MAKALAH

METODE PEMERIKSAAN HbA1c

Makalah Ini Disusun Untuk Memenuhi Tugas Mata Kuliah Kimia Klinik 1
Dosen Pengampu: dr. Yekti Hediningsih, M.Si.Med, Sp.PK

Disusun oleh :
Bihlul Ihdana (G1C022126)

KELAS A
PROGRAM STUDI DIV ANALIS KESEHATAN
FAKULTAS ILMU KEPERAWATAN DAN KESEHATAN
UNIVERSITAS MUHHAMDIYAH SEMARANG
2024
 KATA PENGANTAR

Puji syukur kami panjatkan kehadirat Allah SWT, karena dengan rahmat dan
karuniannya kita dapat menyelesaikan tugas makalah ini, sholawat serta salam senantiasa kita
tercurahkan pada junjungan kita nabi agung Muhammad SAW. Tujuan dari penulisan makalah
ini tidak lain untuk memenuhi tugas mata kuliah Kimia Klinik 1, kami berharap dengan
dibuatnya makalah ini dapat menambah pengetahuan serta wawasan kita.
Pada kesempatan ini, kita juga ingin menyampaikan ucapan terima kasih kepada ibu dr.
Yekti Hediningsih, M.Si.Med, Sp.PK selaku dosen pengampu mata kuliah kimia klinik. Kita
menyadari bahwa dalam penulisan makalah ini masih banyak kekurangan,maka dari itu kita
mengharapkan adanya kritik serta saran yang dapat membangun dalam pembuatan makalah
selanjutnya agar dapat lebih baik, dan kita berharap makalah ini bisa bermanfaat untuk kita
semua.

Semarang, 4 Januari 2024

Bihlul Ihdana

ii
 DAFTAR ISI

COVER ............................................................................................................................... i

PRAKATA .......................................................................................................................... ii

DAFTAR ISI ....................................................................................................................... iii

BAB I PENDAHULUAN ................................................................................................... 1

A. Latar Belakang ......................................................................................................... 1

B. Rumusan Masalah .................................................................................................... 2
C. Tujuan Masalah ........................................................................................................ 2

BAB II PEMBAHASAN .................................................................................................... 3

A. Metode Elektroforesis Gel........................................................................................ 3

B. Metode Uji Imunoassay............................................................................................ 4
C. Metode Kromatografi Afnitas ................................................................................. 5
D. Metode Kromatografi Pertukaran Kation ................................................................. 7

BAB III PENUTUP ............................................................................................................ 9

A. Kesimpulan............................................................................................................... 9
B. Saran ......................................................................................................................... 9

DAFTAR PUSTAKA ......................................................................................................... 10

iii
 BAB I
PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Salah satu pemeriksaan laboratorium yang digunakan untuk mengetahui komplikasi

lebih dini dan mengontrol kepatuhan berobat penderita DM adalah pemeriksaan kadar
HbA1c. HbA1c yang lebih dikenal dengan hemoglobin glikat adalah salah satu fraksi
hemoglobin yang terbentuk dari reaksi non-enzimatik antara glukosa dengan N terminal
Valin rantai b hemoglobin A dengan ikatan Almidin. Produk yang dihasilkan ini diubah
melalui proses Amadori menjadi ketoamin yang stabil dan irreversibel (Widijanti dan
Ratulangi, 2011). HbA1c yang terbentuk dalam tubuh akan disimpan dalam sel darah
merah dan akan terurai secara bertahap bersama dengan berakhirnya masa hidup sel darah
merah (rata-rata umur sel darah merah adalah 120 hari). Jumlah HbA1c yang terbentuk
sesuai dengan konsentrasi glukosa darah (Prodia, 2008). Kadar HbA1c yang terukur
sekarang mencerminkan kadar glukosa pada waktu 3 bulan yang lalu sehingga hal ini dapat
memberikan informasi seberapa tinggi kadar glukosa pada waktu tersebut. Dengan
melakukan pemeriksaan ini kita juga dapat mengetahui seberapa besar kepatuhan dalam
berobat pada penderita DM.

Sebagai contoh seorang penderita telah didiagnosis DM kira-kira 3 tahun dan telah
diberikan pengobatan yang sesuai, namun seberapa patuh atau teraturnya pasien tersebut
minum obat tidak dapat diketahui dengan pasti. Setiap datang kontrol ke dokter selalu
membawa hasil pemeriksaan laboratorium untuk glukosa darah dalam keadaan normal atau
sedikit lebih tinggi, hal ini bisa terjadi jika pasien minum obat-obatan 3 hari sebelum
kontrol ke dokter dengan dosis yang teratur, akan tetapi setelah diukur kadar HbA1c
ternyata menunjukkan hasil yang tinggi. Hal ini menunjukkan kepatuhan berobat atau
minum obat masih rendah (Lembar, 2006). Secara umum manfaat dari pemeriksaan HbA1c
sehingga perlu dilakukan oleh penderita DM antara lain sebagai monitoring kontrol glukosa
jangka panjang, penyesuaian terapi, menilai kualitas perawatan diabetes, memprediksi
kerusakan jaringan yang disebabkan oleh tingginya kadar glukosa darah dan melihat
kepatuhan pengobatan penderita DM (Harefa, 2011).

1
B. Rumusan Masalah

1. Bagaimana Metode Elektroforesis gel dalam pemeriiksaan HbA1c?

2. Bagaimana Metode Uji Imunoassay dalam pemeriksaan HbA1c?
3. Bagaiman Metode Kromatografi Afinitas dalam pemeriksaan HbA1c?
4. Bagaimana Metode Kromatografi Pertukaran Kation dalam pemeriksaan HbA1c?

C. Tujuan Masalah

1. Untuk mengetahui Metode Elektroforesis gel dalam pemeriiksaan HbA1c.

2. Untuk mengetahui Metode Uji Imunoassay dalam pemeriksaan HbA1c.
3. Untuk mengetahui Metode Kromatografi Afinitas dalam pemeriksaan HbA1c.
4. Untuk mengetahui Metode Kromatografi Pertukaran Kation dalam pemeriksaan
HbA1c.

2
 BAB II
PEMBAHASAN

A. Metode Elektroforesis Gel (Agar Gel Elektroforesis)

Metode ini memiliki hasil yang berkorelasi dengan baik dengan HPLC tetapi
presisinya kurang dibandingkan HPLC. HbF memberikan hasil positif palsu tetapi
kekuatan ion, pH, suhu, HbS dan HbC tidak banyak berpengaruh pada metode ini
(Widijanti dan Ratulangi, 2011). CE memisahkan molekul Hb berdasarkan muatan dan
volume hidrodinamik.61 Molekul bermuatan sangat terselesaikan dengan mobilitas
elektroforesisnya. Pemisahan tergantung pada pH elektrolit dan aliran elektro-osmotik.
Seperti beberapa bentuk model kromatografi canggih lainnya, berbagai produk Hb,
serta produk sampingan Hb lainnya atau varian Hb, dapat diidentifikasi menggunakan
CE. Penelitian telah menunjukkan bahwa tidak ada varian Hb heterozigot yang paling
umum (HbS, HbC, HbD, dan HbE) yang secara analitis mengganggu kuantifikasi
HbA1c menggunakan CE.62

Elektroforesis kapiler (CE) untuk pengukuran hemoglobin (Hb)A1c. CE

memisahkan spesies Hb berdasarkan mobilitas elektroforesisnya, yang ditentukan oleh
muatan dan ukuran hidrodinamiknya (yaitu massa). Satu daya tegangan tinggi
digunakan untuk menghasilkan medan listrik yang memfasilitasi migrasi molekul
melalui tabung kapiler dari anoda ke katoda. Spesies Hb bermuatan positif pada lisat
sel darah merah pasien akan dideteksi terlebih dahulu, dengan urutan rasio muatan
terhadap massanya menurun. Misalnya, dua molekul dengan muatan positif yang sama
akan dipisahkan lebih lanjut berdasarkan ukurannya, dengan molekul yang lebih besar
bergerak paling cepat. Ini diikuti oleh spesies netral dan terakhir oleh spesies Hb yang
bermuatan negatif. Elektroforetogram yang representatif (tidak digambarkan dalam
skala) menunjukkan pemisahan HbA1c dari HbA0.

3
B. Metode Uji Imunoassay (EIA)

Prinsip dari metode ini adalah ikatan yang terjadi antara antibodi dengan
glukosa dan antara asam amino-4 dengan 10 N-terminal rantai β. Kelemahan dari
metode ini adalah dipengaruhi oleh gangguan hemoglobinopati dengan asam amino
lengkap pada sisi yang berikatan dan beberapa gangguan yang berasal dari HbF
(Harefa, 2011) sehingga metode ini hanya mampu mengukur HbA1c dan tidak dapat
mengukur HbA1c yang labil maupun HbA1A dan HbA1B (Widijanti dan Ratulangi,
2011). Keuntungan dari metode ini adalah tidak dipengaruhi oleh HbE dan HbD
maupun carbamylated Hb, relatif lebih mudah diimplementasikan pada berbagai format
yang berbeda dan memiliki presisi yang baik (Harefa, 2011).
Immunoassay saat ini merupakan jenis metode HbA1c yang paling umum
digunakan di laboratorium klinis menurut laboratorium yang terdaftar dalam program
pengujian kemahiran College of American Pathology (CAP) untuk HbA1c .² Metode
immunoassay ini menggunakan antibodi yang mengenali asam amino terglikasi
terminal-N. Immunoassay HbA1c generasi pertama menggunakan antibodi yang
mengenali asam amino 4 hingga 10 pada rantai β HbA, sehingga menghasilkan
interferensi analitik dengan adanya HbS serta 26 varian Hb lain yang teridentifikasi saat
ini dan mungkin mencakup epitop ini. ²⁷-⁵⁹ Interferensi analitik dari dua varian Hb yang
paling umum di seluruh dunia (HbS dan HbC) mendorong pengembangan
immunoassay generasi kedua dan ketiga di mana epitop antibodi yang digunakan
mencakup beberapa asam amino pertama yang mendekati N- terminal rantai β HbA.
Antibodi generasi berikutnya ini diyakini mengikat HbS serupa dengan HbA,
memberikan nilai HbA 1c yang akurat secara analitis pada pasien dengan sifat HbS dan
kondisi varian Hb heterozigot lainnya di mana umur sel darah merah mungkin normal.
Namun, terdapat varian Hb yang dapat menyebabkan gangguan analitik ketika
menggunakan antibodi generasi berikutnya, meskipun dalam sebagian besar kasus
prevalensinya sangat rendah, dan potensi dampak pada metode HbA1c yang berbeda
belum dievaluasi. Meskipun peningkatan spesifisitas analitik telah menghilangkan
gangguan pemeriksaan dari HbS dan HbC, konsekuensi yang tidak diinginkan dari
pemeriksaan yang sangat spesifik ini adalah kemampuan laboratorium untuk
melaporkan nilai HbA1c yang menyesatkan secara klinis untuk pasien tanpa HbA
(yaitu, HbSS, HbCC, HbSC, atau HbS β-thalassemia). ⁷

4
 Peringatan mengenai spesifisitas analitik ini juga diamati untuk metode HbA1c
enzimatik dan menimbulkan kekhawatiran terbesar ketika pengguna akhir tidak dapat
membedakan keberadaan varian Hb homozigot yang mengubah masa hidup sel darah
merah, yang dapat menyebabkan pelaporan nilai HbA1c yang tidak sesuai. secara klinis
menyesatkan. ⁷

Immunoassay penghambatan turbidimetri untuk pengukuran hemoglobin (Hb) A1c. A,

Dengan tidak adanya HbA1c, polihapten (molekul sintetik yang mengandung banyak
epitop HbA1c) bereaksi dengan antibodi anti-HbA1c bebas yang terikat pada
mikropartikel untuk membentuk kompleks antibodi-polihapten yang tidak larut. Hal ini
menghasilkan hamburan cahaya yang signifikan. B, HbA1c pada pasien RBC lisat
bereaksi dengan antibodi anti-HbA1c, membentuk kompleks antigen-antibodi yang
larut dan dengan demikian mengurangi hamburan cahaya. Laju reaksi diukur secara
turbidimetri dan berbanding terbalik dengan jumlah HbA1c dalam sampel.

C. Metode Kromatografi Afinitas (Affinity Chromatography)

Prinsip dari metode ini adalah glukosa yang terikat pada asam m-
aminofenilboronat. Kelemahan dari metode ini adalah bukan hanya mengukur glikasi
valin pada N-terminal rantai β tetapi juha glikasi rantai β pada bagian lain dan glikasi
rantai α sehingga hasil pengukuran dengan metode ini lebih tinggi daripada dengan
metode HPLC (Harefa, 2011). Keuntungan metode ini adalah non-glycated hemoglobin
serta bentuk labil dari HbA1c tidak mengganggu penetuan hemoglobin glikasi, tidak
dipengaruhi suhu, presisi baik, HbF, HbS dan HbC hanya sedikit mempengaruhi
metode ini (Widijanti dan Ratulangi, 2011). hidrogen peroksida (H²O²). Pembentukan
H²O² dapat diukur dengan menggunakan uji kolorimetri. Sinyal yang dihasilkan
sebanding dengan jumlah HbA1c dalam sampel.
Kromatografi Afinitas Boronat Afinitas boronat adalah metode struktural
spesifik yang mengenali gugus cis -diol glukosa yang terikat pada Hb.26 Hal ini

5
cenderung menunjukkan gangguan analitis yang paling sedikit dari adanya varian Hb
heterozigot.60 Pemisahan afinitas Hb terglikasi biasanya menggunakan asam m -
aminofenilboronat dan bergantung pada interaksi spesifik antara glukosa pada Hb
terglikasi dan asam boronat yang diimobilisasi. Produk Hb nonglikat dan Hb terglikasi
dielusi secara terpisah dari kolom melalui interaksi Hb terglikasi dan asam boronat yang
diimobilisasi pada gel agarosa serta oleh gaya ionik dan hidrofobik. Metode ini
memberikan pemisahan kromatografi visual dari produk Hb terglikasi dan nonglikasi.
Meskipun metode afinitas boronat mengukur total Hb terglikasi, hasilnya dilaporkan
sebagai setara HbA1c yang terkoreksi. Namun, seperti halnya uji immunoassay dan uji
HbA1c enzimatik, pengguna akhir tidak dapat membedakan dugaan adanya varian Hb
ketika menggunakan afinitas boronat, yang dapat mempengaruhi interpretasi klinis nilai
HbA1c dalam kasus di mana masa hidup sel darah merah diubah.7

Kromatografi afinitas boronat untuk pengukuran hemoglobin (Hb) A1c. A,

Lisat RBC Pasien disuntikkan ke kolom analitik yang mengandung resin dengan asam
m -aminofenilboronat terikat. Pada pH di atas 8,0, gugus cis -diol dari Hb terglikasi
bereaksi dengan asam m -aminofenilboronat (B) dan selanjutnya terikat pada kolom

6
 sementara spesies Hb nonglikasi lainnya mengalir melalui (C). Buffer asam digunakan
untuk melepaskan molekul Hb terglikasi yang terikat dari kolom (D). Panel E adalah
kromatografi sederhana (garis biru) yang menunjukkan pemisahan spesies Hb
nonglikat dan terglikasi. Jejak kromatogram untuk Hb nonglikasi tidak digambarkan
pada skala. Metode afinitas boronat mengukur total Hb terglikasi tetapi melaporkan
hasilnya sebagai setara HbA1c yang dikoreksi.

D. Metode Kromatografi Pertukaran Kation (Ion Exchange Chromatography)

Prinsip dari metode ini adalah titik isoelektrik HbA1c lebih rendah dan lebih
cepat bermigrasi dibandingkan komponen Hb lainnya. Apabila menggunakan metode
ini harus dikontrol perubahan suhu reagen dan kolom, kekuatan ion dan pH dari buffer
(Widijanti dan Ratulangi, 2011). Kelemahan dari metode ini adalah adanya interferensi
variabel dari hemoglobinopati, HbF dan carbamylated Hb (HbC) yang bisa
memberikan hasil negatif palsu. Keuntungan metode ini adalah dapat memeriksa
kromatogram Hb varian dengan tingkat presisi yang tinggi (Harefa, 2011).
Metode HPLC (High Performance Liquid Chromatography)
Metode ini memiliki prinsip yang sama dengan Ion Exchange Chromatography, bisa
diotomatisasi serta memiliki akurasi dan presisi yang baik sekali. Metode ini juga
direkomendasikan menjadi metode referensi untuk pemeriksaan kadar HbA1c
(Widijanti dan Ratulangi, 2011). Uji HPLC pertukaran ion saat ini merupakan jenis
metode HbA1c kedua yang paling umum digunakan di laboratorium klinis menurut
statistik dari program pengujian profisiensi CAP.2 HPLC penukar ion memisahkan
spesies Hb berdasarkan perbedaan muatan. Model HPLC yang sangat canggih dapat
digunakan untuk menyelesaikan berbagai produk Hb, seperti HbA1a, HbA1b, HbF,
HbA1c labil, HbA1c, HbA0, dan HbA2 serta produk sampingan Hb atau varian Hb
lainnya. Meskipun mengidentifikasi keberadaan beberapa produk Hb ini merupakan
keuntungan, penting untuk dicatat bahwa metode HPLC pertukaran ion yang berbeda
untuk pengukuran HbA1c, bahkan dari vendor yang sama, memiliki daya penyelesaian
kromatografi yang berbeda. Keuntungan pengukuran HbA1c menggunakan metode
pertukaran ion yang tidak menggunakan kromatografi resolusi tinggi (dengan runtime
yang lebih lama) adalah waktu yang diperlukan untuk analisis sampel lebih singkat.
Tantangan yang dihadapi dalam penurunan resolusi kromatografi adalah peningkatan
risiko interferensi dari basa Schiff, Hb karbamilasi, atau varian Hb, yang dapat

7
berkolusi dengan puncak yang diinginkan dan menyebabkan hasil HbA1c yang salah.
Terdapat keuntungan karena dapat memvisualisasikan gangguan analitik yang
ada pada sampel pasien (misalnya, dimana turunan Hb ini tidak dapat dipisahkan dari
HbA atau HbA1c) sehingga hasil HbA1c yang tidak akurat tidak akan dilaporkan.
Namun, beberapa uji HPLC penukar ion secara analitis tidak akurat karena adanya
gangguan dari varian Hb yang umum.

Kromatografi cair kinerja tinggi penukar ion (HPLC) untuk pengukuran hemoglobin
(Hb) A1c. Pertukaran ion memisahkan molekul Hb berdasarkan muatannya. A, Lisat
RBC Pasien disuntikkan ke dalam kolom bermuatan negatif. B, C, Molekul Hb yang
bermuatan positif bergerak lebih lambat dibandingkan molekul bermuatan negatif
karena interaksi ionik dengan resin bermuatan negatif. D, HbA1c terelusi terlebih
dahulu karena muatannya lebih negatif dibandingkan HbA0. Jejak kromatogram untuk
HbA tidak digambarkan pada skala (E). Spesies Hb lain dan beberapa varian Hb
terkadang dapat diatasi dan diidentifikasi melalui HPLC penukar ion. Ini akan muncul
sebagai puncak tambahan pada kromatografi.

8
 BAB III
PENUTUP
A. Kesimpulan
Pemeriksaan HbA1c perlu dilakukan untuk mengetahui rata-rata kadar glukosa
darah dalam waktu satu sampai tiga bulan sebelumnya. Pasien dapat menilai
pengendalian diabetesnya dengan tujuan mencegah komplikasi diabetes. Selain itu,
pemeriksaan HbA1c digunakan untuk menilai efektivitas perubahan terapi setelah dua
sampai tiga bulan (Mediskus, 2015).
Kadar HbA1c penting untuk diperiksa karena dapat memberikan gambaran
pengendalian diabetes yang lebih baik dibandingkan gula darah. HbA1c dapat
mengidentifikasi rata-rata konsentrasi glukosa plasma dalam periode tiga bulan.
Seseorang dengan pengendalian diabetes yang buruk maka akan terjadi peningkatan
kadar HbA1c. Pencegahan terjadinya komplikasi kronis memerlukan pengendalian DM
yang baik. Sasaran pengendalian DM dengan kriteria baik, diantaranya gula darah
puasa 80 sampai 100 mg/dL, 2 jam post prandial 80 sampai 144 mg/dL, Alc kurang
dari 6,5%, kolesterol total kurang dari 200 mg/dL, trigliserida kurang dari 150 mg/dL,
Indeks Massa Tubuh 18,5 sampai 22,9 kg/m² dan tekanan darah kurang dari 130/80
mmHg (Miharja, 2009).
Pemahaman terhadap keuntungan dan tantangan berbagai metode yang
digunakan untuk pengujian HbA 1c sangat penting ketika menetapkan penatalaksanaan
dan tujuan terapeutik berdasarkan hasil HbA 1c terutama pada populasi dengan
prevalensi varian Hb yang tinggi.

B. Saran
Penulis menyadari bahwa dalam penulisan makalah ini masih jauh dari kata
sempurna. Oleh karena itu, kritik dan saran dari pembaca sangat kami harapkan bagi
penulis untuk dijadikan evaluasi dalam penyusunan makalah dikemudian hari, semoga
makalah yang kami tulis, dapat memberi manfaat bagi para pembaca.

9
 DAFTAR PUSTAKA

Bry L Chen PC Sacks DB. Effects of hemoglobin variants and chemically modified
derivatives on assays for glycohemoglobin. Clin Chem. 2001;47:153–163.
Djoumessi S Rousseaux J Dautrevaux M. Structural studies of a new hemoglobin: HbJ lens,
beta 13(A10) Ala leads to Asp. FEBS Lett. 1981;136:145–147.
Doelman CJ Siebelder CW Nijhof WA et al. Capillary electrophoresis system for hemoglobin
A1c determinations evaluated. Clin Chem. 1997;43:644–648
Harefa, Emmy. 2011. HbA1c Standardization and Recent Updates. Makassar: Prodia
Laboratories.
Little RR Roberts WL. A review of variant hemoglobins interfering with hemoglobin A1c
measurement. J Diabetes Sci Technol. 2009;3:446–451.
Molinaro RJ. Targeting HbA1c: standardization and clinical laboratory measurement. MLO
Med Lab Obs. 2008;40:10–19.
NGSP. HbA1c and estimated average glucose (eAG). Available at:
www.ngsp.org/A1ceAG.asp. Accessed November 11, 2013.
Rhea JM Koch D Ritchie J et al. Unintended reporting of misleading Hb A1c values when
using assays incapable of detecting hemoglobin variants. Arch Pathol Lab Med.
2013;137:1788–1791.
Widijanti, Anik dan Ratulangi, B.T. 2011. Jenis pemeriksaan yang harus dilakukan penderita
diabetes. Malang: Laboratorium Patologi Klinik RSUD Dr. Saiful Anwar/FK Unibraw

10