19 - H41kjbkjhb115518hgffv TG - 2
19 - H41kjbkjhb115518hgffv TG - 2
WA ODE KAMILLAH
H411 15 518
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS HASANUDDIN
MAKASSAR
2019
KLONING GEN Rv1926c Mycobacterium tuberculosis ISOLAT
MAKASSAR KE Escherichia coli JM 109 SEBAGAI KANDIDAT
VAKSIN TUBERKULOSIS
Skripsi ini diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
WA ODE KAMILLAH
H411 15 518
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS HASANUDDIN
MAKASSAR
2019
ii
iii
KATA PENGANTAR
Segala puji dan syukur penulis panjatkan atas kehadirat Allah SWT atas
dengan judul “Kloning Gen Rv1926c Isolat Makassar ke Escherichia coli JM 109
Sebagai Kandidat Vaksin Tuberkulosis” yang merupakan salah satu syarat untuk
Dalam upaya perwujudan karya tulis ini, banyak kendala yang penulis
tahap penyusunan laporan. Namun berkat doa, dukungan, kasih sayang yang tulus
dan semangat dari berbagai pihak, penulis akhirnya dapat melewati kendala-
kendala tersebut. Olehnya itu, dengan segala kerendahan hati yang tulu penulis
mengucapkan banyak terima kasih kepada kedua orang tua tercinta Ayahanda La
Ode Abd. Muzakir dan Ibunda Wa Ode Tuty atas doa, motivasi dan kasih sayang
yang tak terbatas yang telah diberikan kepada penulis selama menempuh
Terima kasih banyak penulis ucapkan kepada Ibu Dr. Rosana Agus,
M.Si. selaku pembimbing utama dan Dr. Zaraswati Dwyana, M.Si. selaku
penulis dalam melaksanakan penelitian dan penulisan skiripsi. Terima kasih atas
segala bimbingan, doa, semangat, dukungan dan saran dalam membantu penulis
Selain itu tak lupa penulis haturkan terima kasih banyak dan penghargaan
sedalam-dalamnya kepada:
iv
1. Rektor Universitas Hasanuddin Makassar beserta jajarannya.
beserta jajarannya.
4. Tim Penguji skripsi Ibu Dr. Elis Tambaru, M.Si. dan Bapak Drs. Ambeng,
akademik yang selalu memberikan arahan kepada penulis dari awal hingga
Penulis mengharapkan adanya saran dan kritik yang membangun dari para
pengetahuan kelak.
Penulis
v
ABSTRAK
vi
ABSTRACT
vii
DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL........................................................................................... ii
ABSTRAK .......................................................................................................... vi
DAFTAR GAMBAR...........................................................................................x
III.1 Alat...................................................................................................... 18
III.2 Bahan.................................................................................................. 18
V.1 Kesimpulan.......................................................................................... 30
ix
DAFTAR GAMBAR
x
DAFTAR LAMPIRAN
3. Komposisi Bahan..........................................................................................37
4. Prosedur Kerja..............................................................................................41
5. Gen Rv1926c................................................................................................42
xi
BAB I
PENDAHULUAN
memperkirakan terdapat 6,3 juta kasus TB baru yang dilaporkan terjadi (angka ini
naik dari 6,1 juta di tahun 2015), 10,4 juta orang sakit TB, dan 1,7 juta orang
satu negara dengan urutan kedua kasus TB tertinggi yang ada di dunia setelah
dengan jumlah penderita TB Paru 7.613 laki-laki dan 5.359 perempuan dan
diantaranya merupakan TB paru BTA positif sebesar 7.139 orang yaitu 4.277 laki-
ini dapat juga menyerang organ tubuh yang lainnya seperti selaput otak, tulang,
dan lain-lain. Penyakit ini dapat menular dari satu individu ke individu lain
Mycobacterium tuberculosis, misalnya dengan batuk atau bersin. Pada bayi lebih
rentan terinfeksi tuberkulosis. Hal ini disebabkan karena sistem imun pada bayi
1
yang belum sempurna, terjadi kontak dengan orang dewasa penderita tuberkulosis
mencegah tuberkulosis ialah vaksin Bacille Calmette Guérin (BCG). Vaksin ini
pertama kali diberikan pada tahun 1921 pada sebagian besar bayi baru lahir di
Uji klinis vaksin BCG menunjukkan adanya efikasi variabel (0% hingga
80%) (Fine, 1995). Level perlindungan dari vaksin BCG sangat bervariasi.
dengan berbagai kelemahan imunitas serta juga faktor garis lintang geografis,
misalnya BCG telah terbukti berkhasiat di Inggris dan Amerika Utara, tetapi tidak
demikian di India dan Afrika (Colditz et al., 1994), dan perbedaan dalam paparan
mikobakteri non-TB juga dapat mengganggu efikasi BCG (Black et al., 2002).
yang sangat tinggi. Walaupun pemberian vaksin BCG sudah termasuk dalam
program imunisasi rutin nasional di Indonesia, tetapi vaksin BCG tidak bisa
diandalkan lagi karena sudah lebih dari 90 tahun sejak vaksin ditemukan angka
vaksin yang baru ini diharapkan dapat menjadi alternatif vaksin yang digunakan
sekarang ini, yaitu BCG. Penelitian tentang pengembangan efikasi vaksin BCG
2
terus dilakukan. Terdapat lebih dari 200 kandidat vaksin telah diusulkan, dan
klinis. Pada hasil uji klinis fase IIB dari kandidat vaksin MVA85A ternyata tidak
tuberculosis yaitu MPT63 yang dikode oleh gen Rv1926c (Nagai et al., 1991).
Studi imunologi telah dilakukan pada MPT63 dan terbukti protein ini dapat
merangsang respon imun humoral pada babi guinea yang telah terinfeksi virulen
menginduksi reaktivitas sel Th1 dan juga menginduksi proliferasi dan IFNγ
(Werninghaus et al., 2003). Hal ini yang menyebabkan MPT63 bisa menjadi salah
Mycobacterium tuberculosis isolat Makassar. Oleh karena itu, pada penelitian ini
tuberkulosis.
3
2. Untuk melakukan karakterisasi klon rekombinan (Rv1926c-pGEM-T) dengan
Rv1926c – pGEM-T.
selanjutnya.
4
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Kingdom : Bacteria
Phylum : Actinobacteria
Class : Actinobacteria
Order : Actinomycetales
Family : Mycobacteriaceae
Genus : Mycobacterium
tuberkulosis. Bakteri ini berbentuk batang, tidak berspora, tidak berkapsul, dan
tuberculosis lebih tahan terhadap asam. Hal ini menyebabkan bakteri ini disebut
hidup di udara yang kering ataupun dalam kedaan yang dingin. Hal ini disebabkan
5
sehingga bakteri ini dapat hidup kembali dan menyebabkan penyakit
strain H37Rv merupakan genom yang sudah lengkap dan diterbitkan sejak tahun
6
II.2 Penyakit Tuberkulosis
II.2.1 Gejala
Adapun gejala klinik pada tuberkulosis dibagi menjadi 2 jenis, yaitu gejala
1. Gejala Respiratorik
Ciri-ciri dari gejala yang ditimbulkan seperti batuk selama 2 minggu lebih, batuk
2. Gejala Sistematik
Gejala sistematik yaitu jika organ yang terinfeksi dirasakan pada seluruh
tubuh dan tidak hanya spesifik pada satu organ dan gejala yang timbul tergantung
dari organ yang terlibat Ciri-ciri dari gejala yang ditimbulkan yaitu demam,
II.2.2 Patogenesis
tubuh menyebabkan terjadinya infeksi dan kemudian bisa hidup di dalam inang.
membunuh semua bakteri tersebut. Hal ini menyebabkan bakteri yang ada
7
didalam makrofag tersebut umumnya akan tetap tetap hidup dan berkembang biak
(Sheffield, 1994). Makrofag yang terinfeksi bakteri tersebut lama kelamaan akan
berubah menjadi granuloma dan seiring waktu, pusat-pusat dari granuloma ini
antara sel makrofag dan sel limfosit T. Sel TCD4 + akan memproduksi sitokin
utama yaitu IFN-γ setelah mendapat stimulasi dari antigen yaitu dalam hal ini
sitokin dan melisis sel yang telah terinfeksi (Emoto et al., 1999).
makrofag (1a), neutrofil (1b) dan DC (1c) bisa menjadi terinfeksi, sehingga
8
menyebabkan adanya produksi antimikroba peptida, sitokin dan kemokin.
yang terinfeksi berperan dalam menentukan jalur yang akan mengarah ke induksi
apoptosis atau nekrosis. Sel-sel apoptosis yang telah terinfeksi akan diambil oleh
DC dan kemudian akan bermigrasi ke kelenjar getah bening paru-paru pada 8-12
hari pasca infeksi di bawah pengaruh IL-12 (p40) 2 dan IL-12p70 serta kemokin
seperti CCL19 dan CCL21 (2), akan mendorong diferensiasi sel T naif menjadi
Th1 (3). Sel-sel Th1 akan bermigrasi kembali ke paru-paru dibawah pengaruh
kemokin selama 14-17 hari setelah paparan (4) dan menghasilkan IFN-γ, yang
`II.3 Vaksin
Vaksin adalah salah satu zat yang merupakan suatu bentuk dari produk
biologi yang diketahui berasal dari virus, bakteri atau kombinasi antara keduanya
yang telah dilemahkan. Vaksin diberikan kepada individu yang sehat dengan
Terdapat dua jenis dasar vaksin yaitu vaksin hidup yang telah dilemahkan
dan vaksin yang sudah tidak aktif. Vaksin yang telah dilemahkan langsung
9
rubella, gondong, vaccinia, rotavirus, dan influenza. Sedangkan vaksin dari
bakteri adalah bacille Calmette-Guérin dan vaksin tifoid oral (CDC, 2015).
stimulasi sistem imun. Selain vaksin ini mampu memacu respon imun yang
CD4+ yang terbukti dengan meningkatnya jumlah sel-sel CD4+ yang ada didalam
penelitian Black, et al. (2002) di mana anak-anak yang ada di London dan
memiliki respon latar belakang yang tinggi akibatnya sedikit saja peningkatan
10
menutupi efek dari vaksin BCG atau memblokir BCG dengan cara
Tipe vaksin yang kedua yaitu vaksin yang tidak aktif. Vaksin yang
tidak aktif berupa virus atau bakteri, atau komponen kecil dari keduanya. Vaksin
ini diproduksi dengan cara menumbuhkan bakteri atau virus pada suatu medium,
kemudian menonaktifkannya dengan cara dipanaskan dan atau diberi bahan kimia
dijadikan sebagai vaksin. Misalnya vaksin fraksional ialah vaksin subunit dan
vaksin toksoid. Contoh vaksin yang tidak aktif untuk sel utuh ialah polio, hepatitis
difteri, tetanus dan vaksin subunit contohnya vaksin untuk hepatitis B, influenza,
suatu antigen. Pembuatan vaksin subunit salah satunya dapat dilakukan dengan
(Yuwono, 1995). Salah satu jenis protein yang akan dijadikan sebagai kandidat
MP63. Protein ini dikode oleh salah satu jenis gen yang ada pada
11
Horwitz et al. (1995) melaporkasn bahwa protein MPT63 dijadikan
sebagai target untuk respon imun pada individu yang terinfeksi tuberkulosis.
dimurnikan dari sel Escherichia coli, dan MPT63 asli yang dimurnikan dari filtrat
serologis. MPT63 juga merangsang respon imun humoral pada babi guinea yang
respons imun yang kuat. MPT63 juga menginduksi reaktivitas sel Th1 dan juga
DNA sisipan dapat berupa DNA genom atau DNA komplementer (Snustad dan
Simmons, 2003).
12
II.4.1.2 Vektor
Vektor merupakan DNA untai ganda sirkuler yang ukurannya kecil (2000-
5000 pb) yang mampu membawa DNA asing masuk kedalam sel inang dan kemudian
akan melakukan replikasi dirinya didalam sel inang (Campbell et al., 2002). Terdapat
beberapa syarat yang harus dipenuhi oleh suatu molekul DNA agar bisa dijadikan
sebagai vektor yaitu harus memiliki penanda awal replikasi atau origin of replication
(ORI), penanda seleksi (misalnya antibiotic), serta situs pengenalan retriksi yang unik
dan vektor ekspresi. Vektor kloning ialah vektor yang digunakan untuk
perbanyakan gen saja. Sementara vektor ekspresi ialah vektor yang bukan hanya
melakukan perbanyakan tetapi vektor ini juga memiliki sinyal-sinyal eskpresi. Hal
ini menyebabkan gen yang dikloning juga dapat menjadi mRNA dan kemudian
ditranslasi menjadi sebuah protein (Brown, 1987). Salah satu jenis vektor yang
13
pGEM-T Easy merupakan plasmid sirkular yang terbuka, memiliki dua
ORF dan daerah penanda seleksi yaitu ampisilin (Amp) serta memiliki MCS.
pGEM-T Easy memiliki ukuran sebesar 3015 bp. Ukuran ini relatif kecil sehingga
pGEM-T Easy mampu membawa DNA sispan cukup banyak dan lebih mudah
beberapa kriteria yaitu memiliki laju pertumbuhan yang cepat, tumbuh dalam
serta dapat mengekspresiskan gen asing (Tamarin, 2002). Sel inang eukariot yang
sering digunakan dalam prosedur kloning yaitu Escherichia coli. Sementara sel
DNA rekombinan yang dihasilkan dari jumlah bahan awal yang terbatas. Pada
awalnya hanya beberapa DNA rekombinan yang tersedia, tetapi setiap bakteri
enzim retriksi, sehingga DNA vektor yang awalnya sirkuler akan terbuka sehingga
menjadi linier. DNA sisipan dan DNA vektor kemudian digabungkan sehingga
penggambungan antara DNA sisipan dan DNA vektor dinamakan proses ligasi dalam
14
kloning. Proses ligasi berlangsung dengan menggunakan enzim DNA ligase (Ausubel
et al., 1995). DNA rekombinan selanjutnya dimasukkan kedalam sel inang atau
digunakan harus bergantung dari sel inang yang akan dipakai. Misalnya, metode
yang dipakai dalam proses transformasi yaitu penggunaan CaCl 2. CaCl2 dipicu
dengan heat shock. Hal ini menyebabkan DNA rekombinan ada pada membran
luar dari sel kompeten dapat masuk ke dalam sel kompeten. Sel kompeten sel
melakukan seleksi terhadap gen target yang akan dikloning. Bila suatu gen
sintesis dinding sel. Vektor yang memiliki gen resisten terhadap ampisilin
15
mengkatalisis reaksi hidrolisis cincin β-laktam ampisilin. Hal ini menyebabkan
Seleksi biru putih yaitu metode yang digunakan untuk memisahkan sel
DNA sisipan. Tujuan dilakukan seleksi ini yaitu untuk mengetahui apakah proses
ligasi yang dilakukan itu berhasil atau untuk mengetahaui keberadaan dari DNA
sisipan.
Pada prosedur seleksi biru putih ini menggunakan media yang sudah
plasmid tanpa DNA sisipan kemudian ditumbuhkan pada media yang telah diberi
X-gal, IPTG dan ampisilin, maka gen lac-Z akan terekspresikan dan β-
galaktosa dan dikode oleh gen lacZ yang berada pada kromosom Escherichia
dikode oleh gen lacZ. IPTG digunakan sebagai induser. Bakteri yang
sedangkan bakteri yang mengandung plasmid saja tanpa DNA sisipan akan
16
Jika X-gal (ditambah induser enzim seperti IPTG) ditambahkan ke agar,
gen lacZ yang terganggu dan tidak dapat membuat β-galaktosidase, akan
Gambar 6. Ekspresi operon Lac pada Escherichia coli (a) Sistem operon lac tanpa
inducer (b) Sistem operan lac dengan inducer
Sumber: Campbell, 2002.
17