Machine Translated by Google
Jurnal Internasional
Penelitian Lingkungan dan
Kesehatan Masyarakat
Artikel
Wawasan Asparaginase dari Jamur Endofit
Lasiodiplodia theobromae: Pemurnian, Karakterisasi dan
Aktivitas Antileukemia
1 Hani A. Moubasher, Bassem A. Balbool 2,*, Yosra A. Helmy3 , Amnah Muhammad Alsuhaibani 4 ,
Ahmed A. Atta 5, Donia H. Sheir 6 dan Ahmed M. Abdel-Azeem 7,*
Kutipan: Moubasher, HA; Balbool,
BA; Helmy, YA; Alsuhaibani, AM;
Atta, AA; Sheir, DH; Abdel-Azeem,
AM Wawasan Asparaginase dari Jamur
Endofit Lasiodiplodia theobromae:
Pemurnian,
Karakterisasi dan Antileukemia
Aktivitas. Int. J.Lingkungan. Res.
Kesehatan Masyarakat 2022, 19, 680. https://
doi.org/ 10.3390/ijerph19020680
Editor Akademik: Giovanni Bacci,
Matteo Ramazzotti dan
Niccolo Meriggi
Diterima: 10 November 2021
Diterima: 24 Desember 2021
Diterbitkan: 7 Januari 2022
Catatan Penerbit: MDPI tetap netral
sehubungan dengan klaim yurisdiksi dalam
peta yang dipublikasikan dan afiliasi institusi.
ionisasi.
Hak Cipta: © 2022 oleh penulis.
Pemegang Lisensi MDPI, Basel, Swiss.
Artikel ini adalah artikel akses terbuka
didistribusikan berdasarkan syarat dan
ketentuan Creative Commons
Lisensi Atribusi (CC BY) ( https://
creativecommons.org/licenses/by/
4.0/).
Int. J.Lingkungan. Res. Kesehatan Masyarakat 2022, 19, 680. https://doi.org/10.3390/ijerph19020680
1
Departemen Botani dan Mikrobiologi, Fakultas Sains, Universitas Kairo, Giza 12613, Mesir;
moubasher@sci.cu.edu.eg
2
Departemen Bioteknologi, Fakultas Bioteknologi, Universitas Oktober untuk Sains dan Seni Modern, 6 Oktober 12451,
Mesir Departemen Kebersihan
3
Hewan, Zoonosis dan Etologi Hewan, Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Terusan Suez, Ismailia 41522 , Mesir;
yosra_helmy@vet.suez.edu.eg Departemen Ilmu Olahraga Jasmani,
4
Sekolah Tinggi Pendidikan, Universitas Putri Nourah binti Abdulrahman, PO Box 84428, Riyadh 11671, Arab Saudi;
amalsuhaibani@pnu.edu.sa Departemen Fisika, Sekolah Tinggi Sains, Universitas
5
Taif, PO Box 11099, Taif 21944, Arab Saudi; a.atta@tu.edu.sa
6
Departemen Kimia Produk Alam dan Mikroba, Pusat Penelitian Nasional, Giza 12622, Mesir; donia_sheir@yahoo.com
Departemen Botani dan
7
Mikrobiologi, Fakultas Sains, Universitas Suez Canal, Ismailia 41522, Mesir * Korespondensi: bbalbool@msa.edu.eg
(BAB); ahmed_abdelazeem@science.suez.edu.eg (AMA-A.)
Abstrak: Jamur endobiotik dianggap sebagai reservoir berbagai metabolit aktif. Asparaginase digunakan
sebagai obat antileukemia khususnya untuk mengobati leukemia limfoblastik akut. Penelitian yang disajikan
bertujuan untuk mengoptimalkan kondisi media, memurnikan, mengkarakterisasi, dan menguji aktivitas
antileukemik asparaginase yang diinduksi dari Lasiodiplodia theobromae. Media kultur dioptimalkan
menggunakan eksperimen yang dirancang oleh model The Taguchi dengan aktivitas berkisar antara 10 hingga 175 IU
Asparaginase diinduksi dengan aktivitas 315 IU/mL. Asparaginase dimurnikan dengan aktivitas spesifik
468,03 U/mg dan aktivitas total 84,4 IU/mL. Asparaginase yang dimurnikan menunjukkan ukuran
perkiraan 70 kDa. Asparaginase yang dimurnikan menunjukkan suhu optimum 37 ÿC dan pH optimum
6. SDS menurunkan aktivitas asparaginase menjadi 0,65 U/mL sedangkan surfaktan ionik yang
digunakan meningkatkan aktivitas enzim hingga 151,92 IU/mL. Asparaginase yang dimurnikan
menunjukkan Km 9,37 µM dan Vmax 127,00 µM/mL/menit. Asparaginase yang dimurnikan menunjukkan
IC50 sebesar 35,2 ± 0,7 IU/mL dengan garis sel leukemia M-NFS-60 dan CC50 sebesar 79,4 ± 1,9 IU/
mL dengan garis sel WI-38 normal. Studi yang disajikan menunjukkan penggunaan jamur endofit
sebagai sumber metabolit berkelanjutan seperti asparaginase, memberikan peluang untuk
mengembangkan sintesis obat antileukemik yang mudah, ramah lingkungan, hemat biaya, dan cepat,
yang berpotensi untuk digunakan sebagai sumber alternatif dan terpercaya untuk agen antikanker yang manjur.
Kata kunci : metabolit1 ; jamur endofit; asparaginase; induksi; pemurnian; antileukemia
1. Perkenalan
Jamur endobiotik (endofit) adalah jamur mikro yang hidup di dalam jaringan tanaman
inang secara interseluler dan/atau intraseluler tanpa gejala patologis yang jelas [1]. Untuk
dapat mempertahankan simbiosis yang stabil, endofit mengeluarkan zat kimia untuk
membantu tanaman menyesuaikan diri dengan lingkungan yang keras [2]. Sebagai harta
karun metabolit bioaktif, jamur endofit merupakan sumber berkelanjutan dari berbagai
produk alami yaitu: kuinon, saponin, alkaloid, steroid, asam fenolik, terpenoid, dan tanin
yang menunjukkan sifat antimikroba dan antikanker [3].
https://www.mdpi.com/journal/ijerph
Machine Translated by Google

Int. J.Lingkungan. Res. Kesehatan Masyarakat 2022, 19, 680 2 dari 14

Asparaginase (EC 3.5.1.1) diklasifikasikan di antara midohidrolase, menghidrolisis )

asparagin menjadi asam aspartat (aspartat) dan amonium (NH4 + [4]. Clementi [5] melaporkan

asparaginase untuk pertama kalinya dalam serum kelinci percobaan. Selanjutnya, Mashburn [6]
mengekstraksi asparaginase dari E.coli dan melaporkan sifat antileukemiknya untuk pertama kalinya.
Data klinis yang dipublikasikan selama dua dekade terakhir menunjukkan bahwa asparaginase
merupakan elemen penting dalam pengobatan leukemia limfoblastik akut (ALL) [6,7]. Baik sel normal
maupun leukemia membutuhkan asam amino asparagine untuk proses proliferasi. Sel normal dapat
mensintesis asparagin untuk pertumbuhannya dengan bantuan asparagin sintetase (AS, EC 6.3.5.4).
Sementara, sel-sel neoplastik kekurangan asparagine sintetase [8], sehingga mereka bergantung
pada serum asparagine untuk tumbuh dan berkembang biak. Pemberian asparaginase pada SEMUA
pasien akan menghabiskan serum asparagine karena aktivitas hidrolitiknya, yang akan menyebabkan
penghambatan proses proliferasi sel neoplastik dan sebagai imbalannya sel tersebut akan mati dan
terhenti pada fase G-1 [9].
Produksi asparaginase ekstraseluler terutama bergantung pada optimalisasi kondisi budaya,
untuk memproduksinya dalam jumlah besar dengan metode yang murah. Produksinya terutama
didasarkan pada optimalisasi sumber karbon dan nitrogen, parameter lain seperti; pH, suhu dan ukuran
inokulum [10].
Metode yang berbeda dilaporkan untuk menghasilkan asparaginase dari mikroorganisme
termasuk fermentasi keadaan padat dan fermentasi terendam— metode induksi dan pemurnian
bervariasi antar mikroorganisme [7-10]. Beberapa percobaan dirancang oleh para ilmuwan untuk
memurnikan asparaginase dengan kemurnian dan hasil yang tinggi untuk menggunakan asparaginase
sebagai obat [11-14]. Uji coba tersebut meliputi pengendapan protein total menggunakan amonium
sulfat diikuti dengan kromatografi kolom penukar ion [15]. Laporan lain menggunakan amonium sulfat
diikuti dengan kromatografi filtrasi gel eksklusi ukuran [16,17]. Peneliti lain menggunakan kolom
afinitas untuk pemurnian langsung asparaginase [18].
Asparaginase yang dimurnikan dari E. coli dan Erwinia chrysanthemi digunakan secara klinis
untuk mengobati leukemia limfoblastik akut, namun menunjukkan efek samping alergi yang
menyebabkan kematian [19-21]. Efek samping keras yang terkait dengan bakteri asparaginase terkait
dengan asal prokariotik dari enzim yang dimurnikan [19]. Oleh karena itu, para peneliti mulai
menargetkan jamur sebagai sumber eukariotik alternatif yang aman untuk memproduksi asparaginase
guna mengurangi reaksi alergi terkait [22]. Asparaginase tercatat dari beberapa spesies jamur seperti
Mucor hiemalis, Aspergillus niger, A. flavus, A. nidulans, A. terreus [23,24].
Karena kemampuan endofit dalam menghasilkan beberapa enzim dan produk alami
lainnya dengan aktivitas tinggi, peneliti menargetkan jamur endofit sebagai sumber asparaginase.
Balbool dkk. menyaring kemampuan 25 isolat jamur endofit dalam menghasilkan asparaginase , 7
isolat menunjukkan hasil asparaginase positif. Lasiodiplodia theobromae mencatat aktivitas
asparaginase tertinggi dari isolat yang diuji [24].
Penelitian ini berfokus pada produksi asparaginase dengan aktivitas maksimal
dengan mengoptimalkan kondisi medium dan induksi asparaginase dari Lasidiplodia
theobromae, dilanjutkan dengan pemurnian asparaginase dan karakterisasi
asparaginase yang telah dimurnikan. Selanjutnya, aktivitas antileukemik dari
asparaginase yang dimurnikan diuji terhadap sel karsinoma leukemia myelogenous tikus (M-NF
2. Bahan dan Metode 2.1.
Mikroorganisme
Lasiodiplodia theobromae diperoleh dari Suez Canal University Fungarium, Ismailia, Mesir (SCUF-
TP2016). Hal ini dipilih berdasarkan penelitian lanjutan dari penelitian sebelumnya yang dilakukan
oleh Balbool [24].

2.2. Optimasi Kondisi Media dan Induksi Asparaginase Untuk

mengoptimalkan kondisi kultur agar menghasilkan asparaginase dengan aktivitas maksimal
digunakan model statistik Taguchi [25]. Desain eksperimen menciptakan beberapa kondisi sebagai
susunan ortogonal untuk memastikan eksperimen yang efisien dan dapat direproduksi dengan
kesalahan minimal. Selama desain eksperimen yang disajikan, tiga variabel dipelajari
Machine Translated by Google

Int. J.Lingkungan. Res. Kesehatan Masyarakat 2022, 19, 680 3 dari 14

suhu 28 ÿC; asparagine (sumber nitrogen), glukosa (sumber karbon), dan pH. Masing-
masing dari ketiga variabel tersebut diwakili oleh tiga tingkat variasi. Ukuran percobaan
adalah sembilan percobaan (tata letak L9) dengan derajat kebebasan 8 [26], (untuk lebih
jelasnya silakan cek materi pelengkap).
Menghasilkan asparaginase dengan aktivitas maksimal; Cakram L. theobromae berukuran 5 mm
diinokulasi dalam 10 labu berisi 100 mL media Malt Extract Agar (MEA) dan diinkubasi selama 7 hari
pada suhu 28 ÿC. Satu liter asparagin 1% (substrat) disiapkan dalam air suling dan didistribusikan ke
dalam 10 labu (100 mL), dan kemudian diautoklaf pada suhu 121 ÿC selama 15 menit. Lapisan jamur
yang tumbuh (rata-rata 0,2 g untuk setiap labu) dipindahkan ke dalam setiap labu dan diinkubasi pada
suhu 28 ÿC selama 48 jam.
Aktivitas enzim diperkirakan dengan Nesslerisasi terarah menurut Wriston [27]
menggunakan asparagine sebagai substrat. Aktivitas enzim dinyatakan dalam satuan
internasional (IU); IU didefinisikan sebagai jumlah enzim yang dibutuhkan untuk melepaskan
satu mikromol amonium per menit pada pH = 7,00 dan 37 ÿC. Aktivitas tersebut diperkirakan
dan dibandingkan dengan hasil desain Taguchi.

2.3. Pemurnian Asparaginase

2.3.1. Curah Hujan Protein Total
Pengendapan protein ekstraseluler dilakukan dengan metode pengendapan aseton dingin
[28]. Aseton disimpan pada suhu ÿ80 ÿC sebelum pengendapan, 2x aseton dingin ditambahkan
ke filtrat kultur dan diinkubasi pada suhu ÿ20 ÿC selama 2 jam. Sampel disentrifugasi pada 13.000
rpm selama 15 menit pada suhu 4 ÿC. Supernatan dibuang, dan pelet yang diperoleh dilarutkan
dalam volume buffer Tris 50 mM yang sesuai (pH 7) dan disimpan pada suhu ÿ80 ÿC hingga
digunakan lebih lanjut.

2.3.2. Kromatografi Pertukaran Ion

Endapan asparaginase yang terkumpul selanjutnya difraksinasi dengan kolom
penukar ion yang telah dikemas (Hi-trap-Q-FF, 5 mL, GE). Kolom diseimbangkan dengan
5x volume kolom buffer Tris (sampai mencapai stabilitas dasar UV) (50 mM, pH 7). Enzim
dielusi dengan gradien konsentrasi NaCl (0–1 M) dengan laju 1,5 mL/menit. Aktivitas
tersebut diperkirakan. Fraksi yang menunjukkan aktivitas enzimatik tinggi dikumpulkan
bersama, dipekatkan menggunakan aseton dingin dan aktivitas enzim serta protein total
diperkirakan. Fraksi yang terkumpul selanjutnya dimurnikan menggunakan kromatografi
filtrasi gel menggunakan Sephadex G-100.

2.3.3. Pengecualian Ukuran Kromatografi Filtrasi

Gel Endapan asparaginase yang dikumpulkan dari kolom penukar ion selanjutnya
difraksinasi dengan filtrasi gel kolom Sephadex G-100. Setelah 2 hari pembengkakan
partikel Sephadex G100, resin dituangkan ke dalam kolom (2 × 40 cm), dan kolom
diseimbangkan dengan buffer Tris (50 mM, pH 7), dengan laju aliran 12 mL/jam. Enzim
dimasukkan ke bagian atas kolom, dielusi dengan buffer yang sama, dan aktivitas,
kandungan protein, dan homogenitas molekul dari fraksi yang dielusi dinilai. Fraksi
yang paling aktif dikumpulkan untuk diperiksa di SDS–PAGE.

2.4. Estimasi Total Protein

Konsentrasi protein total diperkirakan dengan mengukur serapan pada 280 nm.
Pertama, kurva standar Bovine serum albumin (BSA) dibuat. Pengenceran BSA yang berbeda
mulai dari 50 hingga 450 µg/mL dibuat dengan menambahkan larutan stok BSA dengan volume
yang memadai (1 mg/mL) dan air suling ganda ke dalam tabung reaksi. Grafik serapan versus
konsentrasi digunakan untuk memperkirakan kandungan protein dari sampel protein yang tidak
diketahui (Bahan Pelengkap).
Machine Translated by Google

Int. J.Lingkungan. Res. Kesehatan Masyarakat 2022, 19, 680 4 dari 14

Estimasi Berat Molekul Enzim Menggunakan SDS PAGE

Homogenitas pita dan berat molekul asparaginase yang dimurnikan diperkirakan
menggunakan SDS-PAGE sesuai dengan instruksi Laemmli [29], menggunakan 12%
gel pemisah (6,8) dan 5% gel susun (pH 8,8). Berat molekul pita protein yang muncul
dihitung dari inferensi penanda protein asli (BLUEstain™ 2 Protein ladder, 5-245
kDa). Penanda terdiri dari sekitar 0,1–0,4 mg/mL setiap protein dalam buffer (20 mM
Trisfosfat, pH 7,5 pada 25 ÿC), 2% SDS, 0,2 mM Dithiothreitol, 3,6 M Urea, dan 15%
(v/ v) Gliserol). Pita protein diwarnai dengan Coomassie brilian biru R-250.

2.5. Karakterisasi Enzim 2.5.1.

Penentuan Suhu dan Stabilitas Reaksi Optimal
Untuk mempelajari pengaruh suhu pada asparaginase yang dimurnikan, 0,25 mL enzim yang
dimurnikan diinkubasi terlebih dahulu dengan 0,75 mL buffer Tris 50 mM (pH 7) pada kisaran suhu dari 20
ÿC hingga 70 ÿC. Dilanjutkan dengan pengujian aktivitas asparaginase pada kondisi reaksi standar [30,31].
Stabilitas suhu dipelajari dengan mencampurkan 1,5 mL enzim murni dan 4,5 mL buffer (pH 7) bersama-
sama dan diinkubasi pada suhu 37 ÿC. Dihapus setiap kali pada interval waktu yang berbeda (0 menit, 30
menit, 1 jam, 2 jam, 4 jam, 5 jam dan 24 jam) adalah 1 mL campuran, dan aktivitas enzim diperkirakan
menurut Mashburn dan Wriston [6] .

2.5.2. Pengaruh pH terhadap Aktivitas Asparaginase

Pengaruh pH terhadap aktivitas asparaginase dipelajari pada rentang pH 3 sampai 10 menggunakan
buffer yang berbeda; buffer asetat (pH 3, 4 dan 5), buffer fosfat (pH 6–6,5), dan buffer basa Tris (pH 7–10)
[11]. Pengujian dilakukan dengan pra-inkubasi 0,25 mL enzim murni dengan 0,75 mL masing-masing buffer
pada suhu 37 ÿC selama 30 menit. Aktivitas enzim diperkirakan menurut Mashburn dan Wriston [6].

2.5.3. Pengaruh Inhibitor, Aktivator Terhadap Aktivitas Asparaginase

Pengaruh inhibitor dan aktivator (2 mM) dianalisis menggunakan ethylenedi-aminetetraacetate
(EDTA), N-ethylemaleimide (NEM), phenylmethylsulphonylfluoride ( PMSF), Triton-X 100, Tween-80,
sodium dodesil sulfat (SDS), dan ÿ-mercaptoetanol (ÿ-ME) [32]. Pra-inkubasi dilakukan selama 30 menit
setelah mencampurkan 0,25 mL enzim dengan 0,75 mL inhibitor/aktivator terkait. Kegiatan tersebut
ditentukan seperti yang telah disebutkan sebelumnya.

2.5.4. Kinetika Enzim

Parameter kinetik (Km dan Vmax) dari asparaginase yang dimurnikan ditentukan dengan regresi
linier dari plot Lineweaver-Burk dan Michaelis-Menten dengan konsentrasi asparagin (substrat) yang
berbeda (0 mM – 20 mM) [11].

2.6. Menguji Aktivitas Antileukemik

Evaluasi Sitotoksisitas Menggunakan Uji Viabilitas
Perbanyakan garis sel
Sel WI-38 (sel normal fibroblas paru-paru manusia) diperbanyak dalam medium Dulbecco yang
dimodifikasi Eagle's medium (DMEM) yang ditambah dengan 10% serum janin sapi yang dilemahkan
dengan panas, 50 µg/ mL gentamisin, 1% L-glutamin dan buffer 4-(2-hidroksietil)-1-piperazinethanesulfonic
acid (HEPES). Semua sel dipertahankan pada suhu 37 ÿC dalam atmosfer lembab dengan 5% CO2 dan
disubkultur dua kali seminggu [33].
M-NFS-60 (sel karsinoma leukemia myelogenous tikus) diperbanyak dalam RPMI- 1640, ditambah
dengan 10% serum janin sapi yang dilemahkan dengan panas, 1% L-glutamin, buffer HEPES, dan 50 ÿg/
mL gentamisin. Semua sel dipertahankan pada suhu 37 ÿC dalam atmosfer lembab dengan 5% CO2 dan
disubkultur dua kali seminggu [34].
Machine Translated by Google

Int. J.Lingkungan. Res. Kesehatan Masyarakat 2022, 19, 680 5 dari 14

Evaluasi sitotoksisitas
Sitotoksisitas asparaginase yang telah dimurnikan diuji pada garis sel leukemia tikus: M- NFS-60
(sel karsinoma leukemia myelogenous tikus) untuk menentukan Median Minimal Inhibitory Concentration
(MIC50) dan garis sel mamalia: sel WI-38 (paru-paru manusia). sel normal fibroblast) untuk memverifikasi
Median Minimal Cytotoxic Concentration (MCC50), sesuai dengan metode yang dijelaskan oleh [35].
Sel diunggulkan dalam piring 96 sumur dengan konsentrasi sel 1 × 104 sel per sumur dalam 100 ÿL
media pertumbuhan. Media segar yang mengandung pengenceran dua kali lipat dari asparaginase
murni telah disiapkan. Setelah 24 jam penyemaian, media yang mengandung serial asparaginase
ditambahkan ke sel monolayer konfluen yang disalurkan ke dalam pelat mikro-titer beralas datar dengan
96 sumur (Falcon, NJ, USA) menggunakan pipet multisaluran. Tiga sumur digunakan untuk setiap
konsentrasi sampel uji (percobaan dilakukan dalam rangkap tiga), sel kontrol diinkubasi tanpa sampel
uji.
Pelat mikrotiter diinkubasi pada suhu 37 ÿC dalam inkubator yang dilembabkan dengan 5%
CO2 selama 24 jam. Setelah masa inkubasi berakhir, media disedot, dan larutan kristal violet
1% ditambahkan ke setiap sumur selama 30 menit. Noda telah dihilangkan, dan piring dibilas
menggunakan air keran sampai semua sisa noda hilang. Asam asetat glasial (30%) kemudian
ditambahkan ke semua sumur dan diaduk rata, kemudian serapan pelat diukur setelah
dikocok perlahan menggunakan microplate reader (Tecan Trading AG, Swiss.) pada panjang
gelombang 490 nm. Semua hasil dikoreksi untuk serapan latar belakang yang terdeteksi di
sumur tanpa penambahan noda. Sampel yang diberi perlakuan dibandingkan dengan kontrol
sel tanpa adanya asparaginase yang dimurnikan.
Efek sitotoksisitas sel dari asparaginase yang dimurnikan dihitung untuk menentukan
jumlah sel yang layak dan persentase viabilitas dihitung sebagai.

ODt
Persentase kelangsungan hidup = × 100
ODc

di mana ODt adalah kerapatan optik rata-rata dari tiga sumur yang diberi masing-masing konsentrasi
asparaginase, ODc adalah kerapatan optik rata-rata sel yang tidak diberi perlakuan.
Hubungan antara sel yang bertahan dan konsentrasi asparaginase yang digunakan diplot untuk
mendapatkan kurva kelangsungan hidup setiap lini sel tumor setelah pengobatan dengan asparaginase
yang dimurnikan. Konsentrasi sitotoksik (MCC50), konsentrasi yang diperlukan untuk menimbulkan efek
toksik pada 50% sel utuh, diperkirakan dari plot grafik kurva respons dosis untuk setiap konsentrasi,
menggunakan perangkat lunak prisma (San Diego, CA, USA).

2.7. Statistik

Data disajikan dalam bentuk tabel menggunakan Microsoft excel 365, gambar dibuat menggunakan
Prism ver. 8. Semua percobaan dilakukan dalam rangkap tiga, semua data dilaporkan dengan mean ± SEM.

3. Hasil
3.1. Optimalisasi Kondisi Media Di antara
sembilan percobaan berbeda yang dilakukan menurut model Taguchi, dua di antaranya; percobaan
9 dan 8 menunjukkan aktivitas asparaginase yang tinggi dengan aktivitas masing-masing 175 IU/mL,
135 IU/mL, percobaan lain menunjukkan aktivitas berkisar antara 75–10 IU/mL (Gambar 1). Namun,
pada penginduksian asparaginase aktivitas enzim diperkirakan 315 IU/mL.

3.2. Pemurnian Asparaginase

Pemurnian asparaginase dari L. theobromae dilakukan dengan kombinasi beberapa
tahapan, dimulai dengan pengendapan protein total menggunakan aseton dingin, kromatografi
penukar ion pada kolom Q-FF, dan filtrasi gel Sephadex G-100. Setelah pengendapan enzim
yang diinduksi dengan aseton dingin, asparaginase menunjukkan aktivitas spesifik sebesar
36,71 IU/mg dengan aktivitas total 250 IU/mL pada total protein 6,81 mg/mL (Tabel 1).
Enzim pekat dimasukkan ke dalam kolom penukar ion Q-FF yang telah diseimbangkan sebelumnya dan
Machine Translated by Google

Int. J.Lingkungan. Res. Kesehatan Masyarakat 2022, 19, 680 6 dari 14

dielusi menggunakan gradien konsentrasi NaCl (0–1 M). Semua pecahan hanya dielusi dengan
NaCl 0,3 M menunjukkan aktivitas asparaginase (Gambar 2). Semua fraksi yang menunjukkan aktivitas
asparaginase tinggi dikumpulkan bersama dan dipekatkan, aktivitas asparaginasenya adalah
diperkirakan 138,91 IU/mL dan aktivitas spesifik 105,88 U/mg. Untuk pemurnian lebih lanjut , fraksi
pekat dimasukkan ke dalam kolom Sephadex G-100 yang telah diseimbangkan sebelumnya.
Semua pecahan positif dikumpulkan dan dipekatkan. Fraksi yang dikumpulkan ditunjukkan
aktivitas total 84,4 IU/mL, aktivitas spesifik 468,03 U/mg dibandingkan dengan yang diinduksi
Int. J.Lingkungan. Res. Kesehatan Masyarakat 2022, 19, x 6 dari 15

aktivitas spesifik enzim (Tabel 1) (untuk lebih jelasnya silakan periksa bahan tambahan).

Gambar 1. Aktivitas Asparaginase pada eksperimen desain Taguchi.

Gambar 1. Aktivitas Asparaginase pada eksperimen desain Taguchi.

3.2. Pemurnian Asparaginase

Tabel 1. Ringkasan langkah-langkah yang terlibat dalam pemurnian asparaginase dari L. theobromae.
Pemurnian asparaginase dari L. theobromae dilakukan dengan kombinasi beberapa tahap, dimulai
dengan pengendapan protein total menggunakan aseton dingin, kromatografi penukar ion pada kolom Q-
Menghasilkan %
Melangkah Total Protein (mg) Aktivitas * (IU/mL) Aktivitas Spesifik (IUmgÿ1) Lipatan Pemurnian
FF, dan filtrasi gel Sephadex G-100. Setelah pra- presipitasi 9,21 315,00 34,20 1,00 enzim yang diinduksi
Enzim yang diinduksi dengan aseton dingin, asparaginase menunjukkan aktivitas spesifik 6,81 250,00 100,00
36,71 1,07 sebesar 36,71 IU/mg dengan aktivitas total 250 IU/mL dalam total protein 6,81 mg/mL (Tabel
Aseton 1 ).diseimbangkan
Enzim pekat dimasukkan kedan
sebelumnya dalam kolom
dielusi penukar ion konsentrasi
menggunakan Q-FF yang telah 79.37
gradien NaCl (0–1 M). Semua pecahan
Q-FF (NaCl 0,3M) 1.31hanya dielusi saja 138.91 105,88 3.10 44.10

Sephadex G-100 0,18 84.40 468.03 13.68 26.79

dengan NaCl 0,3 M menunjukkan aktivitas asparaginase (Gambar 2). Semua fraksi menunjukkan kadar- * Satu unit asparaginase (IU) didefinisikan
sebagai jumlah enzim yang membebaskan 1 µmol amonia minÿ1 PADA 37 ÿC.
aktivitas paraginase dikumpulkan dan dipekatkan, aktivitas asparaginase diperkirakan 138,91 IU/mL dan
aktivitas spesifik 105,88 U/mg. Untuk Estimasi Lebih Lanjut Berat Molekul Enzim
pemurnian, fraksi pekat dimasukkan ke dalam Sephadex G-100 yang telah diseimbangkan sebelumnya.
Asparaginase
kolom. yang positif
Semua pecahan dimurnikan menunjukkan
dikumpulkan pita sekitarTangga
dan dipekatkan. 70 kDaprotein
dibandingkan dengan
fraksi yang referensi
dikumpulkan
(Gambar 2). aktivitas total sebesar 84,4 IU/mL, aktivitas spesifik sebesar 468,03 U/mg dibandingkan
menunjukkan
dengan aktivitas spesifik enzim yang diinduksi (Tabel 1) (untuk lebih jelasnya silakan lihat tambahan 3.3.
Karakterisasi Enzim
bahan).
3.3.1. Pengaruh pH terhadap Aktivitas Asparaginase

Tabel Berdasarkan
1. Ringkasan hasil yang disajikan
langkah-langkah pada
yang Gambar
terlibat dalam 3a,pemurnian
pH optimum untuk dimurnikan
asparaginase dari L. theobromae.
asparaginase adalah 6, sedangkan pada pH 10 enzim kehilangan aktivitasnya, mulai dari pH 3 tersebut
Total
enzim mempertahankan aktivitasnya sebesar 51,22%, sedangkan pada pH 4, 5 mempertahankan aktivitasnyaPemurnian
masing-masing sebesar 72,22%, 77,43%.
Aktivitas * Aktivitas Tertentu
Melangkah
Protein
Dari aktivitasnya, aktivitas enzim(IU/mL) mulai menurun seiring denganMelipat meningkatnya Menghasilkan %
(IUmgÿ1)
nilai pH. (mg)
Enzim terinduksi 9,21 315,00 34,20 3.3.2. Pengaruh Suhu 1,00 100,00
terhadap Aktivitas Asparaginase
Asparaginase 6,81 250,00 36,71 1,07 Asparaginase yang dimurnikan 79.37
Q-FF menunjukkan
(NaCl 0,3M)aktivitas
1,31 3,10 pada rentang
(20–60 suhu
Suhuyang
ÿC).138.91 luas adalah
optimum 105,8837 ÿC dengan 44.10
aktivitas 84,41 IU/mL, diikuti
Sephadex G-100 0,18 84,40 13,68 kali 40 ÿC dengan 82,52468.03
IU/mL (Gambar 3b). 26.79
* Satu unit asparaginase (IU) didefinisikan sebagai jumlah enzim yang membebaskan 1 µmol amonia
minÿ1 PADA 37 °C.

Estimasi Berat Molekul Enzim

Asparaginase yang dimurnikan menunjukkan pita sekitar 70 kDa dibandingkan dengan referensi
 Machine Translated by Google

Int. J.Lingkungan. Res. Kesehatan Masyarakat 2022, 19, 680 7 dari 14

Asparaginase yang dimurnikan menunjukkan stabilitas lengkap pada suhu 37 ÿC selama 1, 2 dan 4 jam, sedangkan
aktivitas menurun menjadi 43,2 IU/mL setelah 5 jam. Enzim kehilangan aktivitasnya sepenuhnya setelah 24 jam
(Gambar 3c).

3.3.3. Pengaruh Inhibitor dan Aktivator terhadap Aktivitas Asparaginase

Pengaruh inhibitor dan aktivator yang berbeda dipelajari pada asparaginase yang
dimurnikan , di mana SDS menunjukkan penurunan aktivitas enzim hingga 0,65 IU/mL (relatif 10,35%).
aktivitas), sedangkan EDTA, NEM, dan PMSF tidak menunjukkan pengaruh terhadap aktivitas asparaginase, di
kontras ÿ-mercaptoetanol, Tween 80, dan Triton-x 100 meningkatkan spesifik enzim
aktivitas menjadi 130%, 143,48% dan 151,92% masing-masing mengenai kontrol (Gambar 3d).

3.3.4. Penentuan Kinetika Enzim

. Mengepung. Res. Kesehatan Masyarakat 2022, 19, x
Berdasarkan hasil pada Gambar 3e 1, 2, konstanta Michaelis Km dan kecepatan maksimum
Vmax asparaginase yang dimurnikan dari L. theobromae adalah 9,370 µM dan 127,00 IU minÿ1
masing-masing.

Gambar
Gambar 2. Asparaginase
2. Asparaginase yang
yang dimurnikan dari dimurnikan dariSDS-PAGE.
L. theobromae pada L. theobromae pada(b)
(a) tangga protein, SDS-PAGE.
dimurnikan (A)
asparaginase.
asparaginase.

3.3. Karakterisasi Enzim

3.3.1. Pengaruh pH terhadap Aktivitas Asparaginase
Berdasarkan hasil yang disajikan pada Gambar 3a, opti
Machine Translated by Google

Int. J.Lingkungan. Res. Kesehatan Masyarakat 2022, 19, 680 8 dari

Int. J.Lingkungan. Res. Kesehatan Masyarakat 2022, 19, x 14 8 dari 15

Gambar 3. (a) Pengaruh pH terhadap asparaginase yang dimurnikan dari L.theobromae. (b) Pengaruh suhu Gambar
3. (a) Pengaruh pH pada asparaginase yang dimurnikan dari L. theobromae. (b) Dampak dari
perature pada asparaginase yang dimurnikan dari L.theobromae. (c) Stabilitas termal suhu asparagin yang dimurnikan
pada asparaginase yang dimurnikan dari L. theobromae. (c) Stabilitas termal asase yang dimurnikan dari L.theobromae
pada 37 °C. (d) Pengaruh inhibitor dan aktivator pada asparaginase yang dimurnikan dari paraginase dari L. theobromae
pada suhu 37 ÿC.(e)(d)
L.theobromae. Pengaruh
Kinetika inhibitor dan
asparaginase aktivator
yang pada asparaginase
dimurnikan. murni
1. Plot Michaelis Menten untuk asparagi yang dimurnikan
dari L. theobromae.
enzim (e) Kinetika asparaginase
nase dari L.theobromae. 2. Perbedaanyang dimurnikan.
nilai aktivitas 1. Michaelis
asparaginase Menten
murni dariberkomplot untuk
L.the-obromae orang yang disucikan
dengan
enzim asparaginase
meningkatnya konsentrasi dari L. theobromae. 2. Perbedaan nilai aktivitas asparaginase murni
substrat.
dari L. theobromae dengan meningkatnya konsentrasi substrat.
3.4. Estimasi Aktivitas Antileukemia Asparaginase
3.4.
3.4.1. Estimasi
EvaluasiAktivitas Antileukemia
Sitotoksisitas terhadapAsparaginase
Garis Sel M-NFS-60
3.4.1. Konsentrasi
Evaluasi Sitotoksisitas
asparaginaseterhadap Garisberbeda
murni yang Sel M-NFS-60
mulai dari 84,00 IU/mL hingga 2,62 IU/
mL diuji terhadap sel karsinoma leukemia myelogenous
Konsentrasi asparaginase murni yang berbeda dimulai tikus untuk memperkirakan
dengan 84,00 IU/mLnilai
hingga
MIC50 , hasilnya menunjukkan bahwa MIC50 adalah 35,2 ± 0,7 IU/mL (Gambar
2,62 IU/mL diuji terhadap sel karsinoma leukemia myelogenous tikus untuk memperkirakan
Int. J.Lingkungan. Res. Kesehatan Masyarakat 2022, 19, x 4). 9 dari 15

nilai MIC50 , hasil menunjukkan bahwa MIC50 adalah 35,2 ± 0,7 IU/mL (Gambar 4).
3.4.2. Evaluasi Sitotoksisitas terhadap Garis Sel WI-38
Konsentrasi asparaginase murni yang berbeda mulai dari 84,00 IU/mL hingga 2,62 IU/
mL diuji terhadap sel WI-38 (sel normal fibroblas paru manusia) untuk memperkirakan nilai
MCC50, hasilnya menunjukkan bahwa MCC50 adalah 79,4 ± 1,9 IU / mL (Gambar 5).

Gambar4.4.Respon
Gambar Responviabilitas
viabilitasgaris
garissel
selM-NFS-60
M-NFS-60terhadap
terhadappengenceran
pengencerandua
duakali
kalilipat
lipatdari
dariaspar
asparmurni
murni.
aginase dari L.theobromae.
asparaginase dari L. theobromae.
Machine Translated by Google

Int. J.Lingkungan. Res. Kesehatan Masyarakat 2022, 19, 680 9 dari 14

3.4.2. Evaluasi Sitotoksisitas terhadap Garis Sel WI-38

Konsentrasi asparaginase murni yang berbeda dimulai dengan 84,00 IU/mL hingga
2,62 IU/mL diuji terhadap sel WI-38 (sel normal fibroblas paru manusia) untuk memperkirakan
Gambar 4. Respon viabilitas garis sel M-NFS-60 terhadap pengenceran dua kali lipat nilai aspar- MCC50
murni , hasil
aginase darimenunjukkan bahwa MCC50 adalah 79,4 ± 1,9 IU/mL (Gambar 5).
L.theobromae.

Gambar 5. Respon viabilitas cell line WI-38 terhadap pengenceran dua kali lipat dari asparaginase
murni
hidung dari L.theobromae.
dari L.theobromae.

4.4.Diskusi
Diskusi

Zhao dkk.[36]
Zhao dkk. [36]
dandan Jia dkk.
Jia dkk. [37] melaporkan
[37] melaporkan bahwa
bahwa aktivitas aktivitas
metabolit metabolit
bioaktif bioaktif
yang dihasilkan
oleh
yangendofit dianggap
dihasilkan serupa dianggap
oleh endofit atau lebihsama
tinggiatau
dibandingkan
lebih tinggiyang dihasilkan yang
dibandingkan oleh inang.
dihasilkan oleh
tanaman
tanaman.inang.
SchulzSchulz dkk.
dkk. [38] [38] melaporkan
melaporkan bahwa bahwa mekanisme
mekanisme pertahanan
pertahanan tanamantanaman
dan faktordan virulensi
virulensi jamur
jamur
mengembangkan mekanisme keseimbangan dengan mengeluarkan metabolit bioaktif baru
faktor mengembangkan mekanisme keseimbangan dengan mengeluarkan metabolit bioaktif baru yang berbeda. yang berbeda.
Lasiodiplodia
Lasiodiplodia theobromae dilaporkanmenghasilkan
theobromae dilaporkan menghasilkan beberapa
beberapa senyawa
senyawa bioaktif
bioaktif yangyang digunakan
digunakan
sebagai antikanker,
antikanker, antijamur,
antijamur, antioksidan,
antioksidan, antiinflamasi
antiinflamasi seperti: seperti: Lasiodiplodin
Lasiodiplodin [39],
[39], am- laseamy-
[40],sebagai
Paclitaxel [41],
Felix
ylase[42] melaporkan
[40], Paclitaxel strain
[41],L.Felix
theobromae dengan kemampuan
[42] melaporkan menghasilkan:
strain L. theobromae dengan kemampuan pro-
(3S,4S)-4-asetil-3-metil-2-dihidrofuranon,
(3S,4S)-4-asetil-3-metil-2-dihidrofuranon,(2R/2S,3S, 4S)-3-epibotryodiplodin, dan
(2R/2S,3S,4S)-3-epibotryodiplodin, asamjas- duce:
monat.
dan asam jasmonat.
Hasil
Hasilkami
kamimenunjukkan
menunjukkanbahwa
bahwaL.L.theobromae
theobromaememproduksi
menghasilkanasparaginase
asparaginasesecara
secaraekstraseluler
ekstraselulerdengan
dengana
aktivitas enzimatik yang tinggi, sedangkan Narayana et al. [43] melaporkan bahwa sebagian besar
aktivitas enzimatik yang tinggi, sedangkan Narayana et al. [43] melaporkan bahwa sebagian besar asparaginase
asparaginase dengan
dengan sumber sumber
mikroba mikroba
adalah adalah intraseluler.
intraseluler. AsparaginaseAsparaginase ekstraseluler
ekstraseluler berinteraksi
berinteraksi minimal minimal
dengan konstituen seluler dan lebih mudah diekstraksi; karenanya, induksi ekstraseluler
asparaginase dengan aktivitas tinggi akan lebih menguntungkan.
Untuk menghasilkan asparaginase dengan aktivitas maksimal, sembilan percobaan dirancang menggunakan
model Taguchi. Hasil model Taguchi menunjukkan variasi aktivitas asparaginase dari
175 hingga 10 IU/mL, variasi hasil yang diperoleh sesuai dengan Ali dkk. [34]
yang merancang model 19 percobaan untuk optimalisasi asparaginase dari A.
sydowii dan F. oxysporum dengan aktivitas asparaginase berkisar antara 37-146 IU/mL dan 33 hingga
143 IU/mL masing-masing. Ashok dkk. [41] menggunakan desain Taguchi untuk mensimulasikan sembilan percobaan
dengan aktivitas asparaginase berkisar antara 3,94 hingga 20,57 IU/mL dari Trichosporon asahii.
Eksperimen lain dirancang untuk induksi asparaginase dengan maksimal
kegiatan dengan menginkubasi matras kultur L. theobromae berumur lima hari dengan asparagine selama dua hari
hari dan aktivitas asparaginase diperkirakan 315 IU/mL. Inkubasi dari
menumbuhkan L. theobromae mat dengan asparagine semata-mata sebagai substrat untuk peningkatan asparaginase
pelepasan asparaginase secara selektif dengan aktivitas maksimal dengan ekstraseluler lainnya
enzim, Nossal dkk. [44] merancang eksperimen serupa untuk pelepasan selektif beberapa
Machine Translated by Google

Int. J.Lingkungan. Res. Kesehatan Masyarakat 2022, 19, 680 10 dari 14

enzim pendegradasi yaitu: alkali fosfatase, fosfodiesterase siklik, 5'-nukleotidase, asam fosfatase
dari E.coli melalui syok osmotik menggunakan konsentrasi garam yang berbeda.
Asparaginase dari L. theobromae dimurnikan dengan aktivitas total 84,40 IU/mL, aktivitas spesifik
468,03 IU/mg, dan pemurnian 13,68 kali lipat. Estimasi aktivitas tersebut tergolong rendah dibandingkan
dengan Thakur dkk. [11] yang melaporkan aktivitas 222,18 IU/mL dan aktivitas spesifik 69,43 IU/mg,
Mohamed et al. [45] melaporkan aktivitas 127 IU/mL dan aktivitas spesifik 846.IU/mg, dan lebih tinggi
dibandingkan aktivitas yang dilaporkan oleh Abbas [46] yang melaporkan aktivitas 13,1 IU/mL dan
aktivitas spesifik 0,4 IU/mg. aktivitas. Variasi aktivitas akan terkait dengan kondisi pertumbuhan masing-
masing organisme, variasi protokol ekstraksi.

Untuk memperkirakan berat molekul asparaginase yang dimurnikan menggunakan SDS-PAGE,

dibandingkan dengan penanda protein yang diketahui. SDS-PAGE menunjukkan pita asparaginase
sekitar 70 kDa. Hasil yang disajikan mirip dengan Huang [47] yang melaporkan berat badan 72 kDa dan
Hong [48] yang melaporkan asparaginase 71 kDa. Asparaginase menunjukkan variasi berat molekul
dimana, Cedar dan Schwartz [49] dan Shifrin et al. [50] melaporkan asparaginase dari E. coli dengan
141 kDa, Scheetz dkk. [51] melaporkan asparaginase dari Fusarium tricinctum dengan 161–170 kDa,
Manna dkk. [52] melaporkan asparaginase dari Pseudomonas stutzeri dengan 34 kDa dan El-Bessouny
[13] yang mencatat asparaginase dari Pseudomonas aeruginosa pada 160 kDa.

Asparaginase yang telah dimurnikan dikarakterisasi, menunjukkan kisaran pH kerja 3–9, dengan
pH optimum 6; Abbas [46] melaporkan pH kerja 3–12 dan pH optimal 10, sebaliknya, Thakur [11]
melaporkan kisaran pH kerja 3–10 dan pH optimal 7.

Pada pengujian rentang suhu kerja, asparaginase yang dimurnikan menunjukkan aktivitas
pada rentang suhu 20–60 ÿC dengan suhu optimum 37 ÿC yang sesuai dengan [11,45,53]. Di sisi
lain, Gaffar dan Shethna [54] melaporkan asparaginase yang diisolasi dari Azotobacter vinelandii
dengan suhu optimum 48 ÿC dan Mesas [55] melaporkan suhu optimum 40 ÿC untuk asparaginase
yang diisolasi dari Corynebacterium glutamicum.

Selama penelitian yang disajikan beberapa inhibitor dan aktivator dipelajari terhadap
asparaginase yang dimurnikan. SDS adalah satu-satunya reagen yang menunjukkan penurunan
aktivitas enzim dan mempertahankan 0,65% aktivitas relatif yang dilaporkan sebelumnya oleh Thakur [11].
Yang akan terkait dengan mode tindakan SDS. Dimana mengganggu struktur protein yang menjadikan
struktur protein terlipat menjadi model linier dan melapisi protein dengan muatan negatif yang seragam;
menyebabkan menutupi muatan protein.
EDTA tidak menunjukkan efek pada enzim yang dimurnikan yang menjelaskan fakta bahwa
asparaginase bukanlah suatu metaloenzim, yang serupa dengan data pada Candida utilits oleh Sakamoto [56].
Terlepas dari fakta sifat non-metaloenzim dari asparaginase yang dimurnikan, beberapa laporan
menyatakan bahwa asparaginase adalah enzim yang diaktifkan logam dimana, El-Naggar et al.
[8] melaporkan bahwa asparaginase dari Sterptomyces brollosae menunjukkan peningkatan
aktivitas dengan adanya ion Mg2+, Mn2+ dan Co2+ . Sonaimuthu [57] menunjukkan karakter
pengaktif logam dengan Mn2+ dengan asparaginase yang dimurnikan dari Fusarium culmorum.
Tween 80 dan Triton X-100 meningkatkan aktivitas dengan aktivitas relatif 170% dan 180%, ÿ-
mercaptoetanol meningkatkan aktivitas enzim dengan aktivitas relatif 130%, hasil kami sesuai dengan
Raha et al. [58]. Struktur protein asli terutama distabilkan oleh pembentukan ikatan disulfida [59], ÿ-
merkaptoetanol adalah zat pereduksi kuat yang menghambat pembentukan ikatan disulfida pada residu
sistein [60]. L-asparaginase diaktivasi dengan penambahan ÿ-mercaptoetanol. Hamza dan Engel [61]
melaporkan adanya gugus sulfhidril bebas dalam enzim, seperti residu sistein akan membuatnya tidak
stabil dan akan mengagregasi enzim dan penambahan ÿ-merkaptoetanol dan surfaktan ionik lainnya
yaitu; Tween 80 dan Triton X-100 akan meningkatkan aktivitas enzimatik.

NEM dan PMSF menunjukkan pengaruh yang tidak signifikan terhadap aktivitas enzim; yang
mungkin disebabkan oleh tidak adanya sistein atau serin pada situs aktif asparaginase yang dimurnikan,
hasil kami sesuai dengan Thakur [11].
Machine Translated by Google

Int. J.Lingkungan. Res. Kesehatan Masyarakat 2022, 19, 680 11 dari 14

Aktivitas asparaginase yang dimurnikan diuji terhadap konsentrasi asparagin yang berbeda
(0–20 mM) untuk menentukan sifat kinetik, enzim yang dimurnikan menunjukkan Km yang sangat
rendah yaitu 9,37 µM dan Vmax 127,00 U minÿ1 . Nilai Km yang tercatat dianggap lebih rendah
dibandingkan nilai Km Mucor hiemalis yang tercatat; 4 mM [11], Penicillium; 4 mM [62], nilai Km
yang rendah mencerminkan afinitas tinggi asparaginase yang dimurnikan terhadap asparagin
sebagai substrat.
Efek anti-leukemia dari asparaginase yang dimurnikan dipelajari terhadap sel karsinoma
leukemia myel-ogenous tikus untuk memperkirakan median konsentrasi penghambatan minimal
(MIC50). Hasil menunjukkan bahwa MIC50 adalah 35,2 ± 0,7 U/mL yang lebih rendah dari
MIC50 A. sydowii (50 U/mL) dan F. oxysporum (62,5 U/mL) [31]. Hal ini juga dianggap lebih
tinggi dari MIC50 Phaseolus vulgaris (0,75 U/mg) [45]. Semakin rendah nilai MIC maka semakin
rendah dosis yang dibutuhkan dan semakin baik kemanjuran obat antikanker tersebut [63].
Tanfous dkk. [64] mengaitkan aktivitas antileukemia asparaginase dengan kemampuannya
menghidrolisis asparagin dalam serum, sehingga menghabiskan asparagin serum; yang penting
untuk proliferasi sel leukemia. Beberapa percobaan dilakukan oleh para ilmuwan untuk
menemukan asparaginase dan menguji perannya dalam penghambatan sel leukemia [5,65-67].
Asparagine diproduksi oleh asparagine synthetase (ASNS), yang dikodekan oleh gen ASNS
[68]. Gervasini dan Vgace (69) berhipotesis bahwa gen ASNS pada sel limfoblas ganas memiliki
ekspresi yang rendah atau tidak dapat mengatur ekspresi ASNS ketika terkena asparaginase.
Dengan demikian, kita dapat berhipotesis bahwa sel-sel leukemia lebih bergantung pada sumber asparagin
ekstraseluler, sehingga pemberian asparaginase secara selektif akan menghabiskan serum asparagin yang
menyebabkan penekanan pertumbuhan sel-sel leukemia.
Hasil yang disajikan menunjukkan bahwa MIC50 (35,2 ± 0,7 IU/mL) dari asparaginase
yang dimurnikan adalah sekitar dua kali lipat MCC50 (79,4 ± 1,9 IU/mL) di mana nilai MCC50
mewakili setengah konsentrasi sitotoksik asparaginase yang diuji pada sel normal. Rasio
tersebut menunjukkan bahwa asparaginase yang diuji dianggap aman karena memerlukan dua
kali lipat konsentrasi asparaginase untuk mencapai MCC50. Dengan mengobati garis sel
leukemia dengan asparaginase yang dimurnikan, hasil kami menunjukkan bahwa garis sel
karsinoma mencapai kematian sel hingga 83,05% dengan konsentrasi enzim yang dimurnikan
tertinggi (84 IU/mL) yaitu sekitar dua kali lipat MIC50 ; masing-masing, sel leukemia memerlukan
asparagin konsentrasi tinggi agar tetap dapat hidup [64].

5. Kesimpulan

Kesimpulannya, hasil yang disajikan membuktikan bahwa mikobiota endofit terutama yang
diisolasi dari lingkungan ekstrem dianggap sebagai sumber senyawa bioaktif baru yang aman .
Studi ini menyoroti penerapan baru taksa asli endofit dan merekomendasikan produksi
asparaginase endofit yang diinduksi ekstraseluler dalam skala tinggi untuk digunakan sebagai
obat antileukemia yang aman dan dalam industri makanan. Penelitian di masa depan harus
fokus pada penyaringan senyawa bioaktif yang disekresikan oleh mikobiota endofit Mesir untuk
menemukan alternatif yang aman bagi senyawa farmasi tradisional atau menemukan senyawa
baru untuk digunakan dalam aplikasi industri, pertanian, dan medis.

Materi Pelengkap: Berikut ini tersedia online di https://www.mdpi.com/article/10 .3390/ijerph19020680/s1, Gambar S1. Kurva standar konsentrasi
BSA yang berbeda, Gambar S2.
Profil elusi asparaginase dari L. theobromae dari kolom penukar ion Q-FF. Kolom telah
diseimbangkan sebelumnya dengan buffer Tris 50 mM (pH 7) dan fraksi dielusi dengan larutan
gradien NaCl (0-1M) yang disiapkan dalam buffer yang sama, dan Gambar S3. Profil elusi
asparaginase dari L. theobromae dari kolom filtrasi gel (Sephadex G-100). Fraksi dielusi dengan
buffer Tris 50 mM (pH 7). Tabel S1. Kesembilan model tersebut dihasilkan oleh desain Taguchi.
Machine Translated by Google

Int. J.Lingkungan. Res. Kesehatan Masyarakat 2022, 19, 680 12 dari 14

Kontribusi Penulis: Konseptualisasi, HAM, BAB dan AMA-A.; metodologi, HAM, DHS dan BAB; perangkat lunak, BAB, YAH,
AMA, DHS dan AAA; validasi, HAM, BAB, YAH, AMA, AAA, DHS dan AMA-A.; analisis formal, HAM, BAB, YAH, AMA, DHS dan
AMA-A.; investigasi, HAM, BAB, DHS dan AMA-A.; sumber daya, AAA; penulisan— penyusunan draf asli, HAM, BAB dan AMA-
A.; menulis—review dan editing, HAM, BAB, YAH, AMA, DHS, AAA dan AMA-A.; akuisisi pendanaan, AAA Semua penulis telah
membaca dan menyetujui versi naskah yang diterbitkan.

Pendanaan: Penelitian ini tidak menerima pendanaan eksternal.

Pernyataan Dewan Peninjau Kelembagaan: Tidak Berlaku.

Pernyataan Persetujuan yang Diinformasikan: Tidak Berlaku.

Pernyataan Ketersediaan Data: Tidak Berlaku

Ucapan Terima Kasih: Kami menghargai dan berterima kasih kepada Universitas Taif atas dukungan finansial untuk Proyek
Pendukung Peneliti Universitas Taif (TURSP-2020/22), Universitas Taif, Taif, Arab Saudi.
Kami ingin menyampaikan penghargaan yang sebesar-besarnya kepada Abdel Ghaffar Abu El Saoud, Departemen Botani dan
Mikrobiologi, Fakultas Sains, Universitas Suez Canal atas dukungan dan bantuannya selama analisis data hasil. Juga, kepada
anggota Protektorat Saint Katherine atas dukungan mereka selama pengumpulan sampel pada tahap awal kemajuan pekerjaan
penelitian.

Konflik Kepentingan: Penulis tidak mempunyai konflik kepentingan untuk dinyatakan. Semua rekan penulis telah melihat dan

setuju dengan isi naskah.

Referensi
1.Rodriguez , RJ; Putih, JF, Jr.; Arnold, AE; Redman, RS Endofit jamur: Keanekaragaman dan peran fungsional. Fitol Baru. 2009,
182, 314–330. [Referensi Silang] [PubMed]

2. Gouda, S.; Kerry, RG; Das, G.; Paramitiotis, S.; Shin, H.-S.; Patra, JK Revitalisasi pertumbuhan tanaman mendorong rhizobakteri
untuk pembangunan berkelanjutan di bidang pertanian. Mikrobiol. Res. 2018, 206, 131–140. [Referensi Silang]
3. Abdel-Azeem, AM; Zaki, SM; Khalil, WF; Makhlouf, NA; Farghaly, LM Aktivitas Anti-Rheumatoid Metabolit Sekunder
Diproduksi oleh Chaetomium globosum Endofit. Depan. Mikrobiol. 2016, 7, 1477. [Referensi Silang] [PubMed]
4. Kumar, D.; Sobha, K. L-Asparaginase dari Mikroba: Tinjauan Komprehensif. Adv. Biore. 2012, 3, 137–157.
5. Clementi, A. Deamidasi Enzimatik Asparagin pada Berbagai Spesies Hewan dan Signifikansi Fisiologis
Logika Kehadirannya di Tubuh. Lengkungan. Int. Fisiol. 1922, 19, 369–398. [Referensi Silang]
6. Mashburn, LT; Wriston, JC Efek penghambatan tumor l-asparaginase dari Escherichia coli. Lengkungan. Biokimia. Biofisika. 1964, 105,
450–453. [Referensi Silang]
7. Pieters, R.; Kelaparan, SP; Boos, J.; Rizzari, C.; Silverman, L.; Baruchel, A.; Goekbuget, N.; Schrappe, M.; Pui, C.-H. Pengobatan L-asparaginase pada leukemia
limfoblastik akut: Fokus pada Erwinia Asparaginase. Kanker 2011, 117, 238–249. [Referensi Silang] [PubMed]
8. El-Naggar, NE-A.; El-Ewasy, SM; El-Shweihy, NM Mikroba L-Asparaginase sebagai Agen Terapi Potensial untuk Pengobatan Leukemia Limfoblastik Akut: Pro dan Kontra.
Int. J. Farmakol. 2014, 10, 182–199. [Referensi Silang]
9. Zhang, J.; Penggemar, J.; Venneti, S.; Salib, JR; Takagi, T.; Bhinder, B.; Djaballah, H.; Kanai, M.; Cheng, EH; Judkins, AR; dkk.
Asparagine Memainkan Peran Penting dalam Mengatur Adaptasi Seluler terhadap Penipisan Glutamin. mol. Sel 2014, 56, 205–218. [Referensi Silang]
10. Fung, MKL; Chan, GC-F. Perampasan asam amino yang diinduksi obat sebagai strategi terapi kanker. J.Hematol. Onkol. 2017, 10, 1–18.
[Referensi Silang]

11. Lebih lanjut, SS; Thakur, LLM Isolasi, Pemurnian dan Karakterisasi Jamur Ekstraseluler L-Asparaginase dari Mucor hiemalis.
J. Biokatal. Biotransformasi. 2013, 2. [Referensi Silang]
12. Verma, N.; Kumar, K.; Kaur, G.; Anand, S.L-Asparaginase: Agen Kemoterapi yang Menjanjikan. Kritik. Pdt. Bioteknologi. 2007, 27,
45–62. [Referensi Silang]

13. El-Bessoumy, AA; Sarhan, M.; Mansour, J. Produksi, isolasi, dan pemurnian L-asparaginase dari Pseudomonas aeruginosa
50071 menggunakan fermentasi solid-state. J. Biokimia. mol. biologi. 2004, 37, 387–393. [Referensi Silang]
14. Kafkewitz, D.; Goodman, D. L-Asparaginase Produksi oleh Rumen Anaerobe Vibrio succinogenes. Aplikasi. Mikrobiol. 1974, 27,
206–209. [Referensi Silang] [PubMed]
15. Hatamzadeh, S.; Rahnama, K.; Nasrollahnejad, S.; Fotouhifar, KB; Hemmati, K.; Putih, JF; Taliei, F. Isolasi dan identifikasi jamur endofit penghasil L-asparaginase dari
spesies tanaman keluarga Asteraceae Iran. RekanJ 2020, 8, e8309. [Referensi Silang]
[PubMed]
16. Egler, RA; Ahuja, SP; Matloub, Y. L-asparaginase dalam pengobatan pasien dengan leukemia limfoblastik akut. J. Farmakol.
Apoteker. 2016, 7, 62–71. [Referensi Silang]
17. Souza, PM; de Freitas, MM; Cardoso, SL; Pessoa, A.; Perang, ENS; Magalhães, PO Optimasi dan pemurnian L-asparaginase dari jamur: Tinjauan sistematis. Kritik. Pdt.
Onkol. 2017, 120, 194–202. [Referensi Silang]
Machine Translated by Google

Int. J.Lingkungan. Res. Kesehatan Masyarakat 2022, 19, 680 13 dari 14

18. Mishra, A. Produksi L-asparaginase, agen antikanker, dari Aspergillus niger menggunakan limbah pertanian dalam bentuk padat
fermentasi. Aplikasi. Biokimia. Bioteknologi. 2006, 135, 33–42. [Referensi Silang]
19. Archana, J.; Raja, P. Produksi, Pemurnian dan Karakterisasi L-Asparaginase dari Aspergillus nidulans dengan Fermentasi Solid State. euro. J. Bioteknologi. biosci.
2014, 2, 51–58.
20. Saied, EM; El-Maradny, YA; Osman, AA; Darwish, AMG; Abo Nahas, HH; Niedbaÿa, G.; Piekutowska, M.; Abdel-Rahman, MA; Balbool, BA; Abdel-Azeem, AM Tinjauan
Komprehensif tentang Struktur Molekuler Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2): Wawasan Produk Alami untuk Melawan COVID-19.
Farmasi 2021, 13, 1759. [CrossRef]

21. Nagarajan, A.; Thirunavukkarasu, N.; Suryanarayanan, TS; Gummadi, NS Skrining dan Isolasi L-Asparaginase Bebas Glutaminase Baru dari Jamur Endofit. Res. J.
Mikrobiol. 2014, 9, 163–176.
22. Salini, G.; Madhusoodhanan, A.; Yusuf, A.; Mohan, A.; Navya, RK; Nair, VV Penghasil L-Asparaginase Bebas Glutaminase
Endofit dari Mangrove. Asia J. Farmasi. Klinik. Res. 2016, 9, 360–362.
23. Gaber, A.; Alsanie, WF; Kumar, DN; Refat, MS; Saied, EM Novel Kompleks Logam Papaverine yang Berpotensi Aktivitas Antikanker. Molekul 2020, 25, 5447. [CrossRef]
[PubMed]
24. Balbool, BA; Abdel-Azeem, AM Keanekaragaman Jamur Endofit yang Dapat Dibudidayakan Penghasil L-Asparaginase di Arid Sinai, Mesir.
Italia. J.Mikol. 2020, 49, 8–24. [Referensi Silang]
25. Gaber, A.; Refat, MS; Belal, AAM; El-Deen, IM; Hassan, N.; Zakaria, R.; Alhomrani, M.; Alamri, AS; Alsanie, WF; M. Saied, E. Kompleks Tiosemikarbazon Mononuklear
dan Binuklir Baru Cu(II), Co(II), Ni(II), dan Zn(II) dengan Potensi Aktivitas Biologis: Studi Docking Antimikroba dan Molekuler. Molekul 2021, 26, 2288. [CrossRef]
[PubMed]
26. Ali, D.; Aduh, S.; Eweis, M.; Solieman, D. Optimalisasi produksi L-Asparaginase dari beberapa jamur berfilamen yang potensial
sifat farmasi. Mesir. J.Bot. 2018, 58, 355–369. [Referensi Silang]
27. Pergelangan Tangan, JC Asparaginase. Dalam Metode Enzimologi—Metabolisme Asam Amino dan Amina Bagian A; Pers Akademik: Cambridge,
MA, AS, 1970; Jilid 17, hal. 732–742.
28. Wessel, D.; Flügge, U. Sebuah metode untuk pemulihan kuantitatif protein dalam larutan encer dengan adanya deterjen dan lipid.
Dubur. Biokimia. 1984, 138, 141–143. [Referensi Silang]
29. Laemmli, Inggris Pembelahan Protein Struktural selama Majelis Kepala Bakteriofag T4. Alam 1970, 227, 680–685.
[Referensi Silang]

30. Sharar, M.; Kata, EM; Rodriguez, MC; Arenz, C.; Montes-Bayón, M.; Linscheid, MW Pelabelan Unsur dan Spektrometri Massa untuk Deteksi Spesifik Gugus Asam
Sulfenat dalam Model Peptida: Sebuah Bukti Konsep. Dubur. Bioanal. kimia. 2017, 409, 2015–2027. [Referensi Silang] [PubMed]

31. Yadav, N.; Sarkar, S. Produksi L-Asparaginase oleh Fusarium Oxysporum Menggunakan Fermentasi Terendam. Int. J.Pharm. Sains.
Menciptakan. 2014, 3, 32–40.
32. Kotari, MN; Baig, MMV Produksi dan karakterisasi poligalakturonase ekstraseluler oleh Erwinia carotovora MTCC
1428. Int. J.Adv. Bioteknologi. Res. 2013, 4, 981–998.
33. Pu, X.; Yu, S.; Penggemar, W.; Liu, L.; Bu, X.; Ren, J. Guiqi polisakarida melindungi sel fibroblast paru-paru janin manusia normal WI-38
dari penuaan dini yang disebabkan oleh H2O2. Int. J.Klin. Contoh. jalan. 2015, 8, 4398–4407.
34. Shafek, R.; Michael, H.; Dikatakan, A.; Ibrahim, A.; Al-Sayed, A. Studi fitokimia, aktivitas antioksidan dan sitotoksik ekstrak daun Brassica rapa L. dan nanopartikel
peraknya. Mesir. J.kimia. 2018, 61, 237–247. [Referensi Silang]
35. Mosmann, T. Uji kolorimetri cepat untuk pertumbuhan dan kelangsungan hidup sel: Penerapan pada uji proliferasi dan sitotoksisitas. J.
imunol. Metode 1983, 65, 55–63. [Referensi Silang]
36. Zhao, J.; Shan, T.; Mou, Y.; Zhou, L. Senyawa Bioaktif Berasal Tumbuhan yang Dihasilkan oleh Jamur Endofit. Mini-Rev. medis. kimia.
2011, 11, 159–168. [Referensi Silang] [PubMed]
37. Jia, M.; Chen, L.; Xin, H.-L.; Zheng, C.-J.; Rahman, K.; Han, T.; Qin, L.-P. Hubungan Ramah Antara Jamur Endofit dan Tanaman Obat: Tinjauan Sistematis. Depan.
Mikrobiol. 2016, 7, 906. [Referensi Silang]
38. Schulz, B.; Boyle, C. Kontinum endofit. mikol. Res. 2005, 109, 661–686. [Referensi Silang]
39. Matsuura, H.; Nakamori, K.; Omer, E.; Hatakeyama, C.; Yoshihara, T.; Ichihara, A. Tiga lasiodiplodin dari lasiodiplodia
theobromae IFO 31059. Fitokimia 1998, 49, 579–584. [Referensi Silang]
40. Navaratnam, P.; Arasaratnam, V.; Mahendran, S.; Balasubramaniam, K. Formulasi medium dan daur ulang biomassa untuk
produksi glukoamilase oleh Botryodiplodia theobromae. Proses. Biokimia. 1996, 31, 77–80. [Referensi Silang]
41. Ashok, A.; Doriya, K.; Rao, JV; Qureshi, A.; Tiwari, AK; Kumar, DS Mikroba Penghasil L-Asparaginase bebas Glutaminase dan Urease yang diisolasi dari Lokasi Ekstrim
Tanah dan Lumut Antartika. Sains. Rep.2019 , 9, 1423. [CrossRef] [PubMed]
42. Félix, C.; Salvatore, MM; DellaGreca, M.; Ferreira, V.; Duarte, AS; Salvatore, F.; Naviglio, D.; Gallo, M.; Alves, A.; Esteve, AC; dkk. Metabolit sekunder yang dihasilkan
oleh strain Lasiodiplodia theobromae yang ditumbuhkan pada dua suhu berbeda.
Mikologia 2019, 111, 466–476. [Referensi Silang] [PubMed]
43. Narayana, KJP; Kumar, KG; Vijayalakshmi, M. Produksi L-asparaginase oleh Streptomyces albidoflavus. J. Mikrobiol India. 2008,
48, 331–336. [Referensi Silang]
44. Nosal, NG; Heppel, LA Pelepasan Enzim melalui Syok Osmotik dari Escherichia coli dalam Fase Eksponensial. J.Biol. kimia.
1996, 241, 3055–3062. [Referensi Silang]
Machine Translated by Google

Int. J.Lingkungan. Res. Kesehatan Masyarakat 2022, 19, 680 14 dari 14

45. Muhammad, SA; Elshal, MF; Kumosani, TA; Aldahlawi, A. Pemurnian dan Karakterisasi Asparaginase dari Biji Phaseolus vulgaris. Pelengkap Berbasis Bukti. Alternatif.
medis. 2015, 2015, 309214. [Referensi Silang] [PubMed]
46. Ahmed, MMA; Dahad, FNA; Taha, MT; Hassan, SMF Produksi, Pemurnian dan Karakterisasi L-Asparaginase dari Marine Endophytic Aspergillus sp. ALAA-2000 dalam
Fermentasi Terendam dan Padat. J.Mikrob. Biokimia. Teknologi.
2015, 7, 165–172. [Referensi Silang]
47. Huang, L.; Liu, Y.; Matahari, Y.; Yan, Q.; Jiang, Z. Karakterisasi Biokimia Novel L-Asparaginase dengan Aktivitas Glutaminase Rendah dari Rhizomucor miehei dan
Penerapannya dalam Keamanan Pangan dan Pengobatan Leukemia. Aplikasi. Mengepung. Mikrobiol. 2013, 80, 1561–1569. [Referensi Silang]

48. Hong, S.-J.; Lee, Y.-H.; Khan, AR; Ullah, aku.; Lee, C.; Taman, CK; Shin, J.-H. Kloning, ekspresi, dan karakterisasi L-asparaginase termofilik dari Thermococcus
kodakarensis KOD1. J. Mikrobiol Dasar. 2014, 54, 500–508. [Referensi Silang]
49. Cedar, H.; Schwartz, JH Lokalisasi Dua L-Asparaginase pada Escherichia coli yang Ditumbuhkan Secara Anaerob. J.Biol. kimia. 1967, 242, 3753–3755. [Referensi Silang]

50. Shifrin, S.; Parrott, CL; Luborsky, SW Pengikatan Substrat dan Interaksi Intersubunit di L-Asparaginase. J.Biol. kimia. 1974, 249, 1335–1340. [Referensi Silang]

51. Scheetz, RW; Whelan, HA; Wriston, JC Pemurnian dan sifat L-asparaginase dari Fusarium tricinctum. Lengkungan.
Biokimia. Biofisika. 1971, 142, 184–189. [Referensi Silang]
52. Manna, S.; Sinha, A.; Sadhukhan, R.; Chakrabarty, SL Pemurnian, karakterisasi dan aktivitas antitumor L-asparaginase
diisolasi dari Pseudomonas stutzeri MB-405. Saat ini. Mikrobiol. 1995, 30, 291–298. [Referensi Silang]
53. Sanjotha, G.; Manawadi, SI Isolasi, Screening, Optimasi dan Produksi Anti Tumor L-Asparaginase oleh Jamur dari Wilayah Pesisir Karwar. Res. J. Ilmu Pengetahuan
Terbaru. 2017, 6, 1–7.
54. Gaffar, SA; Shethna, Pemurnian YI dan Beberapa Sifat Biologis Asparaginase dari Azotobacter vinelandii. Aplikasi. Mengepung.
Mikrobiol. 1977, 33, 508–514. [Referensi Silang]
55. Mesas, JM; Gil, JA; Martin, JF Karakterisasi dan Pemurnian Parsial L-Asparaginase dari Corynebacterium Glutamicum. J.
Jenderal Mikrobiol. 1990, 136, 515–519. [Referensi Silang]
56. Sakamoto, T.; Araki, C.; Beppu, T.; Arima, K. Pemurnian parsial dan beberapa sifat asparaginase ekstraseluler dari Candida utilis. Pertanian. biologi. kimia. 1977, 41,
1359–1364. [Referensi Silang]
57. Sonaimuthu, V.; Krishnamoorthy, S.; Johnpaul, M. Taxol penghasil jamur endofit Fusarium culmorum SVJM072
tanaman obat Tinospora cordifolia—Laporan pertama. J. Bioteknologi. 2010, 150, 425. [Referensi Silang]
58. Raha, SK; Roy, SK; Dey, SK; Chakrabarty, SL Pemurnian dan sifat L-asparaginase dari Cylindrocarpon obtusisporum MB-10. Biokimia. Int. 1990, 21, 987–1000.

59. Qin, M.; Wang, W.; Thirumalai, D. Pelipatan protein memandu pembentukan ikatan disulfida. Proses. Natal. Akademik. Sains. Amerika Serikat 2015, 112;
11241–11246. [Referensi Silang]
60. Zhang, S.; Xie, Y.; Zhang, C.; Baik, X.; Zhao, H.; Lu, F.; Lu, Z. Karakterisasi biokimia novel L-asparaginase dari Bacillus megaterium H-1 dan penerapannya pada kentang
goreng. Res Makanan. Int. 2015, 77, 527–533. [Referensi Silang]
61. Hamzah, MA; Engel, PC Meningkatkan stabilitas termal jangka panjang dalam dehidrogenase glutamat mesofilik dari Clostridium
simbiosum dengan menghilangkan residu sistein. Enzim. Mikroba. Teknologi. 2007, 41, 706–710. [Referensi Silang]
62. Patro, KR Ekstraksi, pemurnian dan karakterisasi L-asparaginase dari Penicillium sp. dengan fermentasi terendam. Int. J.
Bioteknologi. mol. biologi. Res. 2012, 3, 30–34. [Referensi Silang]
63. Lewis, A.; Du Plessis, LH; Wentzel, JF Sifat Sitotoksik, Antimikroba, dan Antikanker dari Peptida Antimikroba Nisin Z Sendiri dan dalam Kombinasi dengan Perawatan
Konvensional. Dalam Sitotoksisitas; IntechOpen: London, Inggris, 2018.
64. Ben Tanfous, M.; Sharif-Askari, B.; Ceppi, F.; Laaribi, H.; Gagné, V.; Rousseau, J.; Labuda, M.; Silverman, LB; Sallan, SE; Neuberg, D.; dkk. Polimorfisme Jalur
Asparaginase dan Komplikasi Terkait Asparaginase pada Anak dengan Leukemia Limfoblastik Akut. Klinik. Res Kanker. 2015, 21, 329–334. [Referensi Silang]
[PubMed]
65. Broome, JD Bukti Bahwa L-Asparaginase dari Serum Babi Guinea Bertanggung Jawab atas Efek Antilimfomanya: I. Sifat L-Asparaginase dari Serum Babi Guinea dalam
Kaitannya dengan Zat Antilimfoma. J.Eks. medis. 1963, 118, 99–120.
[Referensi Silang] [PubMed]
66. Kidd, JG Regresi Limfoma Transplantasi yang Diinduksi di Vivo Melalui Serum Guinea Pig Normal. II. Studi tentang Sifat Konstituen Serum Aktif: Mekanisme Regresi
Histologis: Uji Efek Serum Guinea Pig pada Sel Limfoma in Vitro. J.Eks. medis. 1953, 98, 583–606. [Referensi Silang]

67. Neuman, RE; McCoy, TA Persyaratan Ganda Walker Carcinosarcoma 256 in vitro untuk Asparagine dan Glutamine. Sains
1956, 124, 124–125. [Referensi Silang] [PubMed]
68. Mei, L.; Ontiveros, EP; Griffiths, EA; Thompson, JE; Wang, ES; Wetzler, M. Farmakogenetika prediksi respon dan
toksisitas dalam terapi leukemia limfoblastik akut. Pendeta Darah 2015, 29, 243–249. [Referensi Silang]
69. Gervasini, G.; Vagace, JM Dampak polimorfisme genetik terhadap toksisitas kemoterapi pada leukemia limfoblastik akut masa kanak-kanak. Depan. Genet. 2012, 3, 249.
[Referensi Silang] [PubMed]