Diterjemahkan dari bahasa Inggris ke bahasa Indonesia - www.onlinedoctranslator.

com

Jurnal Fisika: Seri Konferensi

KERTAS •AKSES TERBUKA Anda mungkin juga menyukainya

- Corrigendum: Deteksi nosemosis pada Lebah

Pewarnaan Endospora Bakteri pada Schaeffer Fulton madu Eropa (Apis mellifera) pada peternakan
lebah madu di Kanchanaburi, Thailand (IOP Conf.

menggunakan Variasi Larutan Methylene Blue Ser. 2019: Mater Sci bahasa Inggris 639 012048 )

Samrit Maksong, Tanawat Yemor dan

Surasuk Yanmanee
Mengutip artikel ini: Seorang Oktaridkk2017J.Fis.: Conf. Ser.812012066
- Pengaruh distribusi ukuran spora, campuran gas,
dan waktu proses terhadap laju penghilangan
B.subtilisspora dalam plasma bertekanan rendah

Marcel Fiebrandt, Julian Roggendorf, Ralf

Lihatartikel daring untuk pembaruan dan penyempurnaan.
Moeller dkk.

- Efek tekanan dan suhu baru pada spora

bakteri
A Mathys, V Heinz dan D Knorr

Konten ini diunduh dari alamat IP 112.215.154.173 pada 20/04/2024 pukul 07:04
 MSCEIS Penerbitan IOP
Konferensi IOP. Seri: Jurnal Fisika: Conf. Seri812(2017) 012066 doi:10.1088/1742-6596/812/1/012066

Pewarnaan Endospora Bakteri pada Schaeffer Fulton

menggunakan Variasi Larutan Methylene Blue

Seorang Oktari*1, Y Supriatin1, M Kamal1dan H Syafrullah2

1Jurusan Analis Medis, Sekolah Analis Bakti Asih, Jalan Padasuka No. 233
Pasirlayung, Bandung 40192, Indonesia
2FakultasKedokteran Dharma Husada, Jalan Jakarta No. 75 Antapani, Bandung 40282,
Indonesia
Penulis koresponden : nio80zahra@gmail.com

Abstrak. Pewarnaan endospora merupakan jenis pewarnaan untuk mengenali keberadaan spora pada sel
vegetatif bakteri. Endospora bakteri memerlukan pewarnaan yang dapat menembus ketebalan dinding bakteri
spora. Salah satu metode pewarnaan endospora adalah metode Schaeffer Fulton yang menggunakan Malachite
Green. Ini adalah pewarnaan zat basa yang dapat menodai bakteri spora. Pada penelitian ini telah ditemukan
pewarnaan alternatif yang dapat menggantikan larutan Malachite Green dalam pewarnaan spora bakteri.
Alternatif pewarnaan yang digunakan adalah larutan Methylene Blue (konsentrasi 0,5 %, 0,7%, dan 1%) dengan
variasi pH (10, 11, dan 12), serta lama pemanasan yang bervariasi (3, 4, dan 5 menit). Semua perlakuan pewarnaan
berpengaruh terhadap hasil pewarnaan spora bakteri. Lamanya pemanasan sangat mempengaruhi zat warna
untuk menembus dinding spora bakteri, hal ini terlihat pada hasil dengan variasi konsentrasi pada pH 10,
menunjukkan bahwa waktu pemanasan tidak lama 3 dan 4 menit, spora bakteri tidak terwarnai, sedangkan dalam
waktu pemanasan lebih lama yaitu 5 menit spora bakteri terwarnai. Hal ini disebabkan karena semakin lama waktu
pemanasan dapat membuat pori-pori dinding spora terbuka sehingga memudahkan pewarna untuk masuk ke
dalam spora bakteri.

1. Perkenalan
Bakteri merupakan organisme yang paling banyak jumlahnya dan tersebar luas dibandingkan dengan yang lain.
Bakteri umumnya merupakan organisme uniseluler, prokariotik, dan mikroskopis. Bakteri juga memiliki kromosom,
ribosom, dan beberapa spesies lain memiliki butiran makanan, vakuola gas, dan magnestom. Beberapa bakteri
mampu membentuk dirinya menjadi endospora yang memungkinkannya bertahan hidup di lingkungan ekstrim [1].

Spora bakteri merupakan mekanisme bakteri yang sengaja diatur dalam upaya mengamankan diri
terhadap pengaruh buruk lingkungan luar. Spora bakteri mempunyai fungsi yang sama dengan kista
Amoeba, karena spora bakteri berupa spora dan kista Amoeba berupa fase kedua dimana
mikroorganisme tersebut berubah bentuk untuk melindungi dirinya terhadap faktor eksospora luar
yang tidak menguntungkan [2].
Pada pewarnaan spora bakteri terdapat dua metode yang umum digunakan, yaitu metode Schaeffer Fulton dan metode
Klein. Perbedaan kedua metode ini terletak pada pewarna yang digunakan. Pada metode Schaeffer Fulton pewarna yang
digunakan adalah Malachite Green dan Safranin, sedangkan pada metode Klein menggunakan pewarna Carbol Fuchsin dan
Methylene Blue. Metode Schaeffer Fulton merupakan metode yang sering digunakan oleh teknisi laboratorium, karena waktu
pewarnaan lebih cepat dibandingkan metode Klein [2]. Maka pada penelitian ini peneliti lebih memilih menggunakan metode
Schaeffer Fulton yang biasa digunakan dalam pewarnaan endospora.

Konten dari karya ini dapat digunakan berdasarkan ketentuanLisensi Creative Commons Atribusi 3.0. Setiap distribusi lebih lanjut
dari karya ini harus mempertahankan atribusi kepada penulis dan judul karya, kutipan jurnal, dan DOI.
Diterbitkan di bawah lisensi oleh IOP Publishing Ltd
1
MSCEIS Penerbitan IOP
Konferensi IOP. Seri: Jurnal Fisika: Conf. Seri812(2017) 012066 doi:10.1088/1742-6596/812/1/012066

Pada pewarnaan endospora metode Schaeffer Fulton menggunakan larutan basa yaitu Malachite Green dan
Safranin. Malachite Green yang digunakan memiliki pH 11,2 (bersifat basa). Pewarna Malachite Green dan Safranin
dapat bekerja dengan baik pada bakteri karena bersifat basa (komponen kromofor bermuatan positif), sedangkan
sitoplasma bakteri bersifat basofilik menyebabkan bakteri dapat menyerap zat warna dengan baik [3].
Methylene Blue merupakan salah satu pewarna Thiazine yang sering digunakan, karena ekonomis dan
mudah diperoleh. Merupakan pewarna dasar yang penting dalam proses pewarnaan kulit, kain dan kain
katun. Penggunaan Methylene Blue dapat menimbulkan beberapa efek, seperti iritasi saluran cerna jika
tertelan, menyebabkan sianosis inhalasi dan iritasi kulit jika tersentuh kulit. Metilen biru merupakan senyawa
hidrokarbon aromatik dengan rumus molekul C16H18N3SCl memiliki banyak kegunaan di berbagai bidang,
seperti biologi dan kimia. Pada suhu kamar berbentuk bubuk padat, tidak berbau, berwarna gelap, dan
berwarna hijau [4].
Larutan Methylene Blue juga digunakan sebagai pewarna pada kromoendoskopi, pewarnaan bakteri, dan
juga digunakan untuk memeriksa RNA atau DNA di bawah mikroskop. Larutan ini juga merupakan larutan
basa, mempunyai pH 11,4, larut dalam air dan alkohol, mempunyai sifat yang sama dengan malachite green
sehingga peneliti menggunakannya sebagai alternatif metode pewarnaan pewarna endospora Shcaeffer
Fulton. Dari hasil uji pendahuluan, larutan Methylene Blue dengan konsentrasi 0,5%, 07%, dan 1% dapat
menembus atau menembus endospora bakteri sehingga endospora tampak berwarna biru.

2. Metode Eksperimental
Pembuatan variasi pH larutan dimulai 250 mL Na2B4HAI7NaOH 0,025 M ditambahkan dengan 27 ml NaOH 0,20
M, kemudian ditambahkan air suling hingga 500 mL (untuk pH 10). Larutan berikutnya untuk pH 11 dimulai
dengan 250 mL NaHCO 0,50 M3ditambahkan 57 ml NaOH 0,20 M, kemudian ditambahkan air suling hingga
500 mL. Larutan terakhir untuk pH 12 dimulai 250 mL KCl 0,20 M ditambah 30 mL NaOH 0,20 M, kemudian
ditambahkan aquades hingga 500 mL.
Pembuatan larutan Methylene Blue 0,5% diawali dengan mengencerkan 0,1 gram pewarna ini dengan buffer pH
(10, 11, dan 12) sebanyak 20 mL. Kemudian untuk Methylene Blue 0,7% diawali dengan mengencerkan 0,14 gram
pewarna ini dengan buffer pH (10, 11, dan 12) sebanyak 20 mL. Langkah terakhir untuk Metylene Blue 1% diawali
dengan mengencerkan 0,2 gram pewarna ini dengan buffer pH ( 10, 11, dan 12) 20 mL. Prosedur metode Schaeffer
Fulton menggunakan Malachite Green 5% dimulai dengan menyiapkan olesan bakteri pada kaca objek, fiksasi dengan
api kecil dan ditambahkan Malachite green 5% di atas api, olesan bakteri tetap kemudian dipanaskan. mandi uap
selama beberapa menit. Ini akan melunakkan lapisan luar spora yang keras dan noda utama akan menempel pada
spora. Apabila diambil dari penangas uap dilanjutkan dengan pendinginan selanjutnya mengeraskan lapisan luar
spora, pada tahap ini baik spora maupun sel vegetatif tampak berwarna hijau, kemudian ditambahkan air dan H.2JADI
41% sebagai agen penghilang warna untuk sel vegetatif. Pewarna yang terakhir ditambahkan Safranin 0,5%, bila
diimbangi dengan pewarna ini, sel vegetatif mudah diwarnai dengan Safranin, dan sel tampak berwarna merah atau
merah jambu. Periksa menggunakan mikroskop 1000x.
Prosedur metode Schaeffer Fulton menggunakan variasi konsentrasi Methylene Blue (0,5%, 0,7%, dan 1%)
sama dengan prosedur standar namun yang membedakan adalah Malachite green diganti dengan variasi
konsentrasi Methylen Blue (0,5 %, 0,7%, dan 1%). Subyek bakteri pada percobaan ini adalahBacillus substilis
DanClostridium tetaniyang dapat menghasilkan endospora dengan jenis yang berbeda-beda.

3. Hasil dan Pembahasan

3.1. Hasil
Pewarnaan spora bakteri adalah pewarnaan dengan menggunakan larutan Malachite Green 5% dan Safranin 0,5%, sehingga
menghasilkan pewarnaan akan tampak warna hijau pada spora, begitu juga dengan warna merah pada sel vegetatif. Pada
metode Schaeffer Fulton yang banyak digunakan dalam pengecatan endospora, endospora terlebih dahulu diwarnai dengan
Malachite Green dengan proses pemanasan, larutan ini merupakan pewarna yang kuat untuk menembus ke dalam
endospora. Setelah perlakuan Malachite Green, kultur sel dicuci dengan air kemudian ditutup dengan cat safranin, teknik ini
akan menghasilkan endospora berwarna hijau dan merah muda pada sel vegetatif [5].

2
MSCEIS Penerbitan IOP
Konferensi IOP. Seri: Jurnal Fisika: Conf. Seri812(2017) 012066 doi:10.1088/1742-6596/812/1/012066

Pada pewarnaan endospora metode Schaffer Fulton, yaitu menggunakan larutan basa (Malachite Green dan Safranin).
Pewarna Malachite Green dan Safranin dapat bekerja dengan baik pada bakteri karena bersifat basa (komponen kromofor
bermuatan positif), sedangkan sitoplasma bakteri bersifat basofilik sehingga terjadi tarik menarik antara komponen kromofor
pada suatu zat pewarna dengan sel bakteri, hal ini menyebabkan bakteri dapat menyerap zat warna dengan baik. [6].

Pada penelitian ini peneliti menggunakan pewarna basah yaitu Methylene Blue sebagai alternatif pewarna
Malachite Green. Peneliti memvariasikan larutan Methylene Blue dengan konsentrasi 0,5%, 0,7% dan 1%,
kemudian memvariasikan pH larutan Methylene Blue, dan waktu pemanasan lebih lama yaitu 3-5 menit.
Berdasarkan hasil penelitian dan observasi kemudian dianalisis dengan perhitungan statistik uji Two-Way
ANOVA yang dilakukan pada variasi konsentrasi Methylene Blue (0,5%, 0,7%, 1%), variasi pH 10, 11, 12, dan pH
10. variasi waktu pemanasan 3 menit, 4 menit dan 5 menit menunjukkan perbedaan yang nyata secara
statistik, dimana F hitung > F tabel. Karena terdapat perbedaan hasil pewarnaan yang signifikan maka
dilanjutkan uji lanjutan dengan menggunakan uji LSD. Setelah dilakukan uji lanjut (LSD), diperoleh data dari
setiap perlakuan terhadap pewarnaan spora bakteri yang dimodifikasiBacillus subtilisDanClostridium tetani
apakah ada perbedaan pada setiap perlakuannya.
Di dalamBacillus subtilisPewarnaan spora bakteri dengan variasi penggunaan memberikan hasil
yang berbeda-beda. Pada konsentrasi 0,5% (Gambar 1a), hasil perlakuan pewarnaan sama dengan
standar yaitu pada variasi pH 10 dengan variasi waktu (5 menit), variasi pH 12 dengan variasi waktu (3
menit, 4 menit). dan 5 menit). Sedangkan hasil perlakuan yang berbeda dengan pewarnaan standar
terdapat pada variasi pH 11 dengan variasi waktu (3 menit, 4 menit dan 5 menit). Pada konsentrasi 0,7%
(Gambar 1b) hasil perlakuan yang sama dengan pewarnaan standar adalah pada variasi pH 10 dengan
variasi waktu (4 menit dan 5 menit), dan variasi pH 11 dengan variasi waktu (3 menit). dan 5 menit).
Sedangkan hasil perlakuan pewarnaan berbeda dengan standar yaitu pada variasi pH 10 dengan variasi
waktu (3 menit), variasi pH 11 dengan variasi waktu (4 menit), dan pada variasi pH 12 dengan variasi
waktu (3 menit, 4 menit dan 5 menit).
Pada konsentrasi 1% (Gambar 2a) hasil perlakuan pewarnaan yang sama dengan standar yaitu
pada variasi pH 10 dengan variasi (4 menit, 5 menit), dan variasi pH 11 dengan variasi waktu (4
menit dan 5 menit). menit). Sedangkan hasil perlakuan pewarnaan berbeda dengan standar yaitu
pada variasi pH 10 dengan variasi waktu (3 menit), variasi pH 11 dengan variasi waktu (3 menit),
dan variasi pH 12 dengan variasi waktu (3 menit). variasi waktu (3 menit, 4 menit dan 5 menit).

Dari pengamatan diperoleh pewarnaan bakteri pada modifikasiBacillus subtilisspora, maka dapat disimpulkan bahwa
semua perlakuan pewarnaan berpengaruh terhadap hasil pewarnaan spora bakteri. Seperti kita ketahui bahwa waktu
pemanasan sangat mempengaruhi zat warna untuk menembus dinding spora bakteri [7], hal ini terlihat pada hasil pewarnaan
dengan berbagai konsentrasi (0,5%, 0,7% dan 1%) pada pH 10, menunjukkan bahwa waktu pemanasan yang tidak lama yaitu 3
menit 4 menit spora bakteri tidak terwarnai, sedangkan pada waktu pemanasan yang lebih lama yaitu 5 menit spora bakteri
terwarnai. Hal ini disebabkan karena waktu pemanasan yang lebih lama membuat pori-pori dinding spora terbuka sehingga
memudahkan pewarna untuk masuk ke dalam spora bakteri.

(A) (B)
Gambar 1.Pewarnaan endospora dariBacillus subtilismenggunakan Methylene Blue (a) 0,5% pada pH 12 dan 3
menit; (b) 0,7% pada pH 10 dan 5 menit

3
MSCEIS Penerbitan IOP
Konferensi IOP. Seri: Jurnal Fisika: Conf. Seri812(2017) 012066 doi:10.1088/1742-6596/812/1/012066

(A) (B)
Gambar 2.Pewarnaan endospora menggunakan Methylene Blue (a)Bacillus subtilispada 1%, pH 11 dan 5
menit; (B)Clostridium tetanipada 0,5%, pH 11 dan 5 menit

Di dalamClostridium tetaniPewarnaan spora bakteri dengan variasi penggunaan memberikan hasil

yang berbeda-beda. Pada konsentrasi 0,5% (Gambar 2b) hasil perlakuan sama dengan pewarnaan
standar yaitu pada variasi pH 10 dengan variasi waktu (4 menit dan 5 menit), variasi pH 11 dengan
variasi (waktu 3 menit, 4 menit). dan 5 menit), dan pH 12 dengan variasi waktu (3 menit, 4 menit dan 5
menit). Sedangkan hasil perlakuan yang berbeda dengan pewarnaan standar yaitu pada variasi pH 10
dengan variasi waktu (3 menit), variasi pH 12 dengan variasi waktu (3 menit).
Pada konsentrasi 0,7% (Gambar 3a) hasil perlakuan yang sama dengan pewarnaan standar
adalah pada variasi pH 10 dengan variasi waktu (4 menit, dan 5 menit), variasi pH 11 dengan
variasi waktu (3 menit, 4 menit). menit dan 5 menit). Sedangkan hasil perlakuan yang berbeda
dengan pewarnaan standar terdapat pada variasi pH 10 dengan variasi waktu (3 menit), dan
variasi pH 12 dengan variasi waktu (3 menit, 4 menit dan 5 menit). Sedangkan pada konsentrasi
1% (Gambar 3b) dengan memvariasikan pH (10, 11, dan 12) dan variasi waktu pemanasan (3
menit, 4 menit dan 5 menit), hasil yang diperoleh tidak sama. standar.
Dari pengamatan yang diperoleh pada modifikasi pewarnaan bakteriClostridium tetanispora maka dapat
disimpulkan bahwa, semua perlakuan pewarnaan berpengaruh terhadap hasil pewarnaan spora bakteri.
Sebagaimana kita ketahui bahwa waktu pemanasan sangat mempengaruhi zat warna untuk menembus dinding
spora bakteri, hal ini terlihat pada hasil pewarnaan dengan berbagai konsentrasi (0,5%, 0,7% dan 1%) pada pH 10,
menunjukkan bahwa pemanasan waktu pemanasan yang tidak lama (3 menit) spora bakteri tidak terwarnai,
sedangkan pada waktu pemanasan yang lebih lama (4 menit 5 menit) spora bakteri terwarnai. Hal ini disebabkan
karena waktu pemanasan yang lebih lama membuat pori-pori dinding spora terbuka sehingga memudahkan pewarna
untuk masuk ke dalam spora bakteri [8].

(A) (B)
Gambar 3.Pewarnaan endospora dariClostridium tetanimenggunakan Metilen Biru (a) 0,7%
pada pH 10 dan 3 menit; (b) 1% pada pH 11 dan 4 menit

pH suatu larutan sangat berpengaruh dalam pewarnaan bakteri, dimana larutan Methylene blue yang
digunakan dalam pewarnaan spora bakteri haruslah bersifat basa, karena sifat sitoplasma bakteri adalah
basofilik [9], maka pada penelitian ini peneliti memvariasikan pH suatu larutan. pH larutan Metilen Biru (pH

4
MSCEIS Penerbitan IOP
Konferensi IOP. Seri: Jurnal Fisika: Conf. Seri812(2017) 012066 doi:10.1088/1742-6596/812/1/012066

10, pH 11, dan pH 12) untuk menentukan pH optimum yang dapat memberikan hasil yang sama dengan
pewarnaan standar. Dari hasil pengamatan yang diperoleh, variasi larutan Methylene Blue dengan pH (10, 11,
dan 12) dipengaruhi oleh konsentrasi larutan Methylene Blue (0,5%, 0,7% dan 1%).
Konsentrasi larutan juga dipengaruhi oleh variasi pH larutan yang digunakan. Sebagai contoh dapat
dilihat pada konsentrasi 0,7%, pada pH 10 dan 11 terlihat spora bakteri baik, sedangkan pada pH 12
spora bakteri tidak terlihat baik, karena penggunaan konsentrasi tinggi dan pH larutan lebih basa ( basa
kuat) maka pewarna metilen biru lebih pekat, sehingga bila diberi pewarna kedua dengan Safranin [10],
sel vegetatif tampak berwarna merah kebiruan dan merah keunguan. Sehingga spora bakteri dan sel
vegetatifnya tidak terlihat bagus.

4. Kesimpulan
Konsentrasi optimal menggunakan Methylene Blue sebagai pewarna alternatif Malachite Green dalam
pewarnaan bakteriBacillus subtilisspora berada pada konsentrasi 0,5% pada pH 12 dan waktu pemanasan
selama 3 menit. Saat dalam pewarnaan bakteriClostridium tetanispora berada pada konsentrasi 0,5% pada pH
11 dan waktu pemanasan 3 menit.

5. Referensi
[1] Zubaidah dan Elok 2006Mikrobiologi(Malang :Universitas Brawijaya Press)
[2] Waluyo dan Jenderal L 2004Mikrobiologi(Malang :UMM Pers)
[3] Volk dan Wheeler 2009Mikrobiologi Dasar edisi ke-5(Jakarta: Erlangga)
[4] Sutedjo M 2011Mikrobiologi Tanah(Jakarta: Rhineka Dicadangkan)
[5] Sumarsih S 2004Kegiatan Uji Lipolitik Beberapa Bakteri Hasil Isolasi Pelabuhan Tanjung
Perak dan Produksi Lipase Strain Terpilih(Surabaya: JIPTUNAIR)
[6] Ruth M, I 2009Fotodegradasi Methylene Blue dengan sinar UV dan Katalis ZnOTesis.
(Bukit Jimbaran : Universitas Udayana)
[7] Albert dan Bacillus 2008Biologi Seluler dan Molekuler(AS: Caister Academic)
[8]Dwidjoseputro 2010Dasar-dasar Mikrobiologi2 (Jakarta: Djambatan)
[9] Noirot P 2007Replikasi Kromosom Bacillus subtilis, Bacillus: Biologi Seluler dan Molekuler(
AS: Caister Academic Press )
[10] Pelczar MJ 2007Dasar-dasar Mikrobiologi(Jakarta : UI Pers)

Ucapan Terima Kasih

Penulis mengucapkan terima kasih kepada Laboratorium Mikrobiologi Politeknik Kesehatan Bandung dan staf
Analis Sekolah Bakti Asih Bandung yang telah membantu selama proses penelitian. Ucapan terima kasih juga
disampaikan kepada pihak-pihak lain yang telah banyak memberikan masukan dan saran terhadap penelitian
ini.