.

Isolat PMP 0126Y

a. Penyegaran isolat dan pengamatan morfologi
Isolat PMP 0126Y merupakan bakteri Gram negative, bentuk batang, dengan koloni
berwarna kuning .

Gambar 2. Koloni dari isolat PMP 0126Y dan morfologinya

b. Kurva Pertumbuhan Isolat PMP 0126Y

Berdasarkan kurva pertumbuhan, diperoleh bahwa waktu terbaik untuk

penuangan starter ke media produksi adalah sekitar jam ke -9 - 12. Pada jam tersebut,
bakteri sedang mengalami fase pertumbuhan eksponensial atau logaritmik di mana jumlah
sel bakteri yang akan menghasilkan enzim selulase pada media produksi maksimal,
sehingga produksi enzim selulase pada media produksi nantinya optimal. Hasil
perhitungan jumlah sel mencapai 2,95 X 109 dengan OD600 mencapai 1,190

Tabel . Pertumbuhan isolate bakteri PMP 0126Y selama pengamatan

Waktu OD
sampling Simple Duplo
0 0,151 0,130 0,141
3 0,451 0,449 0,450
6 1,031 0,951 0,991
9 1,043 1,202 1,123
12 1,238 1,263 1,251
15 1,259 1,283 1,271
18 1,239 1,264 1,252
21 1,256 1,270 1,263
24 1,091 1,091 1,091 Gb. Kurva pertumbuhan isolate PMP 0126Y
27 0,615 0,595 0,605
 Sedangkan hubungan OD dengan jumlah sel ditentukan melalui pengukuran
jumlah sel pada berbagai nilai OD hasil pengenceran nilai OD maksimum yang diperoleh
ketika menentukan kurva pertumbuhan (Tabel..).

Tabel . Hubungan OD dan jumlah sel PMP 0126Y

Pengenceran OD Jumlah sel Log Jumlah sel

8
1:01 1,190 29,5 x 10
9,47
1:02 0,783 14,8 x 108
9,17
1:04 0,441 7,3 x 108
8,87
1:08 0,249 3,7 x 108
8,57
1:16 0,143 1,8 x 108
8,27
1:32 0,088 0,9 x 108
7,96

Berdasarkan data di atas maka diperoleh hubungan OD dengan jumlah sel yaitu
sebagai berikut :
Y = 1,249X + 8,114 dimana Y = jumlah sel ; X = nila OD

c. Optimasi Produksi Enzim Selulase pada media dengan substrat CMC, limbah alginate
dan limbah agar

Substrat CMC
Pada optimasi produksi enzim menggunakan substrat CMC dilakukan
pengamatan terhadap OD, jumlah sel, glukosa yang dihasilkan dan aktivitas selulase
setiap hari dengan hasil seperti yang disajikan pada Tabel 3.

Tabel 3. Pertumbuhan sel dan aktivitas enzim selulase selama produksi

Konsentrasi
log Aktivitas
glukosa
Hari OD sel selulase
(mg/l)
0 0,502 8,7 0.069 0.064
1 0,745 9,0 0.070 0.065
2 0,742 9,0 0.079 0.073
3 0,654 8,9 0.116 0.108
4 0,533 8,8 0.076 0.070
5 0,486 8,7 0.075 0.069
 6 0,374 8,6 0.068 0.063

Gambar 5. Aktivitas enzim dan jumlah sel PMP 0126Y pada substrat CMC

Berdasarkan hasil di atas, maka aktivitas selulase tertinggi yang dihasilkan

oleh bakteri PMP 0126Y pada substrat CMC terjadi pada hari ketiga yaitu sebesar
0,108 U/ml.
Gambar di atas menunjukkan pertumbuhan bakteri dengan cepat mengalami
fase log pada hari ke 1 kemudian diikuti dengan fase stasioner sampai hari ke 2.
Pada awal produksi, media masih mengandung ekstrak khamir yang mudah diuraikan
oleh bakteri sebagai sumber nutrisi untuk pertumbuhannya. Ketika ekstrak khamir
habis, selanjutnya bakteri akan mengalami fase stationer diikuti dengan penurunan
jumlah sel. Sementara itu bakteri mulai memproduksi enzim selulase untuk
memanfaatkan CMC sebagai sumber karbon untuk pertumbuhan bakteri. Enzim
selulase mengalami aktivitas enzim tertinggi pada hari ketiga.
Untuk mengetahui aktivitas spesifik enzim, maka dilakukan penentuan kadar
protein terlarut. Dengan menggunakan kurva standar BSA kadar protein dapat
ditentukan. Hasil kadar protein enzim selulase dari isolat PMP0126Y (persamaan
kurva standar BSA : y = 0,258 + 0,025x) disajikan pada Tabel berikut.
Tabel 5. Hasil perhitungan aktivitas spesifik enzim selulase isolat
PMP0126Y
Absorbansi Konsentrasi Aktivitas spesifik
Hari
λ 595 nm protein (mg/ml) (U/mg)
0 0,373 4.580 0.014
1 0,281 0.920 0.070
2 0,296 1.520 0.048
 3 0,287 1.160 0.093
4 0,337 3.160 0.022
5 0,332 2.960 0.023
6 0,326 2.700 0.023

Pada tabel di atas, dapat dilihat bahwa konsentrasi protein tertinggi pada hari ke
0. Hal ini diduga kandungan protein terutama berasal dari komponen media produksi
enzim. Sedangkan pada hari ketiga dimana aktivitas enzim tertinggi, jumlah protein
yang dihasilkan tidak begitu besar sehingga ketika dilihat dari aktivitas spesifik dari
enzim selulase yang dihasilkan cukup besar. Oleh karena itu, dapat disimpulkan
bahwa pada hari ketiga menunjukkan kadar protein dari enzim itu sendiri di mana
kadar protein sebesar 1,16 mg/ml menghasilkan aktivitas spesifik sebesar
0.093U/ml/mg. Pada hari ke-6, di mana aktivitas selulase tidak ada, maka aktivitas
spesifik pun tidak akan terbentuk.

Substrat Limbah Alginat

Pada optimasi produksi enzim menggunakan substrat limbah alginate dilakukan
pengamatan terhadap OD, jumlah sel, glukosa yang dihasilkan dan aktivitas selulase
setiap hari dengan hasil seperti yang disajikan pada Tabel 6.

Tabel 6. Pertumbuhan sel, glukosa yang dihasilkan dan aktivitas enzim selulase
selama produksi

Konsentrasi
Aktivitas
log glukosa
Hari OD selulase
sel (mg/l)
0 0,549 8,8 0.0711 0.066
1 1,195 9,6 0.1052 0.097
2 1,139 9,5 0.0681 0.063
3 1,044 9,4 0.1229 0.114
4 0,911 9,3 0.0880 0.081
5 0,759 9,1 0.0743 0.069
6 0,708 9,0 0.0622 0.058

Dari data di atas dapat digambarkan pertumbuhan bakteri PMP 1026Y dan
produksi enzim selulase pada substrat limbah alginate sebagai berikut.
 Gambar 7. Aktivitas enzim dan jumlah sel PMP 0126Y pada substrat limbah alginat

Pada gambar di atas, dapat dilihat bahwa aktivitas enzim selulase tertinggi pada
hari ketiga yaitu 0,114 U/ml. Sedangkan untuk log sel bakteri terjadi pertumbuhan
optimum pada hari ke-1, kemudian selanjutnya mengalami fase stasioner.
Pengukuran kadar protein terlarut yang dihasilkan disajikan pada Tabel 7 di
bawah.

Tabel 7. Hasil penentuan kadar protein terlarut enzim selulase dari isolate PMP 0126Y pada
substrat limbah alginat

Absorbansi Konsentrasi Aktivitas spesifik

Hari
λ595 nm protein (mg/ml) enzim (U/mg)
0 0,606 13.90 0.005
1 0,253 0.00 0.00
2 0,247 0.00 0.00
3 0,266 0.300 0.379
4 0,319 2.440 0.033
5 0,371 4.520 0.015
6 0,367 4.340 0.013

Substrat Limbah Agar

Pada optimasi produksi enzim menggunakan substrat limbah alginate dilakukan
pengamatan terhadap OD, jumlah sel, glukosa yang dihasilkan dan aktivitas selulase
setiap hari dengan hasil seperti yang disajikan pada Tabel 8

Tabel 8. Pertumbuhan sel, glukosa yang dihasilkan dan aktivitas enzim selulase
selama produksi
 Konsentrasi
Aktivitas
log glukosa
Hari OD selulase
sel (mg/l)
0 0,350 8,7 0.108 0.100
1 1,134 9,0 0.071 0.066
2 1,064 9,0 0.079 0.073
3 1,005 8,9 0.076 0.071
4 0,703 8,8 0.077 0.072
5 0,458 8,7 0.080 0.075
6 0,392 8,6 0.075 0.069

Dari data di atas dapat digambarkan pertumbuhan bakteri PMP 1026Y dan
produksi enzim selulase pada substrat limbah agar sebagai berikut.

Gambar 8. Aktivitas enzim dan jumlah sel PMP 0126Y pada substrat limbah agar

Gambar di atas menunjukkan titik optimum aktivitas enzim selulase pada media
limbah agar terjadi pada hari ke-0. Hal ini mungkin karena enzim selulase sudah
mulai diproduksi di dalam media starter. Akan tetapi, jumlah sel (log sel) bakteri pada
media agar ini menunjukkan pertumbuhan yang optimum pada hari ke-1. Enzim yang
dihasilkan oleh bakteri pada hari ke-0 dapat meningkatkan pertumbuhan sel bakteri di
dalam media produksi. Selanjutnya enzim tetap dihasilkan namun dengan aktivitas
yang tidak melebihi aktivitas enzim pada hari ke -0.
 Pengukuran kadar protein terlarut dari enzim yang dihasilkan disajikan pada
Tabel 9 di bawah.

Tabel 9. Hasil penentuan kadar protein terlarut enzim selulase dari isolate PMP
0126Y pada substrat limbah agar

Absorbansi Konsentrasi Aktivitas spesifik

Hari
λ595 nm protein (mg/ml) enzim (U/mg)
0 0,528 10.80 0.009
1 0,254 0.12 0.546
2 0,2755 0.70 0.104
3 0,2465 0.00 0.00
4 0,3245 2.66 0.027
5 0,377 4.76 0.016
6 0,353 3.80 0.018

d. Karakterisasi Enzim Selulase PMP 0126Y

Karakterisasi dilakukan terhadap enzim kasar hasil ultrafiltrasi. Pemekatan

dengan ultrafiltrasi meningkatkan aktivitas enzim dari 0,064 menjadi 0,088 U/mL.

Optimasi pH

Optimasi pH dilakukan dengan menguji aktivitas enzim pada berbagai pH yaitu

menggunakan larutan bufer sitrat fosfat (pH 3-7) dan bufer Tris HCl (pH 8-9).
Berdasarkan data yang diperoleh menunjukkan bahwa pH optimum enzim adalah pH 5
(Gambar ..).

Gambar .. Pengaruh pH terhadap aktivitas selulase PMP 0126Y

Optimasi suhu
 Optimasi suhu dilakukan dengan menguji aktivitas enzim selulase dengan pada
berbagai suhu inkubasi yaitu suhu 20oC - 90oC. Substrat dilarutkan dalam bufer sitrat
fosfat pH 5 (pH optimum) yang telah diketahui sebelumnya. Hasil optimasi
menunjukkan bahwa enzim bekerja optimum pada suhu 30oC.

Gambar . Pengaruh suhu terhadap aktivitas selulase PMP 0126Y

Pengaruh ion logam

Pengaruh ion logam terhadap aktivitas selulase PMP 0126Y disajikan pada
Tabel ..
Aktivitas Selulase (U/ml) dengan penambahan
Ion Logam ion logam sebesar :
5 mM 10 mM
KCl 0,089 0,098
NaCl 0,072 0,072
MgCl2 0,083 0,067
FeCl2 0,075 0,100
CaCl2 0,138 0,107

e. Pemekatan Enzim dengan Amonium Sulfat ((NH4)2SO4)

Pemekatan enzim menggunakan ammonium sulfat menunjukkan bahwa NH4-
sulfat 50% memberikan aktivitas tertinggi (Tabel ..). Namun supernatan yang merupakan
buangan masih menunjukkan aktivitas yang cukup tinggi, kemungkinan disebabkan
kecepatan sentrifugasi yang belum cukup tinggi sehingga belum pemisahan belum cukup
sempurna.

Persentase Amonium Aktivitas Selulase (U/ml)

Sulfat (%)
Endapan Supernatan
30 0,069 0,059
40 0,069 0,065
50 0,072 0,068
60 0,071 0,064
70 0,066 0,065
80 0,064 0,065
90 0,064 0,062

f. Identifikasi isolate bakteri

Identifikasi bakteri yang dilakukan secara molekuler menunjukkan bahwa isolate
bakteri PMP 0126Y memiliki kemiripan sebesar 99% dengan Chryseobacterium
indologenes strain McR-1. Bakteri Chryseobacterium indologenesmerupakan bakteri
Gram negatif berbentuk batang yang tergolong sebagai bakteri non-fermentatif yaitu
bakteri yang hidupnya membutuhkan oksigen atau tergolong sebagai bakteri aerob,
sesuai dengan hasil pengamatan morfologi terhadap bakteri ini.