Pharma Forum 2023

Validasi Metode Analisis

Cemaran Dalam Sediaan
Obat

Jakarta, 21 Agustus 2021

Mirawati Siregar
disampaikan pada

Pharma Forum 2023

1
 1.Pendahuluan

2.Persiapan

3.Validasi MA

Pharma Forum 2023

4.Kriteria Keberterimaan
Outline

5.Kesimpulan
2
 Validitas suatu prosedur analisis hanya dapat
dibuktikan melalui hasil uji laboratorium. Oleh
karena itu kelengkapan dokumentasi dari
setiap pengujian merupakan suatu persyaratan
dasar dalam menentukan kesesuaian prosedur
1. Pendahuluan
tersebut dengan tujuan penggunaannya.

Pharma Forum 2023

Pengguna metode analisis yang tertera dalam
farmakope tidak dipersyaratkan untuk
memvalidasi akurasi dan reliabilitas tetapi
cukup memverifikasi kesesuaiannya pada
kondisi nyata penggunaannya (verifikasi)
3
Pengujian Cemaran Organik dalam bahandan produkobat
Umumnya menggunakan metode HPLC detektor UV/PDA

• Uji Batas (Limit • Menggunakan Baku pembanding

Pengujian test) cemaran
Pengujian
Cemaran • Uji Kuantitatif • Tanpa Baku Pembanding Cemaran
Cemaran • Relative Response Factor (RRF)
organik (Quantitative organik • Relative Retention Time (RRT)
Test)
• Normalization area
Pharma Forum 2023

PENYUSUNAN PROTOKOL

Sebelum aktifitas validasi dimulai, parameter-paramenter validasi

yang akan dilakukan dan kriteria keberterimaan harus ditetapkan
terlebih dahulu, didokumentasikan, dan disetujui

OPTIMASI
2.
PERSIAPAN Untuk mencari sistem alat pada instrument yang digunakan misal
VALIDASI MA kesesuaian kolom, komposisi fase gerak, pH fase gerak dll.

UJI STABILITAS

Larutan baku/sampel: untuk melihat kestabilan larutan baku ataupun

larutan sampel, sehingga perubahan yang mungkin terjadi dapat
diantisipasi lebih awal
5
 Penggunaan
ExternalStandard
• Konsentrasi cemaran dihitung
berdasarkan perbandingan area
sampel dengan baku cemaran
individual atau melalui kurva
baku cemaran.
• Dapat dilakukan melalui
• Single-point calibration
• Multi-point calibration

6
3.Validasi MA

7
 Validasi Metode Analisis
Validasi suatu prosedur
analisis adalah proses
yang ditetapkan melalui
kajian laboratorium
bahwa karakteristik
kinerja prosedur
tersebut telah
memenuhi persyaratan
sesuai dengan tujuan Farmakope Indonesia VI

penggunaannya
Pharma Forum 2023 8
 Kategori I Prosedur analisis untuk penetapan kadar komponen
utama dalam bahan baku obat atau bahan aktif (termasuk
pengawet) dalam sediaan obat jadi.

Kategori II Prosedur analisis untuk penetapan cemaran

dalam bahan baku obat atau senyawa hasil degradasi dalam
sediaan obat jadi. Prosedur ini terdiri dari penetapan
Katagori kuantitatif dan uji batas.

Validasi Kategori III Prosedur analisis untuk penetapan karakteristik

kinerja sediaan (misalnya disolusi, pelepasan obat).

Kategori IV Prosedur analisis untuk identifikasi.

Pharma Forum 2023 9

Pharma Forum 2023

Karakteristik Kinerja Analitik yang

dibutuhkan Untuk Validasi Metode Analisis

10
 Revalidasi perlu dilakukan dalam kasus berikut:

Revalidasi penggunaan suatu prosedur umum yang telah

ditetapkan pada produk baru atau bahan baku baru.
Menurut dokumen International Conference on
Harmonization (ICH) revalidasi perlu dilakukan jika
terjadi : perubahan dalam sintesis senyawa obat,
perubahan dalam komposisi sediaan farmasi, dan
perubahan dalam prosedur analisis.

Pharma Forum 2023 11

 • Spesifisitas atau selektifitas adalah kemampuan
menguji secara tepat suatu analit dengan adanya
komponen lain dan diperkirakan ada sebagai
cemaran, hasil degradasi, dan matriks sampel.
Berguna untuk:
untuk mengidentifikasi senyawa uji dalam setiap sampel yang diuji; menilai
kemampuan metode menetapkan kadar bahan aktif atau cemaran secara
kuantitatif dalam setiap sampel yang diuji; Resolusi antar puncak senyawa
yang ada;

a.Spesifisitas • Penetapan:
- Menggunakan sampel (+) dan sampel (-)
mengandung analit.
- Cemaran: spesifisitas dilakukan dengan menetapkan
sejumlah tertentu cemaran yang ditambahkan pada
senyawa obat atau sediaan farmasi, dan hasilnya
menunjukkan cemaran tersebut ditetapkan dengan
akurasi dan presisi yang memadai.

Pharma Forum 2023 12

a.Spesifisitas……lanjutan
• Jika baku cemaran atau hasil urai tidak tersedia, maka spesifisitas
ditunjukkan dengan membandingkan hasil analisis sampel yang
mengandung cemaran atau hasil urai terhadap hasil prosedur lain yang
sudah divalidasi.
• Pembandingan hasil analisis meliputi juga sampel yang disimpan pada
kondisi perlakuan yang relevan (misalnya pengaruh cahaya, panas, lembab,
hidrolisis asam/basa, dan oksidasi). Dalam kasus uji kemurnian
kromatografi, maka profil cemaran harus dibandingkan.
• Uji kemurnian puncak (dengan ”Diode Array” atau Spektrometri Massa)
dapat digunakan untuk menunjukkan bahwa puncak kromatogram analit
tidak mengandung komponen lain.
Pharma Forum 2023 13
Pharma Forum 2023

Uji degradasi paksa dilakukan dengan cara memperlakukan

larutan Baku atau Larutan Uji dengan kondisi kritis yang
dapat membentuk degradan seperti :
- pemaparan cahaya, panas,
- variasi pH,
Force - kelembaban,
Degradation - penambahan asam,
- penambahan basa serta
- kondisi kritis lain yang spesifik terhadap senyawa atau
analit yang diuji.

14
Pharma Forum 2023

b.Presisi

• Presisi prosedur analisis adalah tingkat kedekatan diantara hasil uji individu bila prosedur
diterapkan berulangkali terhadap sampling ganda atau sampel yang homogen. Presisi
biasanya dinyatakan sebagai simpangan baku atau simpangan baku relatif (koefisien
variasi) dari satu seri pengukuran. Presisi merupakan ukuran tingkat reprodusibilitas atau
repitibilitas prosedur analisis dalam kondisi kerja normal
• Presisi antara (ruggedness) →pada hari yang berbeda atau oleh analis yang berbeda atau
peralatan yang berbeda di laboratorium yang sama.
• Repitibilitas →laboratorium yang sama dalam periode waktu yang singkat oleh analis yang
sama dengan peralatan yang sama

15
Pharma Forum 2023

b.Presisi…lanjutan

• Presisi prosedur analisis ditetapkan dengan menentukan kadar sejumlah memadai larutan
sampel homogen beberapa kali, sehingga hasil pengujian dapat dihitung secara statistik
perkiraan dari simpangan baku atau simpangan baku relatif (koefisien variasi).
• Penetapan kadar ini merupakan analisis terhadap sampel yang dilakukan secara lengkap
mulai dari penyiapan sampel hingga diperoleh hasil akhir pengujian.
• Dokumen ICH merekomendasikan bahwa repitibilitas ditentukan dengan menggunakan
minimal 9 penetapan meliputi suatu rentang konsentrasi khusus untuk prosedur (misalnya
3 konsentrasi dan 3 replikasi untuk masing-masing konsentrasi, atau minimal 6 penetapan
pada konsentrasi uji 100%)

16
Pharma Forum 2023

Akurasi suatu prosedur analisis adalah tingkat kedekatan

antara hasil pengujian dengan prosedur yang sedang
divalidasi terhadap nilai yang benar. Akurasi prosedur analisis
harus ditetapkan meliputi rentang nilai benar tersebut.

Penetapan Dalam kasus pengujian senyawa obat, akurasi

ditetapkan dengan penerapan prosedur analisis tersebut
pada analit yang diketahui kemurniannya (misalnya bahan
c. Akurasi pembanding) atau dengan pembandingan hasil analisis
dengan prosedur lain yang telah ditetapkan akurasinya

Dokumen ICH merekomendasikan bahwa akurasi ditetapkan

dengan menggunakan minimal 9 penetapan meliputi 3
tingkat konsentrasi berbeda yang telah ditetapkan (misalnya
3 konsentrasi dan 3 replikasi untuk masing-masing
konsentrasi).

17
 Merupakan konsentrasi terendah analit dalam
sampel yang dapat dideteksi, tetapi tidak perlu
kuantitatif dalam kondisi percobaan yang
ditentukan.
Uji batas semata-mata menunjang bahwa
konsentrasi analit di bawah atau di atas aras
d.BATAS tertentu. Batas deteksi umumnya dinyatakan
sebagai konsentrasi analit (misalnya persen, bpj,
DETEKSI bpm) dalam sampel.
Penetapan
Batas deteksi umumnya ditetapkan dengan
analisis sampel yang mengandung analit dalam
kadar yang diketahui dan menentukan kadar
analit terendah yang dapat dideteksi dengan baik.
Pharma Forum 2023 18
 • Konsentrasi minimum analit yang masih
dapat dideteksi dapat ditentukan pada
perbandingan ”signal-to-noise” 2:1 atau
BATAS 3:1.
• Pendekatan lain tergantung pada
DETEKSI… penetapan arah garis kurva kalibrasi dan
standar deviasi respons. Selanjutnya
lanjutan batas deteksi dapat divalidasi dengan
menganalisis sejumlah sampel yang
diketahui kadarnya mendekati atau
dipersiapkan pada batas deteksinya

Pharma Forum 2023 19

e.BATAS KUANTITASI
• Batas kuantitasi adalah konsentrasi terendah dari
analit dalam sampel yang ditetapkan dengan
akurasi dan presisi yang dapat diterima dalam
kondisi percobaan yang telah ditetapkan. Batas
kuantitasi dinyatakan sebagai konsentrasi analit
(misalnya persen,bpj, bpm) dalam sampel.
• Penetapan
Ditetapkan dengan melakukan analisis sampel
yang mengandung analit dalam jumlah yang
diketahui dan menetapkan kadar terendah analit
yang dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi
yang dapat diterima.

Pharma Forum 2023 20

BATAS KUANTITASI
• Konsentrasi minimum analit dapat ditentukan pada perbandingan
”signal-to-noise” 10:1. Pendekatan lain tergantung pada penentuan
arah garis kurva kalibrasi dan standar deviasi dari respons.
Selanjutnya batas kuantitasi divalidasi dengan analisis terhadap
sejumlah sampel yang mengandung analit mendekati atau
dipersiapkan mengandung analit pada batas kuantitasinya.

Pharma Forum 2023 21

 • Linearitas adalah kemampuannya untuk
menunjukkan hasil uji yang secara langsung atau
dengan melalui transformasi matematik yang tepat
proporsional terhadap konsentrasi analit dalam
sampel dalam rentang yang diberikan (hubungan
linear antara konsentrasi dan hasil pengukuran
f.LINEARITAS pengujian).
DAN • Penetapan
Linearitas dapat ditentukan sepanjang rentang
RENTANG prosedur analisis.
Data dari garis regresi dapat membantu untuk
menunjukan perkiraan derajat linearitas, seperti
koefisien korelasi, perpotongan sumbu y, arah garis
regresi dan jumlah kuadrat residu garis regresi yang
dapat diterima.

Pharma Forum 2023 22

Pharma Forum 2023

Rentang adalah interval antara batas tertinggi dan

batas terendah dari kadar analit yang telah dibuktikan,
dapat ditentukan dengan presisi, akurasi dan linearitas
yang sesuai menggunakan prosedur analisis yang
ditetapkan. Rentang umumnya dinyatakan dalam
f.LINEARITAS satuan yang sama dengan hasil uji (misalnya persen,
bpj, bpm) yang diperoleh dengan prosedur analisis ini.
DAN
RENTANG
Rentang prosedur divalidasi dengan membuktikan
bahwa prosedur analisis memberikan presisi, akurasi
dan linearitas yang dapat diterima ketika diterapkan
pada sampel yang mengandung analit pada
konsentrasi ekstrim yang berada pada rentang.

23
Pharma Forum 2023

ICH merekomendasikan bahwa

linearitas ditetapkan dengan
menggunakan minimal 5
f.LINEARITAS konsentrasi yang digunakan secara
DAN normal.
RENTANG Penetapan cemaran: dari 50%
hingga 120% dari kriteria
keberterimaan.

24
Pharma Forum 2023

g.Ketegaran

• Merupakan ukuran kemampuan prosedur untuk tetap bertahan

dan tidak terpengaruh oleh keragaman kecil yang disengaja pada
parameter prosedur yang terdapat dalam dokumen. Ketegaran
dapat ditentukan pada waktu pengembangan prosedur analisis.
• Sebaiknya untuk perubahan system mengacu pada <931>
Kromatografi, Kesesuaian Sistem

25
4.Kriteria Keberterimaan

26
Pharma Forum 2023

Kriteria Kebeterimaan

Kriteria Keberterimaan ditetapkan terlebih dahulu pada Protokol Uji sebelum mulai
melakukan Validasi Metode Analisis. Laboratorium dapat memilih kriteria
berdasarkan acuan yang dipilih dan tertelusur.

Uji Spesifisitas
• Tidak ada puncak pada pelarut yang memiliki waktu retensi yang sama dengan waktu retensi larutan baku.
• Kromatogram Larutan Uji dan Larutan Spiked mempunyai waktu retensi yang sama dengan larutan baku.
• Kromatogram Larutan uji dan larutan spiked mempunyai puncak tunggal (murni).
• Peak purity index puncak pada kromatogram Larutan Spiked, Larutan Uji dan Larutan Baku ≥0,99

27
Pharma Forum 2023

Kriteria Kebeterimaan
Uji Presisi
• Simpangan Baku Relatif (RSD): ≤ 2,0%
• Simpangan Baku Relatif untuk metode tertentu, menggunakan kriteria yang tercantum dalam acuan yang
digunakan (seperti: Kromatografi Gas, AAS, Ion Kromatografi)
• Sampel dengan kondisi tertentu atau memerlukan perlakuan khusus, persyaratan simpangan baku relatif
dapat menggunakan tabel berikut:
% Analit Rasio Analit Unit RSD (%)
Analyte (%) Analyte Ratio Unit RSD
100 1 100% 1.3
10 10-1 10% 1.8
1 10-2 1% 2.7
0.1 10-3 0.1% 3.7
0.01 10-4 100 ppm 5.3
0.001 10-5 10 ppm 7.3
0.0001 10-6 1 ppm 11
0.00001 10-7 100 ppb 15
0.000001 10-8 10 ppb 21
0.0000001 10-9 1 ppb 30

• Sumber: Huber, L. (2010). Validation of Analytical Methods, Germany Agilent Technologies.

28
 Uji Akurasi

Kriteria Kebeterimaan
Sumber: Huber, L. (2010). Validation of Analytical Methods, Germany
Agilent Technologies.

No. % Zat aktif Rasio analit Unit (Unit) Rata-rata (%)

(% Analyte) (Analyte Ratio) (Mean (%)

1. 100 1 100% 98-102

2. ≥ 10 10-1 10% 98-102

3. ≥1 10-2 1% 97-103

Pharma Forum 2023

4. ≥ 0,1 10-3 0,1% 95-105

5. 0,01 10-4 100 ppm 90-107

6. 0,001 10-5 10 ppm 80-110

7. 0,0001 10-6 1 ppm 80-110

8. 0,00001 10-7 100 ppb 80-110

9. 0,000001 10-8 10 ppb 60-115

10. 0,0000001 10-9 1 ppb 40-120

29
 Linieritas Metode
• Koefisien korelasi regresi (r) ≥ 0,99 dan
Vx0 ≤5,0%
Robustness
• Tidak ada perbedaan bermakna antara variasi

Kriteria parameter metode apabila:

F hitung ≤ F kritis/tabel, α 0,05%

Kebeterimaan

Pharma Forum 2023

LOD dan LOQ
• Nilai S/N pada limit deteksi ≥ 3
• Nilai S/N pada limit kuantisasi ≥ 10

30
 • Validasi Metode Analisis dengan pemenuhan
kriteria yang telah ditetapkan sebelumnya
memberikan keyakinan bahwa MA yang
5. KESIMPULAN akan digunakan telah sesuai peruntukannya
• Kriteria keberterimaan masing masing

Pharma Forum 2023

parameter ditetapkan sebelum melakukan
validasi (POB Validasi MA)

31
 • Kementerian Kesehatan RI, Farmakope Indonesia ed. VI,
Validasi Prosedur Dalam Farmakope <1381>, 2020
• ICH Harmonised Tripartite Guideline, Validation of
Analytical Prosedure: Text and Methodology Q2 (R1).
(2014).
• USP 43 NF General Chapter <1225> : Validation of
Compendial Procedures, 2020
• Huber, L. Validation of Analytical Methods, Germany

Pharma Forum 2023

Agilent Technologies. (2010).
Pustaka

32
 33

Pharma Forum 2023