BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Ekstrak Enzim Azoreduktase dari Bakteri Pseudomonas stutzeri

Penelitian ini menggunakan enzim azoreduktase ekstraseluler yang
diperoleh dari bakteri Pseudomonas stutzeri. Bakteri ini dapat mendekolorisasi zat
warna congo red yang menunjukan adanya aktivitas enzim
azoreduktasedengannilaipersendekolorisasi81,55% (Safely, 2017). Ekstrak enzim
azoreduktase dari bakteri P. stutzeridiperoleh dengan cara sentrifugasi kultur cair
pada media NB yang diinkubasi selama 2x24 jam pada suhu 37◦C dalam shaker
inkubator. Supernatan yang didapat berupa cairan kuningjernihseperti pada
gambar 9. yang merupakan ektrak kasar enzim azoreduktase. Sedangkan endapan
yang didapat dari ekstrak enzim azoreduktase berwarna coklatm yang berupa sisa
media dan sel bakteri P. stutzeri.

Ekstrak enzim

Sisa media
&
sel

Gambar 9. Ekstrak kasar enzim azoreduktase dari bakerti P. stutzeri

Ekstrak kasar enzim azoreduktaseditentukan kadar protein dengan metode
Biuret. Absorbansinya diukur pada panjang gelombang maksimum λ597 nm dan
didapatkan kadar protein ektrak kasar enzim azoreduktase sebesar 16,06 mg/L.
Aktivitas enzim azoreduktase diuji dengan metode Zimmerman. Absorbansinya
diukur pada panjang gelombang maksimum λ534 nm dan didapatkan aktivitas
ekstrak kasar enzim azoreduktase sebesar 0,9778 Unit/mL. Berdasarkan nilai
kadar protein dan pengujian aktivitas enzimdidapatkan nilai aktivitas spesifik
enzim azoreduktase sebesesar 0,0622 U/mg (lampiran 4). Penelitian (Shah dkk,
2013) menunjukan nilai aktivitas spesifik enzim azoreduktase dari bakteri P.
StutzeriETL-79yang lebih kecil 0,034 U/mgdalam penghilangan zat warna azo
Reactive Black. Sedangkan penelitian Mendes et al menunjukkan nilai aktivitas
spesifik enzim azoreduktase dari bakteri P. putida MET94 yang lebih besar 0, 13
U/mg dalam penghilangan zat warna azo Metil Merah. Perbedaan aktivitas enzim
disebabkan karna sumber isolat dan strain bakteri yang berbeda (Alam dkk,
2013).

4.2 Fraksinasi Ammonium Sulfat

Fraksinasiammonium sulfatmenggunakan lima tingkatkejenuhan ammonium
sulfatyaitu 0-20%, 20-40%, 40-60%, 60-80% dan 80-100%,
denganmenggunakanstandartabel ammonium sulfat (lampiran 2).
Hasilfraksiselanjutnyadidialisismenggunakan membrane
selofansepertipadagambar 10.

Gambar 10. Dialisisfraksi ammonium sulfat azoreduktase

Tabel 1.Kadar protein,
aktivitasenzimdanaktivitasspesifikenzimazoreduktaseekstrak kasar
setelah difraksinasi
Aktivitas spesifik
Larutan Kadar protein Aktivitas enzim
No. Absorbansi enzim
Enzim (mg/mL) (U/mL)
(U/mg)
Ekstrak
1. enzim 0,889 16,02 0,9978 0,0622
kasar
2. F1 0,376 5,01 0,3403 0,0679
3. F2 0,215 1,49 0,1361 0,0913
4. F3 0,192 1,00 0,1065 0,1065
5. F4 0,289 2,90 0.2298 0,0792
6. F5 0,347 4,34 0,3030 0,0698

Berdasarkantabel 1hasilpenentuanaktivitasspesifikenzimazoreduktasetertinggi
setelah difraksinasi ditunjukanpadafraksi 3 (40-60%)dengannilai0,1065
U/mg.Hasilpenelitian Pandey
danDubeymenunjukkannilaiaktivitasspesifikazoreduktasedaribakteriAlcaligenes
sp. AA09 dalampenghilanganzatwarnaazoReactive Redsebesar 0.072 U/mg.
Fraksienzim yang digunakanfraksi yang memilikitingkatkejenuhan ammonium
sulfat 40%-60%.Hasiliniberbedadengannilaiaktivitaspadapenelitian Mani dan
Hameed
didapatkannilaiaktivitasspesifikazoreduktasedaribakteriPseudomonassp.B1dalamp
enghilanganzatwarnaazocampuransetelahdifraksinasisebesar 0,64
U/mg.Fraksienzim yang digunakanadalahfraksi yang memilikitingkatkejenuhan
ammonium sulfat
80%.Perbedaanaktivitasazoreduktasedapatterjadikarenabanyakjenisbakteriyang
telahdiisolasidariberbagaisumber (Misalet al, 2013). Kadar protein yang
tinggidenganaktivitasspesifikenzim yang rendahmenunjukkanbahwa, protein yang
terukurtidakhanya protein darienzimazoreduktase, melainkanterdapat protein
darienzim lain (Cahyanidkk, 2017). Fraksi3
denganaktivitasspesifikenzimtertinggidipilihuntukdigunakanpadapenentuankondis
i optimum enzimazoreduktasedaribakteriP. stutzeri.
4.3 Kondisi Optimum Aktivitas Enzim Azoreduktase dari Bakteri
Pseudomonas stutzeri
Aktivitas enzim azoreduktase diuji kondisi optimumnya karna aktivitas
enzim azoreduktase dapat dipengaruhi beberapa faktor diantaranya waktu
inkubasi, pH, suhu dan konsentrasi subsrat.
4.3.1 Waktu Inkubasi Optimum Azoreduktase dari Bakteri Pseudomonas
stutzeri.
Penentuan kondisi optimum pertama dilakukan pengujian waktu inkubasi
dengan berbagai variasi waktu inkubasi 0, 3, 4, 5, 6 dan 7 terhadap aktivitas enzim
azoreduktase dari bakteri P. stutzeri. Hasil uji seperti pada gambar 11.
 0.18
0.16
Aktivitas enzim (U/mL)

0.14
0.12
0.1
0.08
0.06
0.04
0.02
0
0 3 4 5 6 7

Waktu (menit)

Gambar 11. Grafik waktu inkubasi optimum aktivitas enzim azoreduktase

Berdasarkan gambar 11. Dapat dilihat waktu inkubasi optimum enzim
azoreduktase dari bakteri Pseudomonas stutzeri berada pada waktu 5 menit
dengan aktivitas enzim 0,1592 U/mL (Lampiran 4). Penelitian Siddiqui et al
menunjukkan waktu inkubasi azoreduktase dari bakteri Bacillus
patothenticuspada zat warna metil merahselama 5 menit dengan aktivitas enzim
0,077725 U/mL. Sedangkan waktu inkubasi enzim azoreduktase dari bakteri P.
aeruginosapada zat warna metil merah pada penelitian Vijaya et al menunjukkan
waktu inkubasi 5 menit dengan aktivitas enzim 1,73 U/mL. Menurut Bentubo dan
Gomperts (2014) bahwa waktu inkubasi adalah waktu yang diperlukan oleh enzim
untuk berikatan dengan substrat yang tersedia. Jika waktu inkubasi terlalu singkat
maka aktivitas enzim yang dihasilkan akan rendah sehingga interaksi tidak
berlangsung secara keseluruhan. Tetapi jika waktu inkubasi terlalu lama membuat
aktivitas enzim semakin menurun karena enzim mengalami denaturasi(Prastika,
2018). Hal ini disebabkan enzim adalah protein yang sensitif terhadap kerusakan
akibat paparan lingkungannya seperti suhu, cahaya dan bahan kimia yang
berinteraksi dengan enzim. Faktor tersebut akan memberikan efek kerusakan yang
berbanding lurus dengan lamanya interaksi dengan enzim. Semakin lama terkena
paparan tersebut akan semakin banyak yang rusak sehingga nilai aktivitasnya
turun (Adam dan Shovitri, 2014).

4.3.2 pH Optimum Azoreduktase dari Bakteri Pseudomonas stutzeri

Aktivitas enzim azoreduktase pada bakteri Pseudomonas stutzeri sangat
dipengaruhi oleh pH. Penentuan pH optimum dilakukan dengan variasi 0, 6, 6.5,
7, 7.5, 8. Hasil uji seperti pada gambar 12.
0.25

0.2
Aktivitas Enzim (U/mL)

0.15

0.1

0.05

0
0 6 6.5 7 7.5 8

pH

Gambar 12. Grafik pH opimum aktivitas enzim azoreduktase

Berdasarkan gambar 12 dapat dilihat pH optimum enzim azoreduktase dari
bakteri P. stutzeri yang diinkubasi pada waktu 5 menit menunjukkan aktivitas
enzim tertinggi pada pH 7 dengan aktivitas enzim 0,1913 U/mL (Lampiran 4).
Penelitian Shah et al (2013) juga terdapat padapH 7 sebagai pH optimum enzim
azoreduktase dari bakteri P. stutzeri ETL-79 padazatwarnaReactive Black dengan
nilai 0,332 U/mL. Begitu juga denganpenelitian Vijaya et al(2012) menunjukkan
pH optimum enzimazoreduktasedaribakteriP.aeruginosa terhadap zat warna metil
merah padapH 7 denganaktivitasenzim 1,81 U/mL.MenurutMisaldanGawai
(2018) Enzim azoreduktase memiliki pH stabil dalam kisaran pH 5-9 .Pada
penelitian diatas azoreduktase optimum pada pH 7atau pH netral, karena
dekolorisasi zat warna tekstil biasanya terjadi pada pH netral atau pH sedikit basa.
Namun, jika pH terlalu tinggi aktivitas enzim mengalami penurunan akibat
adanya denaturasi protein dan mengalami inaktivasi protein pada pH rendah (Shah
et al, 2013).
4.3.2 Suhu Optimum Azoreduktase dari Bakteri Pseudomonas stutzeri
Aktivitas enzim azoreduktase dari bakteri P. stutzeri sangat dipengaruhi
oleh suhu. Penentuan suhu optimum dilakukan dengan variasi 0, 31ºC, 35ºC,
37ºC, 39ºC, 41ºC. Hasil uji sepeti pada gambar 13.

0.2
0.18
Aktivitas enzim (U/mL)

0.16
0.14
0.12
0.1
0.08
0.06
0.04
0.02
0
0 31 35 37 39 41

Suhu ◦C

Gambar 13. Grafik suhu optimum aktivitas enzim azoreduktase

Berdasarkan gambar 12 dapat dilihat suhu optimum enzim azoreduktase

dari bakteri P. stutzeri yang diinkubasi waktu 5 menit pada pH 7 didapatkan suhu
optimum 37ºC dengan nilai aktivitas 0,1977U/mL (Lampiran 4). Sama dengan
penelitian Shah et al (2013) mendapatkan suhu optimum azoreduktase dari
bakteri P. stutzeri ETL-79 pada zat warna Reactive Black pada suhu 37ºC dengan
nilai 0,312 U/mL . Pada penelitian Vijaya et al (2012) mendapatkan pH optimum
azoreduktase dari bakteri P. aeruginosa terhadap zat warna metil merah pada suhu
37ºC dengan aktivitas enzim 1,79 U/mL. Kurva suhu mengikuti karakteristik
bentuk hiperbolik dimana pada suhu yang lebih rendah aktivitasnya lembih lambat
tetapi secara bertahap meningkat dengan meningkatnya suhu, ini terjadi karena
peningkatan laju dimana enzim dan substrat bertabrakan atau mengalami kontak
satu sama lain (Clark dan Switzer, 1977). Namun, dalam reaksi ini jika suhu
mencapai yang lebih tinggi (diatas 40ºC) ada gangguan struktur protein yang
menghasilkan inaktivasi dan denaturasi selanjutnya dari enzim (Vijaya et al,
2012).

4.3.3 Konsentrasi Substrat Optimum Azoreduktase dari Bakteri

Pseudomonas Stutzeri
Aktivitas enzim azoreduktase pada bakteri P. stutzeri sangat dipengaruhi
oleh konsentrasi substrat. Penentuan konsentrasi substrat optimum dilakukan
dengan variasi 30µM, 40µM, 50µM, 60µM dan 70 µM. Hasil uji seperti pada
gambar 14.

0.25

0.2
Aktivitas enzim (U/mL)

0.15

0.1

0.05

0
30 40 50 60 70
Konsentrasi substrat (μM)

Gambar 14. Grafik konsentrasi substrat optimum aktivitas enzim azoreduktase

 Berdasarkan gambar 14 dapat dilihat konsentrasi subsrat optimum enzim
azoreduktase dari bakteri P. stutzeri yang diinkubasi waktu 5 menit pada pH 7
dengan suhu 37ºC didapatkan konsentrasi subsrat 70 µM dengan aktivitas enzim
0,2221U/mL (Lampiran 4). Berbeda dengan penelitian Shah et al (2013)
mendapatkan konsentrasi substrat optimum azoreduktase dari bakteri
Rhodobacter sphaeroides terhadap zat warna azo campuran pada konsentrasi
substrat 100 µM. Menurut Prastika (2018) semakin tinggi konsentrasi substrat,
maka semakin banyak substrat yang dapat berikatan dengan sisi aktif enzim. Oleh
karena itu semakin besar terjadinya peningkatan laju reaksi.Tetapi jika seluruh sisi
aktif enzim telah berikatan dengan substrat maka laju reaksi tidak akan meningkat
walaupun dilakukan penambahan konsentrasi.

4.3.4 Nilai Km dan Vmaks

Nilai Vmaks dan Kmdibuat dalam persamaan Lineweaver-Burk, hasil

persamaan seperti pada gambar 15.

7
f(x) = 149.75 x + 2.15
R² = 0.97
6

5
1/V (U/mL)

0
0.01 0.02 0.03 0.04
1/S (µM)
Gambar 15. Kurva nilai Km
dan Vmaks pada persamaan Lineweaver-Burk
Berdasarkan gambar 15 diperoleh persamaan linear y= 149,75x + 2,1546 sehingga
didapatkan nilai Vmaks sebesar 0,464123dan Km sebesar 60,53096 µM (Lampiran
5). Penelitian Punj dan John (2009) mempunyai nilai K m dan Vmaks azoreduktase
dari bakteri Staphylococcus aereus sebesar 57 µM dan Vmaks sebesar 0,39 U/mL.
Perbedaan nilai Vmaks dan Km berhubungan dengan tingkat kemurnian enzim.
Enzim yang murni memungkinkan sisi-sisi aktifnya dapat bereaksi secara lebih
baik, sehingga meningkatkan aktivitasnya yang berdampak pada penurunan nilai
Km (Putra, 2009). Semakin kecil nilai Km semakin tinggi afinitasnya terhadap
substrat, sehingga semakin rendah konsentrasi substrat yang dibutuhkan untuk
mencapai kecepatan reaksi katalitik maksimum (Vmaks) (Nopiani et al., 2016).

BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan
1. Azoreduktase dari bakteri Pseudomonas stutzeri terdapat pada enzim
ekstraseluler dengan aktivitas spesifik enzim sebesar 0,0622 U/mg
2. Fraksi enzim yang digunakan untuk uji aktivitas enzim azoreduktase dari
Pseudomonas stutzeri pada kondisi optimum adalah fraksi 3 dengan
tingkat kejenuhan 40%-60% dengan aktivitas enzim spesifik sebesar nilai
0,1065 U/mg.
 3. Azoreduktase ekstraseluler dari bakteri Pseudomonas stutzeri mempunyai
aktivitas optimum pada kondisi waktu 5 menit, pH 7, suhu 37ºC dan
konsentrasi substrat 70µM dengan aktivitas enzim 0,2221 U/mL.
4. Azoreduktase dari bakteri Pseudomononas stutzeri memiliki nilai Vmaks
sebesar 0,464123 U/mL dan Km sebesar 60,53096µM.

5.2 Saran
1. Akvitas ekstrak enzim azoreduktase dari bakteri P.stutzeri yang
didapatkan kecil disarankan optimasi dari produksi bakteri yang dapat
meningkatkan produksi enzim azoreduktase dari bakteri P. Stutzeri.
2. Nilai Km dan Vmaks yang didapatkan diperlukan penelitian lebih lanjut
pada penelitian enzim azoresuktase intraseluler.