang berbeda digunakan
untuk menentukan larutan krioproteksi yang paling tepat
untuk ujung akar P. ginseng. Larutan pemuatan yang diuji
adalah C3 (15% sukrosa dan 15% gliserol, b/v), C4 (17,5%
sukrosa dan 17,5% gliserol, b/v), dan C6 (20% sukrosa dan
20% gliserol, b/v) (Tabel 1). Ujung akar direndam dalam
larutan pembebanan selama 20 menit pada suhu kamar.
2.5 Perawatan larutan vitrifikasi
Ujung akar yang telah dipotong didehidrasi dalam larutan
vitrifikasi tanaman modifikasi (PVS) 2 sebagai larutan
vitrifikasi B5 (40% sukrosa dan 40% gliserol, b/v) selama
10 atau 20 menit, atau PVS3 sebagai larutan A3 (22,5%
sukrosa, 37,5% gliserol, 15,0% dimetilsulfoksida (DMSO),
dan 15,0% etilena glikol (EG)) selama 10 menit pada suhu
kamar atau 0 °C (Tabel 1). Larutan vitrifikasi disterilkan
dengan penyaringan menggunakan filter jarum suntik 0,2
µm sebelum digunakan.
2.6 Uji Malondialdehida (MDA)
Jaringan akar dikumpulkan, dan 0,1 g sampel dipecah di
bawah nitrogen cair dan dihomogenisasi dalam 0,1% asam
trikloroasetat (TCA) menggunakan TissueLyser II (Qia-
gen, Hilden, Jerman). Homogenat disentrifugasi pada 5000
rpm selama 5 menit. Supernatan dicampur dengan 0,6%
TBA dan ditempatkan dalam penangas air pada suhu 90°C
selama 30 menit. Absorbansi diukur pada 532 dan 600 nm
menggunakan spekrofotometer (Optizen POP, Mecasys
Co, Ltd, Korea).
2.7 Uji aktivitas enzim antioksidan
Sampel yang terdiri dari 1,0 g akar adventif segar
didispersi dalam nitrogen cair dan dihomogenisasi dalam
buffer ekstraksi 4 mL (buffer kalium fosfat 50 mM, 2,0%
polivinilpolipirolidon, dan 1,0 mM phe-nilmetilsulfonil
fluorida). Sampel yang diekstraksi disentrifugasi pada
13.000 rpm selama 10 menit pada suhu 4 °C (Smart R17,
503
Hanil Science Co, Ltd, Korea). Supernatan disimpan pada
suhu 2°C dan digunakan untuk uji enzim dalam waktu 4
jam.
Aktivitas katalase (CAT, EC 1.11.1.6) ditentukan dalam
reaksi yang mengandung 500 µmol H O22 dalam 10 mL
buffer fosfat 100 mM (pH 7.0). Aktivitas CAT ditentukan
dengan memantau konsumsi H O22 pada 240 nm selama 3
menit. Hasil
Hasil dinyatakan sebagai CAT U mg−1 protein (reduksi 1
mM H2O2 min−1 mg−1 protein).
Aktivitas peroksidase (POD, EC 1.11.1.7) diukur
dengan menggunakan modifikasi metode yang dijelaskan
oleh Bisht dkk. (1989). Campuran reaksi terdiri dari 1,5 mL
buffer fosfat (pH 7,0), 1% guaiacol, dan 1% H O22 .
Aktivitas POD dinilai sebagai perubahan serapan pada 470
nm sebagai hasil dari oksidasi guaiacol. Hasilnya
dinyatakan sebagai U min−1 mg−1 protein. Tiga larutan
pembebanan yang berbeda dengan konsentrasi sukrosa dan
gliserol yang berbeda digunakan untuk menentukan larutan
krioprotektif yang paling tepat untuk ujung akar P.
ginseng; larutan yang diuji adalah C3 (15% sukrosa dan
15% gliserol, b/v); C4 (17.5% sukrosa dan 17.5% gliserol,
b/v); dan C6 (20% sukrosa dan 20% gliserol, b/v). Segmen-
segmen tersebut direndam dalam larutan pemuatan selama
20 menit pada suhu kamar.
2.8 Analisis statistik
Semua data dianalisis dengan analisis varians (ANOVA)
satu arah yang diikuti dengan uji jarak berganda Duncan
(DMRT) menggunakan perangkat lunak statistik SPSS
16.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Data disajikan
sebagai rata-rata dan kesalahan baku; huruf yang berbeda
pada gambar menunjukkan perbedaan yang signifikan
antara hasil (p <0,05).
3 Hasil
3.1 Pengaruh konsentrasi dan durasi sukrosa
paparan selama pra-kultur pada tingkat
kelangsungan hidup akar adventif setelah
kriopreservasi
Tingkat kelangsungan hidup ujung akar yang
dikriopreservasi yang terpapar pada konsentrasi sukrosa
yang berbeda (0, 0,3, dan 0,5 M) selama periode yang
berbeda diukur (Gbr. 1a). Tingkat kelangsungan hidup
tertinggi diperoleh setelah 24 jam pra-kultur dengan 0,3 M
sukrosa. Segmen akar yang tidak dikultur dengan larutan
sukrosa yang diperkaya juga pulih dengan baik setelah
disimpan dalam nitrogen cair (Gbr. 1a). Ujung akar yang
diperlakukan dengan pra-kultur dalam
Sukrosa 0,3 M yang diikuti dengan pemindahan ke sukrosa
0,5 M menunjukkan tingkat kelangsungan hidup terendah
13
504 Hortikultura, Lingkungan, dan Bioteknologi (2019) 60:501-510
(Gbr. 1a).

3.2 Pengaruh larutan pemuatan terhadap

tingkat kelangsungan hidup akar adventif
setelah kriopreservasi

Dari berbagai perlakuan pemuatan yang diuji, berat

gliserol dan sukrosa yang seimbang dalam larutan
pemuatan C4

13
Hortikultura, Lingkungan, dan Bioteknologi (2019) 60:501-510 505

Gbr. 1 Laju regenerasi ujung akar adventif Panax ginseng setelah
pertumbuhan kembali selama 30 hari pada media segar setelah
kriopreservasi. a Pengaruh perlakuan pra-kultur terhadap laju
regenerasi. b Pengaruh larutan pembebanan terhadap laju regenerasi.
c Pengaruh vitrifikasi
perlakuan pada tingkat regenerasi. Data adalah rata-rata ± SE dari
tiga ulangan; huruf yang berbeda pada kolom menunjukkan
perbedaan yang signifikan (p <0,05) menurut uji jarak berganda
Duncan. Nitro-gen cair LN

menghasilkan tingkat regenerasi ujung akar ginseng yang selama 10 atau 20 menit atau PVS2 pada suhu kamar atau di
paling tinggi (Gbr. 1b). Segmen akar yang tidak diberi atas es. Ujung akar ginseng yang terpapar larutan B5,
perlakuan dengan larutan pembebanan juga pulih dengan pengenceran PVS3 (80%), selama 10 menit menghasilkan
baik setelah kriopreservasi, tetapi perlakuan dengan larutan tingkat pemulihan akar sebesar 15% setelah nitrogen cair
C3 (15% gliserol dan 15% sukrosa, b/v) dan C6 (20%
gliserol dan 20% sukrosa, b/v) menghasilkan pemulihan
ujung akar yang rendah setelah perlakuan dengan nitrogen
cair.

3.3 Pengaruh larutan vitrifikasi, serta durasi dan

suhu pemaparan, terhadap tingkat
kelangsungan hidup akar adventif setelah
kriopreservasi

Ujung akar ginseng, yang telah didehidrasi sebelumnya

dalam larutan pemuatan, didehidrasi lebih lanjut dalam
larutan krioprotektif yang sangat pekat. Untuk mengukur
efek dari komposisi larutan vitrifikasi, durasi pemaparan,
dan suhu perlakuan, ujung akar divitrifikasi dengan PVS3

13
506 Hortikultura, Lingkungan, dan Bioteknologi (2019) 60:501-510
Namun, paparan yang terlalu lama terhadap B5 selama 20
menit mengakibatkan kematian pada hampir semua
segmen akar (Gbr. 1c). Tingkat pemulihan ujung akar
setelah perlakuan pada suhu ruangan dengan larutan A3,
pengenceran PVS2 (90%), hanya 5%. Efek merusak dari
larutan A3 diperparah dengan melakukan perawatan di
atas es, karena tidak ada eksplan yang dirawat dalam
kondisi tersebut yang selamat dari kriopreservasi (Gbr.
1c). Hasil ini menyiratkan bahwa ujung akar ginseng
sangat sensitif terhadap toksisitas kimiawi dan tekanan
osmotik.
Morfologi ujung akar diamati setelah dehidrasi dengan
larutan vitrifikasi (Gbr. 2). Akar yang bertahan awalnya
membengkak di ujung akar setelah sekitar 2 minggu
tumbuh kembali pada media segar (Gbr. 2a). Selanjutnya,
kalus terbentuk dan berkembang dari ujung akar (Gbr.
2b). Akar adventif diinduksi dari kalus setelah 3 minggu
pertumbuhan kembali oleh akar vitrifikasi (Gbr. 2c), dan
a k a r lateral terbentuk pada akar adventif setelah 4
minggu kultur (Gbr. 2d). Penelitian ini menetapkan
prosedur untuk kultur jangka panjang akar adventif P.
ginseng;

13
Hortikultura, Lingkungan, dan Bioteknologi (2019) 60:501-510
Gbr. 2 Morfologi akar adventif
setelah kriopreservasi. a
Ujung akar adventif yang
membengkak pada media
pertumbuhan kembali. b
Pembentukan kalus dari kultur
akar adventif.
akar dari kultur kalus. d
Pembentukan akar lateral dari
akar adventif
Namun, karena ujung akar sensitif terhadap tekanan
osmotik, langkah selanjutnya adalah mengidentifikasi
tahap kritis dalam proses pengawetan kriogenik di mana
kerusakan jaringan terbesar terjadi.
3.4 Pengaruh pra-kultur, larutan pemuatan,
larutan vitrifikasi, dan perlakuan nitrogen
cair terhadap tingkat kelangsungan hidup
akar adventif
Untuk mengidentifikasi tahap paling kritis dalam proses
kriopreservasi, akar adventif dikumpulkan setelah setiap
langkah protokol, dicuci dengan larutan pembongkaran,
dan dikultur pada media padat segar; tanaman kontrol
dipilih sebelum pra-kultur. Tingkat kelangsungan hidup
dan tingkat pembentukan akar lateral diukur setelah 4
minggu kultur (Gbr. 3a, b). Tingkat regenerasi hampir
100% diamati pada ujung akar ginseng setelah pra-kultur
dan perlakuan dengan larutan pemuatan C4 (Gbr. 3a).
Namun, setelah terpapar larutan vitrifikasi B5 selama 10
menit, sekitar 50% segmen akar menjadi nekrotik,
menghasilkan tingkat kelangsungan hidup yang rendah
setelah perawatan kriopreservasi (Gbr. 3a). Pembentukan
akar lateral juga secara bertahap berkurang setelah setiap
langkah berturut-turut dalam protokol (Gbr. 3b). Gambar
akar lateral yang terbentuk setelah perlakuan kontrol dan
setelah terpapar media yang diperkaya sukrosa pada pra-
kultur, larutan pemuatan, larutan vitrifikasi, dan nitrogen
cair masing-masing ditunjukkan pada Gambar 3c-g.
507
3.5 Kadar malondialdehida (MDA) dan aktivitas
enzim antioksidan pada akar adventif
selama proses kriopreservasi
Untuk menentukan efek stres osmotik pada kelangsungan
hidup pasca kriopreservasi dan regenerasi akar ginseng
adventif, kadar malondialdehida (MDA) dan aktivitas
enzim antioksidan (CAT dan POD) dianalisis setelah setiap
tahap proses kriopreservasi (Gbr. 4). Kadar MDA
meningkat setelah perlakuan pra-kultur, pemuatan, dan
kriopreservasi, dan mencapai puncaknya setelah perlakuan
dengan larutan vitrifikasi B5 (Gbr. 4a). Sebaliknya,
aktivitas CAT berada pada tingkat terendah ketika ujung
akar terpapar larutan B5 selama 10 menit (Gbr. 4b).
Aktivitas CAT setelah perlakuan pra-kultur, pemuatan, dan
kriopreservasi tidak berbeda secara signifikan dengan
aktivitas pada akar kontrol (Gbr. 4b). Aktivitas POD pada
ujung akar tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan
antara tahap-tahap proses kriopreservasi yang berurutan,
atau antara sampel yang diberi perlakuan dan sampel
kontrol (Gbr. 4c).
4 Diskusi
Untuk meningkatkan persentase jaringan tanaman yang
bertahan hidup dalam kriopreservasi dengan vitrifikasi
tetesan dan dapat beregenerasi secara cepat, perlu
ditentukan solusi yang paling tepat dan durasi paparan
yang optimal untuk setiap tahap prosedur. Tidak seperti di
13
508 Hortikultura, Lingkungan, dan Bioteknologi (2019) 60:501-510
alam, di mana faktor termal dan fotoperiodik
memungkinkan tanaman untuk bertahan di musim dingin

13
Hortikultura, Lingkungan, dan Bioteknologi (2019) 60:501-510 509

Gambar 3 Pemulihan dan pertumbuhan kembali setelah setiap tahap
proses kriopreservasi. a Respon eksplan setelah perlakuan kontrol
dan perlakuan pra-kultur, larutan pemuatan, dan larutan vitrifikasi. b
Jumlah akar lateral yang dihasilkan setelah perlakuan kontrol dan
perlakuan pra-kultur, larutan pemuatan, dan larutan vitrifikasi. Data
pada (a) dan
(b) adalah rata-rata ± SE dari tiga ulangan; huruf yang berbeda pada
kolom menunjukkan perbedaan yang signifikan (p <0,05) menurut
Duncan's
c Morfologi akar adventif sebelum pengawetan kriogenik (kontrol). d
Pertumbuhan kembali akar adventif setelah pra-kultur pada 0,3 M
sukrosa selama 24 jam. e Pertumbuhan kembali akar adventif setelah
pemuatan dengan larutan C4. f Pertumbuhan kembali akar adventif
setelah vitrifikasi dengan larutan B5. g Pemulihan akar adventif
setelah penyimpanan dalam nitrogen cair. Batang skala: 1 cm

Pada suhu dingin, toleransi eksplan yang ditumbuhkan dari 0,3 M selama 24 jam menjadi 0,5 M selama 5 jam.
Engelman dan Takagi (2000) menunjukkan bahwa pra-
secara in vitro harus diinduksi dengan memodifikasi
budaya
kondisi kultur seperti suhu, komponen media pertumbuhan,
tidak cukup untuk meningkatkan toleransi stres eksplan
dan intensitas cahaya (Kulus dan Zalewska 2014).
setelah kriopreservasi, dan paparan langsung ke suhu tinggi
Prakultur dengan larutan pengaya yang mengandung
berbagai konsentrasi sukrosa merupakan faktor penting
untuk meningkatkan toleransi eksplan terhadap cekaman
pembekuan (Suzuki et al. 2006). Xue dkk. (2008)
menunjukkan bahwa perlakuan pra-kultur sangat penting
untuk kriopreservasi akar berbulu E. sativa dan A.
membranaceus, tetapi tidak efektif untuk akar berbulu G.
macrophylla. Pra-kultur dengan sukrosa mengurangi
ukuran vakuola sel dan mengurangi kandungan air bebas,
yang menunjukkan bahwa dehidrasi meningkatkan
kapasitas membran sel untuk mempertahankan struktur
yang stabil (Ibrahim dan Normah 2013; Kulus dan
Zalewska 2014). Studi saat ini menemukan bahwa
meningkatkan konsentrasi sukrosa menjadi 0,3 M selama
24 jam atau menghilangkan langkah pra-kultur
menghasilkan pertumbuhan kembali pasca-kriopreservasi
yang lebih baik dari akar adventif P. ginseng dibandingkan
dengan peningkatan konsentrasi sukrosa secara bertahap

13
510 Hortikultura, Lingkungan, dan Bioteknologi (2019) 60:501-510
konsentrasi larutan vitrifikasi bersifat toksik. Perlakuan
pemuatan yang memaparkan eksplan pada krioprotektan
dalam jumlah sedang selama 20 hingga 60 menit
merupakan tahap penting sebelum dehidrasi dengan
larutan vitrifikasi yang sangat pekat (Nishizawa et al.
1993). Penelitian saat ini menunjukkan bahwa komposisi
larutan pemuatan merupakan faktor penting yang
mempengaruhi tingkat pemulihan eksplan ginseng setelah
krioproteksi. Dari tiga larutan pemuatan yang diuji, C4,
campuran 17,5% sukrosa dan 17,5% gliserol (b/v), adalah
yang paling efektif dalam meningkatkan toleransi
terhadap dehidrasi oleh larutan vitrifikasi. Larutan
pemuatan ini juga paling efektif untuk kriopreservasi
ujung pucuk krisan, yang sensitif terhadap tekanan
osmotik (Kim et al. 2009a), dan menghasilkan tingkat
regenerasi pasca kriopreservasi tertinggi dari R. akane,
yang ditunjukkan oleh Kim et al. (2010). Pemaparan
ujung akar ginseng dalam waktu lama pada larutan
pemuatan memungkinkan pembentukan akar yang efektif
setelah vitrifikasi dan pendinginan untuk
- 196 °C.
Kunci keberhasilan kriopreservasi bahan tanaman
dengan metode vitrifikasi adalah mengatasi kesulitan
utama yang ditimbulkan oleh toksisitas kimiawi yang
tinggi dan tekanan osmotik berlebih pada larutan
vitrifikasi pekat (Fábián et al. 2008; San José et al. 2014).
Meskipun larutan yang sangat pekat

13
Hortikultura, Lingkungan, dan Bioteknologi (2019) 60:501-510 511
sering digunakan (Sakai dan Engelmann 2007).

Gambar 4 Pengaruh setiap tahap proses kriopreservasi terhadap kadar

malondialdehid dan aktivitas enzim antioksidan pada akar adventif
Panax ginseng. a Kadar malondialdehid (MDA) yang diukur pada
akar adventif setelah pra-kultur, dan perlakuan dengan larutan
pemuatan, larutan vitrifikasi, dan nitrogen cair. b Kadar aktivitas
CAT pada akar adventif setelah setiap perlakuan. c Kadar aktivitas
POD pada akar adventif setelah setiap perlakuan. Data merupakan
rerata ± SE dari tiga ulangan; huruf yang berbeda pada kolom
menunjukkan perbedaan yang signifikan (p < 0,05) menurut uji jarak
berganda Duncan

Campuran vitrifikasi diperlukan untuk menghasilkan

tingkat dehidrasi sitoplasma yang penting untuk mencegah
pembentukan kristal es intraseluler, paparan yang terlalu
lama pada larutan tersebut dapat bersifat sitotoksik (Sakai
et al. 1990; San José et al. 2014). Kerusakan yang
disebabkan oleh toksisitas campuran vitrifikasi diakibatkan
oleh perubahan yang berbeda pada ultra-struktur sel,
terutama pada membran plasma (Fujikawa dan Steponkus
1991; Ste- ponkus et al. 1992). Untuk alasan ini, durasi
perlakuan dehidrasi dan komposisi larutan vitrifikasi, serta
kondisi eksperimental lainnya, harus ditentukan dengan
tepat. Komposisi larutan vitrifikasi telah dikembangkan dari
waktu ke waktu, dan PVS2 dan PVS3 adalah yang paling

13
512 Hortikultura, Lingkungan, dan Bioteknologi (2019) 60:501-510
merupakan kunci penting untuk meningkatkan regenerasi
Keduanya merupakan larutan berbasis gliserol, tetapi pasca kriopreservasi akar adventif ginseng. Banyak
PVS2 juga mengandung EG dan DMSO, krioprotektan penelitian sebelumnya telah menunjukkan bahwa sel-sel
yang dapat melubangi dinding dan membran sel. Karena tanaman rusak akibat perlakuan kriopreservasi (Wesley-
konsentrasi DMSO yang tinggi menyebabkan kerusakan Smith et al. 2013). Kami menemukan bahwa, ketika
bilayer membran (Hughes dan Mancera 2014), PVS3 segmen akar pasca kriopreservasi ditumbuhkan kembali
digunakan untuk eksplan yang peka terhadap toksisitas pada media segar, pembengkakan pri-mordia terjadi
kimiawi (Kim et al. 2009b). Meskipun PVS2 telah terlebih dahulu, diikuti oleh pembentukan kalus. Hampir
berhasil digunakan untuk kriopreservasi akar adventif
Hyoscyamus niger (Jung et al. 2001), akar berbulu A.
acutiloba (Yoshimatsu et al. 2000), dan akar berbulu A.
belladonna (Touno et al. 2006), eksplan yang terpapar
dengan PVS2 sering kali rentan terhadap toksisitas
kimianya. Lambert dkk. (2009) menemukan bahwa akar
berbulu M. lanceolata dan M. truncatula rusak secara
signifikan setelah diinkubasi dengan PVS2 selama 5
menit; selain itu, Xue dkk. (2008) menunjukkan bahwa
PVS2 tidak efektif dalam mengawetkan akar berbulu G.
macrophylla dan
A. membranaceus. Oh dkk. (2009), bagaimanapun,
menemukan PVS2 sebagai kriopreservatif yang
menjanjikan untuk akar adventif
P. ginseng, meskipun tingkat regenerasinya rendah. Kim
dkk. (2010) melaporkan tingkat regenerasi pasca
kriopreservasi s e b e s a r 79,5% pada akar berbulu R.
akane setelah perawatan dengan larutan PVS3 80% (B5).
Penelitian ini menguji efek dari dua larutan vitrifikasi,
B5 (larutan 80% PVS3) dan A3 (larutan 90% PVS2), pada
tingkat regenerasi pasca-kriopreservasi akar adventif
ginseng. Laju regenerasi lebih tinggi setelah perlakuan
dengan B5 dibandingkan dengan larutan A3. Selain itu,
perawatan ujung akar ginseng dengan larutan B5 untuk
waktu yang singkat (10 menit) lebih efektif daripada
perawatan yang lebih lama (20 menit). Keseimbangan
antara gliserol dan sukrosa dalam larutan B5 dapat
mempengaruhi keberhasilan pemulihan bahan
kriopreservasi, karena respon serupa dilaporkan oleh
Makowska dkk. (1999) dan Kim dkk. (2010). Pemaparan
PVS2 yang cepat pada es sangat penting untuk
mengurangi kerusakan yang disebabkan oleh larutan
vitrifikasi, yang menghasilkan tingkat regenerasi yang
lebih baik pada banyak spesies tanaman (Nishizawa dkk.
1993; Kuranuki dan Sakai 1995; Thinh 1997; Yoon dkk.
2006; Sakai dan Engelmann 2007). Namun, dalam
penelitian saat ini, pemulihan segmen akar yang dirawat
dengan larutan A3 yang didinginkan lebih rendah
daripada setelah perawatan dengan larutan suhu ruangan.
Hal ini konsisten dengan penelitian sebelumnya pada
banyak tanaman obat, yang menemukan bahwa suhu
optimal untuk paparan PVS2 adalah 25°C (Matsumoto et
al. 1994; Takagi et al. 1997; Sakai dan Engelmann 2007).
Larutan vitrifikasi merupakan faktor utama dalam proses
kriopreservasi, yang menentukan tingkat kelangsungan
hidup segmen akar ginseng. Oleh karena itu,
mengoptimalkan komposisi campuran krioprotektan
13
Hortikultura, Lingkungan, dan Bioteknologi (2019) 60:501-510 513
oksigen, dan dengan demikian penting untuk
semua jaringan akar menjadi nekrotik, dan satu-satunya mendetoksifikasi ROS selama stres (Ahmad et al. 2008).
zona yang masih hidup tampaknya adalah daerah Kadar CAT juga menurun selama tahap pasca
meristematik ujung akar. Quain dkk. (2009) juga kriopreservasi pada Dendrobium protocorm-like bodies
melaporkan hanya perkembangan kalus dari jaringan (PLB), yang menyebabkan berkurangnya persentase
Dioscorea rotundata yang terpapar nitrogen cair. regenerasi PLB yang dikriopreservasi (Poobathy et al.
Penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa, jarang sekali, 2013). Jia dkk. (2017) melaporkan bahwa CAT eksogen
sel yang lebih besar dan lebih terdiferensiasi daripada sel mengurangi cedera oksidatif
meristem dapat bertahan hidup dalam penyimpanan dalam
nitrogen cair (Kulus et al. 2018). Namun, pada krisan,
hanya tiga lapisan sel meristem yang teramati dapat
bertahan hidup setelah kriopreservasi (Wang et al. 2014).
Cedera pada meristem dapat menyebabkan regenerasi tidak
langsung melalui kalus (Kulus et al. 2018).
Meskipun larutan vitrifikasi merupakan faktor utama
yang menentukan kelangsungan hidup sel, kriopreservasi
mengekspos jaringan pada tekanan yang berlipat ganda,
termasuk eksisi, kerusakan osmotik, dehidrasi, dan
fluktuasi suhu (Uchendu et al. 2010; Ren et al. 2013).
Penelitian terbaru menunjukkan bahwa stres oksidatif yang
disebabkan oleh kriopreservasi memicu
pembentukan spesies oksigen reaktif (ROS). Hal ini
mengakibatkan cryoinjury pada sel, yang disebabkan oleh
denaturasi protein, penguraian asam nukleat, dan
perusakan membran sel (Poobathy et al. 2013; Chen et al.
2015; Martinez-Montero dan Harding 2015; Zhang et al.
2015). Membran plasma merupakan target utama dari
kerusakan sel (Wen et al. 2010). MDA, produk pemecahan
peroksidasi lipid, bekerja secara merugikan pada protein
dan DNA, yang menyebabkan mutasi DNA dan
penonaktifan protein (Jia et al. 2017). Kaczmarczyk dkk.
(2012) melaporkan bahwa produksi MDA merupakan
tanda utama peroksidasi lipid dan indikator stres oksidatif
selama kriopreservasi. Dalam penelitian ini, MDA secara
bertahap terakumulasi di segmen akar selama tahap pra-
kultur dan pemuatan, dan levelnya memuncak setelah
terpapar larutan vitrifikasi. Penelitian sebelumnya juga
menunjukkan peningkatan kadar MDA selama
kriopreservasi Oryza sativa, Azadirachta indica, Zea mays,
Dendrobium wardianum, dan Arabidopsis thaliana (Benson
dkk., 1992; Varghese dan Naithani, 2008; Wen dkk., 2010;
Wu dan Shen, 2011; Ren dkk., 2013).
Selain itu, tanaman menunjukkan respons antioksidan
yang kompleks
terhadap stres oksidatif yang melibatkan keseimbangan
yang cermat antara antioksidan enzimatik, seperti CAT dan
POD, dan banyak jalur non-enzimatik yang melibatkan
flavon, antosianin, vitamin C, dan karotenoid (Apel dan
Hirt 2004; Halliwell 2006; Pandhair dan Sekhon 2006).
Analisis aktivitas CAT pada segmen akar ginseng selama
proses kriopreservasi menemukan bahwa aktivitasnya
paling rendah selama tahap vitrifikasi, yang
mengindikasikan bahwa tingkat stres oksidatif tertinggi
terakumulasi setelah kriopreservasi. CAT adalah enzim
yang mengubah hidrogen peroksida menjadi air dan

13
514 Hortikultura, Lingkungan, dan Bioteknologi (2019) 60:501-510
untuk kelangsungan hidup pasca pencairan. Ilmu Tanaman 85:
selama kriopreservasi serbuk sari Paeonia dan Magnolia. 107-114
Kami menemukan bahwa stres oksidatif yang diinduksi Bisht SS, Sharma A, Chaturvedi K (1989) Lesi metabolik tertentu dari
toksisitas kromium pada lobak. Indian J Agric Biochem 2:109-115
oleh ROS berkaitan erat dengan penurunan laju regenerasi
ujung akar ginseng setelah kriopreservasi. Oleh karena itu,
komposisi optimal dari larutan vitrifikasi dan aplikasi anti
oksidan eksogen harus dipertimbangkan dalam penelitian
lebih lanjut untuk memberikan perlindungan dari stres
oksidatif dan meningkatkan regenerasi akar ginseng yang
dibekukan.

5 Kesimpulan

Penelitian ini membuat protokol vitrifikasi tetesan untuk

kriopreservasi ujung akar ginseng (P. ginseng). Pra-kultur
akar adventif dengan 0,3 M sukrosa menghasilkan tingkat
pertumbuhan kembali tertinggi setelah kriopreservasi
dalam nitrogen cair selama 30 menit. Pertumbuhan
kembali akar adventif yang dikriopreservasi meningkat
empat kali lipat dibandingkan kontrol yang tidak diberi
perlakuan dengan larutan pemuatan C4 selama 20 menit
pada suhu kamar. Tingkat pertumbuhan kembali tertinggi
(15% dari akar yang bertahan setelah kriopreservasi)
diperoleh dengan menginkubasi akar adventif dalam
larutan B5 yang dimodifikasi selama 10 menit pada suhu
kamar. Ujung akar adventif ginseng sensitif terhadap
tekanan osmotik. Oleh karena itu, penelitian di masa
depan akan berfokus pada peningkatan laju regenerasi
pasca kriopreservasi dengan mengoptimalkan komposisi
larutan vitrifikasi dan aplikasi enzim antioksidan eksogen.

Ucapan Terima Kasih Pekerjaan ini didukung oleh Institut

Perencanaan dan Evaluasi Teknologi Pangan, Pertanian, Kehutanan,
dan Perikanan Korea (IPET) melalui Program Pengembangan
Teknologi Produksi Lanjutan, yang didanai oleh Kementerian
Pertanian, Pangan, dan Urusan Pedesaan (Hibah No. 315013-4).

Kontribusi penulis K-CL berkontribusi dalam akuisisi data dan

menulis naskah. H-HK dan K-YP berpartisipasi dalam
menginterpretasikan data dan merevisi konten intelektual. S-YP
memberikan kontribusi substansial terhadap konsepsi dan desain
penelitian.

Kepatuhan terhadap standar etika

Konflik kepentingan Para penulis menyatakan bahwa mereka tidak

memiliki konflik kepentingan.

Referensi
Ahmad P, Sarwat M, Sharma S (2008) Spesies oksigen reaktif, anti
oksidan dan pensinyalan pada tanaman. J Plant Biol 51:167-173
Apel K, Hirt H (2004) Spesies oksigen reaktif: metabolisme, stres
oksidatif, dan transduksi sinyal. Annu Rev Plant Biol 55:373-399
Benson EE, Lynch PT, Jones J (1992) Deteksi produk peroksidasi
lipid pada sel padi yang dikrioproteksi dan dibekukan: konsekuensi
13
Hortikultura, Lingkungan, dan Bioteknologi (2019) 60:501-510
Chen G, Ren L, Zhang J, Reed BM, Zhang D, Shen XH (2015)
Pengawetan kriopreservasi mempengaruhi stres oksidatif yang
diinduksi ROS dan respons antioksidan dant pada bibit Arabidopsis.
Cryobiology 70:38-47 Christensen LP (2008) Ginsenosides: kimia,
biosintesis, analisis
sis, dan potensi efek kesehatan. Adv Food Nutr Res 55: 1-99 Da
Silva Cordeiro L, Simões-Gurgel C, Albarello N (2015) Multi
plikasi dan kriopreservasi akar adventif Cleome rosea Vahl.
Vitro Cell Dev Biol 51:249-257
Engelman F, Takagi H (2000) Kriopreservasi plasma nutfah tanaman
tropis kemajuan penelitian dan aplikasi terkini. Pusat Penelitian
Internasional Jepang untuk Ilmu Pertanian, Tsukuba
Engelmann F, Dussert S (2013) Kriopreservasi. Dalam: Normah MN,
Chin HF, Reed BM (eds) Konservasi spesies tumbuhan tropis.
Springer, Berlin, pp 107-119
Fábián A, Jäger K, Darkó É, Barnabás B (2008) Kriopreservasi sel
telur gandum (Triticum aestivum L.) dengan vitrifikasi. Acta
Physiol Plant 30:737-744
Fu C, Li L, Wu W, Li M, Yu X, Yu L (2012) Penilaian variasi
genetik dan epigenetik selama kultur sel Taxus jangka panjang.
Plant Cell Rep 31: 1321-1331
Fujikawa S, Steponkus PL (1991) Perubahan ultrastruktural membran
plasma dengan prosedur vitrifikasi. Jpn J Kering Bebas 37:25-29
Hahn EJ, Yu KW, Paek KY (2003) Kultur akar adventif Panax
ginseng CV Meyer dan produksi ginsenosida melalui sistem
bioreaktor skala besar. J Plant Biotechnol 5:1-6
Halliwell B (2006) Spesies reaktif dan antioksidan. Biologi redoks
adalah tema mendasar dari kehidupan aerobik. Plant Physiol
141:312-322
Hirata K, Mukai M, Goda S, Ishio-Kinugasa M, Yoshida K, Sakai A,
Miyamoto K (2002) Kriopreservasi kultur akar berbulu Vinca
minor (L.) dengan enkapsulasi-dehidrasi. Biotechnol Lett
24:371-376
Hughes ZE, Mancera RL (2014) Mekanisme molekuler dari efek
sinergis dari larutan vitrifikasi pada stabilitas lapisan fosfolipid .
Biofisika J 106: 2617-2624
Ibrahim S, Normah MN (2013) Kelangsungan hidup ujung tunas in
vitro Garcinia mangostana L. setelah kriopreservasi dengan
vitrifikasi. Peraturan Pertumbuhan Tanaman 70:237-246
Jia MX, Shi Y, Di W, Jiang XR, Xu J, Liu Y (2017) Stres oksidatif
yang diinduksi ROS terkait erat dengan kerusakan serbuk sari
setelah kriopreservasi . Vitro Cell Dev Biol 53:433-439
Jung DW, Sung CK, Touno K, Yoshimatsu K, Shimomura K (2001)
Kriopreservasi akar adventif Hyoscyamus niger dengan vit-
rifikasi. J Plant Physiol 158:801-805
Kaczmarczyk A, Funnekotter B, Menon A, Phang PY, Al-Hanbali A,
Bunn E, Mancera RL (2012) Isu-isu terkini dalam kriopreservasi
tanaman. Dalam: Katov II (ed) Batas-batas terkini dalam
kriobiologi. Kroasia, InTech, hal 417-438
Kim HH, Lee YG, Park SU, Lee SC, Baek HJ, Cho EG, Engelmann F
(2009a) Pengembangan solusi pemuatan alternatif dalam
prosedur vitrifikasi tetesan- . CryoLetters 30: 291-299
Kim HH, Lee YG, Shin DJ, Ko HC, Gwag JG, Cho EG, Engelmann
F (2009b) Pengembangan larutan vitrifikasi tanaman alternatif
dan larutan pemuatan dalam prosedur vitrifikasi tetesan. Cryobi-
ology 59:320-334
Kim HH, Popova EV, Yi JY, Cho GT, Park SU, Lee SC, Engelmann
F (2010) Kriopreservasi akar berbulu Rubia akane (Nakai)
menggunakan prosedur vitrifikasi tetesan. CryoLetters 31:473-
484
Kim DS, Song M, Kim SH, Jang DS, Kim JB, Ha BK, Kim SH, Lee
KJ, Kang SY, Jeong IY (2013) Peningkatan akumulasi
ginsenosida dalam Panax ginseng sebagai akibat dari γ-iradiasi. J
Gin- seng Res 37:332-340
Kiselev KV, Shumakova OA, Tchernoded GK (2011) Mutasi gen
Panax ginseng selama kultivasi jangka panjang dari kultur sel
ginseng. J Plant Physiol 168:1280-1285
515
Kulus D, Zalewska M (2014) Kriopreservasi sebagai alat yang
digunakan dalam penyimpanan jangka panjang untuk spesies
hias-sebuah tinjauan. Sci Hortic (Amsterdam) 168:88-107
Kulus D, Abratowska A, Mikuła A (2018) Respons morfogenetik
ujung pucuk terhadap kriopreservasi dengan enkapsulasi-
dehidrasi pada mutan padat dan kembaran periklinal
Chrysanthe- mum × grandiflorum/Ramat./Kitam. Acta Physiol
Plant 40:18
Kuranuki Y, Sakai A (1995) Kriopreservasi ujung pucuk teh
(Camellia sinensis) yang ditumbuhkan secara in vitro dengan
vitrifikasi. CryoLet- ters 16:345-352
Lambert E, Geelen D (2008) Kriopreservasi kultur akar berbulu dari
Maesa lanceolata. Dalam: Laamanen J, Uosukainen M, Häg-
gman H, Rantala ANS (eds) Cryopreservation of Cropspecies in
Europe CRYOPLANET COST Action 871, 20-23 Feb 2008,
Oulu, Finland
Lambert E, Goossens A, Panis B, van Labeke MC, Geelen D (2009)
Kriopreservasi kultur akar berbulu dari Maesa lanceolata dan
Medicago truncatula. Sel Tanaman, Kultur Organ Jaringan
96:289-296
Lee KH (1998) Farmakologi herbal Cina. J Nat Prod 61:1575-1576
Lü JM, Yao Q, Chen C (2009) Senyawa ginseng: pembaruan tentang
mekanisme molekuler dan aplikasi medisnya. Curr Vasc
Pharmacol 7:293-302
Makowska Z, Keller J, Engelmann F (1999) Kriopreservasi apeks
yang diisolasi dari umbi dan siung bawang putih (Allium sativum
L.). CryoLetters 20:175-182
Martinez-Montero ME, Harding K (2015) Cryobionomics:
mengevaluasi konsep dalam kriopreservasi tanaman. Dalam:
Barh D, Khan MS, Davies E (eds) Plant omics: omics of plant
science. Springer, Berlin, pp 655-682
Matsumoto T, Sakai A, Yamada K (1994) Kriopreservasi meristem
apikal wasabi (Wasabia japonica) yang ditumbuhkan secara in
vitro dengan vitrifikasi dan regenerasi tanaman tinggi
berikutnya. Tanaman Cell Rep 13:442-446
Nishizawa S, Sakai A, Amano Y, Matsuzawa T (1993)
Kriopreservasi sel susulan embriogenik asparagus (Asparagus
officinalis L.) dan regenerasi tanaman selanjutnya dengan
vitrifikasi. Plant Sci 91:67-73
Oh SY, Wu CH, Popova E, Hahn EJ, Paek KY (2009) Kriopreservasi
akar adventif Panax ginseng. J Plant Biol 52:348-354
Pandhair V, Sekhon BS (2006) Spesies oksigen reaktif dan anti
oksidan pada tanaman: suatu tinjauan. J Plant Biochem
Biotechnol 15:71-78
Panis B, Piette B, Swennen R (2005) Droplet vitrifikasi meristem
apikal: protokol kriopreservasi yang dapat diterapkan pada
semua Musaceae. Ilmu Tanaman 168:45-55
Park SU, Kong H, Shin DJ, Bae CH, Lee SC, Bae CH, Rha ES, Kim
HH (2014) Pengembangan protokol vitrifikasi pada akar berbulu
Rubia akane (Nakai) menggunakan pendekatan sistematis.
CryoLetters 35:138-144
Poobathy R, Sinniah UR, Xavier R, Subramaniam S (2013) Aktivitas
katalase dan superoksida dismutase serta kandungan protein total
dari protocorm-like bodies Dendrobium Sonia-28 yang
mengalami vitrifikasi . Appl Biochem Biotechnol 170:1066-
1079
Quain MD, Berjak P, Acheampong E, Kioko JI (2009) Perlakuan
sukrosa dan kadar air eksplan: faktor kritis yang perlu
dipertimbangkan dalam pengembangan protokol kriopreservasi
yang berhasil untuk eksplan ujung pucuk spesies tropis
Dioscorea rotundata (ubi). CryoLetters 30:212-223
Ren L, Zhang D, Jiang XN, Gai Y, Wang WM, Reed BM, Shen XH
(2013) Peroksidasi akibat perlakuan krioprotektan merupakan
faktor penting untuk kelangsungan hidup sel dalam kriopreservasi
Arabidopsis. Ilmu Tanaman 212:37-47
Sakai A, Engelmann F (2007) Vitrifikasi, enkapsulasi-vitrifikasi dan
vitrifikasi tetesan: sebuah tinjauan. CryoLetters 28: 151-172
13
516
Sakai A, Kobayashi S, Oiyama I (1990) Kriopreservasi sel nukleus
jeruk pusar (Citrus sinensis Osb. var. Brasiliensis Tanaka)
dengan vitrifikasi. Plant Cell Rep 9:30-33
San José MC, Valladares S, Janeiro LV, Corredoira E (2014) Cryo-
preservation of in vitro-grown shoot tips of Alnus glutinosa (L.)
Gaertn. Acta Physiol Plant 36:109-116
Steponkus PL, Langis R, Fujikawa S (1992) Kriopreservasi jaringan
tanaman dengan vitrifikasi. Dalam: Steponkus PL (ed)
Kemajuan dalam biologi suhu rendah. JAI Press, London, pp 1-
61
Suzuki M, Ishikawa M, Okuda H, Noda K, Noda K, Kishimoto T,
Nakamura T, Ogiwara I, Shimura I, Akihama T (2006)
Perubahan fisiologis pada tunas ketiak gentian selama prakultur
dua langkah dengan sukrosa yang memberikan tingkat toleransi
yang tinggi terhadap pengeringan dan pengawetan krioproteksi.
Ann Bot 97: 1073-1081
Takagi H, Thinh NT, Islam OM, Senboku T, Sakai A (1997)
Kriopreservasi ujung pucuk talas yang ditumbuhkan secara
invitro (Colocasia escu-lenta (L.) Schott) dengan cara vitrifikasi.
1. Investigasi kondisi dasar dari prosedur vitrifikasi. Plant Cell
Rep 16:594-599
Thinh NT (1997) Kriopreservasi plasma nutfah tanaman monokotil
tropis yang diperbanyak secara vegetatif dengan vitrifikasi. Dr
Pap Fac Agric Kobe Univ Jepang
Touno K, Yoshimatsu K, Shimomura K (2006) Karakteristik akar
berbulu Atropa belladonna yang dikriopreservasi dengan metode
vitrifikasi . CryoLetters 27:65-72
Turgut-Kara N, Kahraman BÜ (2015) Pengaruh kultur jangka
panjang kalus Astragalus chrysochlorus terhadap morfologi,
struktur genetik, ekspresi gen dan metabolisme. Plant Biosyst
149:329-336
Uchendu EE, Muminova M, Gupta S, Reed BM (2010) Senyawa
antioksidan dan anti stres meningkatkan pertumbuhan kembali
ujung tunas Rubus yang diawetkan secara kriopreservasi . Vitro
Cell Dev Biol 46:386-393
Varghese B, Naithani SC (2008) Perubahan yang berhubungan dengan
metabolisme oksidatif pada biji mimba (Azadirachta indica A.
Juss.) yang disimpan secara kriogenik. J Plant Physiol 165:755-
765
Wang RR, Gao XX, Chen L, Huo LQ, Li MF, Wang QC (2014)
Pemulihan tunas dan integritas genetik ujung tunas krisan
morifolium setelah kriopreservasi dengan vitrifikasi tetesan. Sci
Hortic (Amsterdam) 176:330-339
Wen B, Wang R, Cheng H, Song S (2010) Perubahan sitologi dan
fisiologi pada embrio jagung ortodoks selama kriopreservasi.
Protoplasma 239:57-67
13
Hortikultura, Lingkungan, dan Bioteknologi (2019) 60:501-510
Wesley-Smith J, Berjak P, Pammenter NW, Walters C (2013) Es
intra seluler dan kelangsungan hidup sel pada sumbu embrionik
yang terpapar krio dari biji bandel Acer saccharinum: studi
ultrastruktural tentang faktor-faktor yang mempengaruhi struktur
sel dan es. Ann Bot 113: 695-709
Wu YL, Shen XH (2011) Kriopreservasi Dendrobium wardianum
Peringatan. protokorm dengan vitrifikasi. Chin J Cell Bio 33:
279-287 Xie JT, Attele AS, Yuan CS (2006) Ginseng: efek
menguntungkan dan efek merugikan potensial. Dalam: Yuan CS,
Beiber E, Bauer BA (eds) Buku teks
terapi komplementer dan alternatif. CRC Press Company, Boca
Raton, London, New York, Washington, DC, hal 71-89
Xue SH, Luo XJ, Wu ZH, Zhang HL, Wang XY (2008) Penyimpanan
dingin dan kriopreservasi kultur akar berbulu tanaman obat
Eruca sativa Mill., Astragalus membranaceus dan Gentiana
mac- rophylla Pall. Plant Cell, Tissue Organ Cult 92:251-260
Yi JY, Sylvestre I, Colin M, Salma M, Lee SY, Kim HH, Park HJ,
Engelmann F (2012) Peningkatan kriopreservasi menggunakan
vitrifikasi tetesan dan perubahan histologis yang terkait dengan
kriopreservasi Madder (Rubia akane Nakai). Korean J Hortic Sci
Tech- nol 30:79-84
Yoon JW, Kim HH, Ko HC, Hwang HS, Hong ES, Cho EG,
Engelmann F (2006) Kriopreservasi varietas kentang budi daya
dan kentang liar melalui vitrifikasi tetesan: pengaruh subkultur
tanaman induk dan prakultur ujung tunas. CryoLetters 27:211-
222
Yoshimatsu K, Touno K, Shimomura K (2000) Kriopreservasi
sumber daya tanaman obat: retensi kemampuan biosintesis pada
kultur yang telah ditransformasi. Dalam: Kriopreservasi plasma
nutfah tumbuhan tropika: kemajuan penelitian dan aplikasi
terkini. Prosiding lokakarya internasional, Tsukuba, Jepang,
Oktober 1998. International Plant Genetic Resources Institute
(IPGRI), hal 77-88
Zhang D, Ren L, Gq Chen ZJ, Reed BM (2015) Stres oksidatif yang
diinduksi ROS dan kejadian seperti apoptosis secara langsung
mempengaruhi viabilitas sel kalus embriogenik yang
dikriopreservasi di Agapanthus praecox. Perwakilan Sel
Tanaman 34: 1499-1513
Catatan Penerbit Springer Nature tetap netral dalam hal klaim
yurisdiksi dalam peta yang diterbitkan dan afiliasi kelembagaan.