UJI ENDOTOKSIN

Marlia Singgih Wibowo

School of Pharmacy ITB
Pendahuluan

„ Produk alat kesehatan

„ Kontaminasi bakteri
„ Bakteri gram negatif
„ Kualitas produk farmasi dari aspek
mikrobiologi
Pendahuluan
Produk farmasi parenteral

Produk-produk farmasi parenteral harus steril karena pemberian

langsung ke sistem sirkulasi pembuluh darah.
Salah satu tahap : Sterilisasi
Produk parenteral terkadang terkontaminasi oleh ENDOTOKSIN
Bagaimana produk parenteral
dapat terkontaminasi endotoksin?

„ Pada proses sterilisasi produk parenteral

(menggunakan panas), bakteri gram negatif
yang mungkin ada dalam produk, akan mati
dan lisis terjadi, endotoksin akan terlepas
dan tetap tinggal di dalam produk
„ Sifatnya stabil terhadap panas (heat-stable)
Endotoksin dan Pirogen
„ Endotoksin adalah toksin yang dihasilkan oleh
bakteri gram negatif
„ Pirogen adalah senyawa yang menyebabkan
kenaikan suhu tubuh akibat penggunaan produk
farmasi yang diberikan secara intravena
„ Semua endotoksin bersifat pirogen, tetapi tidak
semua senyawa pirogen itu merupakan endotoksin
„ Endotoksin bakteri terdiri dari Lipopolisakarida
(LPS), umumnya terikat pada protein dan fosfolipid.
LPS ini menyusun membran luar bakteri gram
negatif.
Struktur LPS

„ Contoh : LPS dari Salmonella terdiri

dari bagian Lipid A yang hidrofob yang
terikat pada suatu daerah inti yang
mengandung molekul KDO (2-keto-3-
deoksioktonat)
Struktur LPS Salmonella

Mannose-Abequose
Rantai samping
Rhamnose
Galactose n
Glucose-N-acetylglucosamine
Galactose
Glucose-Galactose
Inti polisakarida
Heptulose
Heptulose-P-P-Ethanolamine
KDO

KDO-KDO-P-Ethanolamine
P-GlcN-GlcN-P
Lipid A
Efek endotoksin bagi tubuh

• demam
• aktivasi sistem sitokin
• rusaknya sel-sel endotelial
• permeabilitas pembuluh darah
berubah sehingga menyebabkan
turunnya tekanan darah
• dll.
Perkembangan regulasi
tentang uji pirogen
„ Bacterial endotoxin test (BET) merupakan
salah satu uji yang penting terhadap produk
parenteral dan alat kesehatan
„ 1912 : uji pirogen dilakukan dengan metode
kelinci (Rabbit test)
„ Digunakan dalam USP XII pada tahun 1942
sampai 40 tahun kemudian
„ 1980 : metode baru diterapkan yaitu
Limulus amoebocyte lysate (LAL) test
LAL-test

„ The Limulus amebocyte lysate (LAL)

test adalah uji in vitro untuk deteksi
dan analisis kuantitatif endotoksin
bakteri.
„ Metode analisis LAL yang dilakukan
mencakup teknik gel-clot dan
turbidimetri kinetik dan kromogenik
(kolorimetri)
Mengapa LAL test?

„ Limulus amebocyte lysate (LAL) test

adalah metode alternatif terhadap
rabbit pyrogen test yang difokuskan
pada deteksi senyawa pirogen dalam
produk, untuk menghindari
penggunaan hewan/binatang dalam
percobaan
„ Metode lebih akurat
Limulus amebocyte lysate
„ Lisat diperoleh dari amubosit kepiting landam kuda
(Limulus polyphemus)

„ Penggunaan LAL untuk deteksi endotoksin berawal

dari pengamatan Bang (1956) bahwa infeksi bakteri
gram negatif pada Limulus polyphemus
menyebabkan koagulasi intravaskular yang parah.

„ Th 1964, Levin and Bang kemudian menunjukkan

bahwa penggumpalan itu merupakan hasil reaksi
antara endotoksin dan protein yang dapat
menggumpal dalam amubosit.
„ Solum (1970, 1973) dan Young (1972),
melakukan pemurnian dan karaterisasi
protein yang dapat bergumpal dari reaksi
LAL dan menunjukkan bahwa reaksi
dengan endotoksin merupakan reaksi
enzimatik.
Limulus polyphemus
(horseshoe crab)
Horseshoe crab

African Wolf Spider

Cara memperoleh lysate
„ Untuk memperoleh LAL, horseshoe crabs yang
berukuran besar ditangkap, cek kesehatannya, lalu
darahnya diambil dengan menggunakan jarum
suntik. Darah kepiting ini lalu disentrifuga untuk
memisahkan amoebocytes dari plasma cairnya.
„ Amoebocyte lalu di freeze-dried dan diproses untuk
digunakan. Harganya : One quart of LAL is worth
$15,000!
„ Tiga perusahaan USA :
{ Associates of Cape Cod: http://www.acciusa.com
{ Cambrex: http://www.cambrex.com/default.asp
{ Charles River Endosafe:
http://www.criver.com/products/endotoxin/index.html
Metode LAL yang direkomendasi
oleh FDA – USA

„ Metode Gel-Clot : prinsip bahwa LAL

menggumpal dengan adanya endotoksin
„ Metode kinetik turbidimetri : menggunakan
kecepatan pembentukan gel untuk
menentukan kandungan endotoksin
„ Metode Kromogenik : menggunakan
substrat kromogenik sintetik, dengan
adanya LAL dan endotoksin, menghasilkan
warna kuning dan secara linier ekuivalen
dengan konsentrasi endotoksin yang ada
„ LAL Chromogenic endotoxin assay utilizes a
modified Limulus Amoebocyte Lysate and a
synthetic color-producing substrate to detect
endotoxin presence.
„ This assay is quantitative and the color intensity
developed upon addition of the sample to the LAL
supplied with the kit is proportional to the amount of
endotoxin present in the sample and can be
calculated from a standard curve.
„ The kinetic chromogenic quantitative assay for
bacterial endotoxin can be performed at the low
assay range (0-5 EU/ml) or the higher range (5-50
EU/ml)
Metode kromogenik ada 2 :
„ End point chromogenic
„ Kinetic chromogenic

„ Pemilihan metode tergantung pada

penggunaan, volume uji, dan tipe
produk
Prinsip LAL test
• Uji LAL memanfaatkan dasar respon imun dari
kepiting landam kuda terhadap invasi bakteri gram
negatif.
• Bahan-bahan yang terkandung dalam amubosit
kepiting landam kuda terdiri dari berbagai protein,
faktor, kofaktor dan ion-ion yang berinteraksi
menyebabkan koagulasi
• Endotoksin Gram negatif mengkatalisis aktivasi
proenzim dalam lisat amubosit Limulus. Kecepatan
awal aktivasi ditentukan oleh konsentrasi
endotoksin
„ Selanjutnya enzim yang diaktivasi (enzim
koagulase) menghidrolisis ikatan spesifik dalam
suatu protein penggumpal (koagulogen) yang juga
terdapat pada lisat amubosit Limulus menghasilkan
koagulin.
„ Sekali terhidrolisis, koagulin yang dihasilkan
bergabung dengan sendirinya dan membentuk
suatu gumpalan/bekuan seperti gel
 Skema reaksi enzimatik pada
penggumpalan LAL
Jalur alternatif

ANTI FAKTOR G

ENDOTOKSIN
FAKTOR G FAKTOR G YG DIAKTIVASI

FAKTOR C FAKTOR C YG
DIAKTIVASI

FAKTOR B YG
FAKTOR B
DIAKTIVASI

PROCLOTTING ENZYME CLOTTING ENZYME

KOAGULOGEN
KOAGULIN (GEL)
Penetapan batas endotoksin

„ 1983 : FDA menentukan batas

endotoksin berdasarkan dosis
maksimum sediaan obat untuk
manusia atau kelinci
„ dan penyesuaian batas endotoksin
untuk semua obat (kecuali intratekal)
dari 2,5 EU kg-1 sampai 5,0 EU kg-1
„ EU = Endotoxin Unit
„ Batas deteksi untuk beberapa produk
diperoleh dari monografi USP atau EP.
Kalau tidak dinyatakan dalam
farmakope, batas endotoksin harus
dihitung dari dosis maksimum manusia
CALCULATION and MEASUREMENT
Beberapa istilah lain untuk
batas deteksi endotoksin

„ EL: Endotoksin Limit

„ MAEC (maximum allowable endotoxin
concentration)
„ ERL (endotoxin release limit)
„ ELC (endotoxin limit concentration)
 EL = K/M

„ K = konstanta = 5 EU atau IU per kg berat

badan, M = dosis maksimum untuk manusia
per kg per jam.
„ Umumnya dinyatakan sbb :
Batas endotoksin untuk berat badan rata2
70 kg = 350 EU per jam (5 EU kg-1)
Batas endotoksin vs volume
sediaan per jam
„ Harus diperhatikan bahwa batas endotoksin
dinyatakan per jam. Oleh karena itu konsentrasi
yang dibolehkan untuk endotoksin per mililiter
injeksi beragam tergantung pada volume
pemberian dalam satu jam.

„ Suatu dosis tunggal injeksi 1 ml secara teoritis

mengandung 349 EU per ml dan masih diijinkan
pada uji endotoksin bakteri, sedangkan infus
dengan volume 1 L harus mengandung kurang dari
0,349 EU per ml
Perhitungan MVD dan MVC
„ MVD = Maximum Valid Dilution (pengenceran
maksimum)
„ MVC = Minimum Valid Concentration (konsentrasi
minimum)
„ MVD dan MVC adalah perhitungan yang
menunjukkan seberapa banyak pengenceran yang
harus dilakukan untuk mengatasi kemungkinan
interferensi, sebelum efek pengenceran melampaui
kemampuan uji LAL yang digunakan untuk
mendeteksi endotoksin dalam sediaan asli
Kapan digunakan istilah MVD?

„ MVD biasanya digunakan untuk

sediaan yang berbentuk cairan dimana
pemberian dinyatakan dalam per
mililiter, contoh: dosis tunggal injeksi 2
ml dan batas endotoksin dinyatakan
dalam EU ml-1
Kapan digunakan istilah MVC?

„ MVC biasanya digunakan untuk

sediaan dengan batas endotoksin
dinyatakan dengan EU mg-1 dan dosis
dinyatakan dengan mg/ kg bb.
„ Penentuan MVD dan MVC tergantung
pada sensitivitas lisat yang digunakan
(λ).
„ Semakin sensitif lisat atau metoda,
semakin tinggi MVD atau semakin
rendah MVC
Perhitungan MVC

MVC = λ M
K
„ λ = sensitifitas dari lisat yaitu nilai
terkecil dari standar untuk pengujian
kuantitatif
„ K= konstanta = 0,5 EU kg-1
„ M= dosis maksimum manusia
Perhitungan MVD

MVD = C x K
λxM

„ C = konsentrasi obat
„ K = konstanta = 0,5 EU kg-1
„ M= dosis maksimum manusia
Contoh

„ Potensi injeksi insulin 100 unit per ml, dosis

maksimum 2 unit per kg dan sensitivitas lisat 0,125
unit/ml, maka

„ MVD = 100x 5 = 1: 2000

0,125 x 2

„ Nilai MVD dapat diperoleh dari MVC

„ MVD = potensi sediaan/MVC

LAL test untuk alat kesehatan
„ Kadar endotoksin pada alat kesehatan diperoleh
dengan prosedur ekstraksi, yaitu dengan cara
merendam sejumlah alat pada cairan pengekstraksi
biasanya pereaksi air LAL. Nilai batas 20 EU per
alat dinyatakan dalam addendum USP 1997, jadi
batas maksimum konsentrasi endotoksin yang
diijinkan dalam cairan hasil ekstraksi (ERL) dihitung
dengan rumus:

„ ERL = K x N/V

„ K = 20 EU, N = jumlah alat dan V = total volume

larutan ekstraksi
Metode Gel-Clot

„ Pada metode ini, hasil akhir dapat

dideteksi berupa spot pada slide, atau
microplate
„ Perlu pembanding, berupa Control
Standard Endotoxin (CSE)
„ Peralatan gelas yang digunakan harus
di “de-pirogenasi”
Prinsip uji dan prosedur
„ 100 ul CSE dimasukkan ke dalam tabung
gelas depirogen (positive control)
„ LAL reagent water (negative control)
„ Sampel jumlah sama
„ + 100 ul lysate
„ Inkubasi 37°C di atas penangas air selama
1 jam
„ Tabung lalu dibalik perlahan (180° ) untuk
melihat solid clot yang terjadi
Hal yang harus diperhatikan
dalam metode gel-clot

„ Untuk membuat alat-alat depirogen :

pemanasan pada 180°C, selama 4 jam atau
250°C selama 30 menit
„ Teknik pengerjaan pada saat membalik
tabung kira-kira selama 2 detik
„ pH sampel 7,0 – 8,0. Jika diperlukan pH
diatur menggunakan asam atau basa
depirogen
Sensitivitas Lisat pada Gel-Clot

„ Diperlukan untuk menentukan konsentrasi

minimum endotoksin yang menyebabkan
terjadinya gel
„ Satuan dinyatakan dalam EU atau IU
„ Dibuat 1 seri pengenceran endotoksin
(dalam EU/mL) dan percobaan dilakukan
rangkap 4 (quadruplicate)
„ Titik akhir pengenceran (end-point dilution)
ditentukan pada pengenceran terakhir yang
masih memberikan reaksi positif
Metode kromogenik

„ Metode kromogenik merupakan metode

LAL test yang paling banyak digunakan saat
ini karena lebih mudah dan murah
„ Sesuai untuk jumlah produk yang diuji tidak
banyak dan tidak sering (infrequent)
„ Digunakan untuk uji sampel serum pada uji
klinis
Prinsip uji dan prosedur
„ Endotoksin akan mengkatalisis aktivasi
suatu proenzim
„ Enzim yang teraktivasi akan mengkatalisis
terpecahnya PNA dari substrat Ac-Ile-Glu-
Ala-Arg-PNA
„ PNA yang dilepaskan diukur secara
spektrofotometri pada 405 nm
„ Nilai absorbans sebanding dengan jumlah
endotoksin , dibandingkan terhadap
endotoksin standard menggunakan kurva
standard
New Discoveries

„ Alternatif thp LAL saat ini telah berhasil diteliti di

India dan China, yaitu pereaksiTAL, or Tachypleus
amoebocyte lysate, fungsinya mirip dengan LAL,
juga untuk deteksi gram-negative bacteria.
„ Scientists di Singapore tengah meneliti cloning
gene pendeteksi toxin dalam darah horseshoe crab.
Jika gen tsb dapat di klon derivat LAL dapat dibuat
tanpa harus menggunakan horseshoe crabs untuk
ekstraksi darahnya.