LAPORAN PRAKTIKUM

INSTRUMENTATION & BIOMOLECULAR TECHNIQUE

Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) METODE SANDWICH
PEMERIKSAAN KUANTITATIF IL-10

OLEH:
ANDRI SETIAWAN

NIM: 176070100011002

PROGRAM MAGISTER ILMU BIOMEDIK

FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA
MALANG
2018
 BAB I
PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) merupakan suatu teknik
biokimia untuk mendeteksi kehadiran antibodi atau antigen dalam suatu sampel.
ELISA dipakai untuk pengujian semua antigen, hapten atau antibody. Prinsip
kerja dari teknik ELISA adalah berdasarkan reaksi spesifik antara antibody dan
antigen dengan menggunakan enzim sebagai penanda (marker). Enzim tersebut
akan memberikan suatu tanda terdapatnya suatu antigen jika antigen tersebut
sudah bereaksi dengan antibodi. Reaksi tersebut memerlukan antibody spesifik
yang berikatan dengan antigen (Baker dkk, 2007).
Teknik ELISA didasarkan pada reaksi spesifik antara antigen dengan antibodi
yang memiliki sensitivitas dan spesifitas tinggi dengan menggunakan enzim
sebagai indikator. Prinsip dasar ELISA adalah analisis interaksi antara antigen
dan antibodi dengan menggunakan enzim sebagai penanda reaksi (Yusrini 2005).
Prinsip kerja ELISA adalah adanya ikatan antara antigen dan antibodi kompleks
dengan penambahan substrat tertentu dan enzim peroksida yang akan memberikan
perubahan warna pada hasil yang positif (Azwar 1985).
ELISA memiliki 4 teknik yaitu direct ELISA, indirect ELISA, sandwich
ELISA dan competitive ELISA. Direct ELISA merupakan metode ELISA yang
paling sederhana. Direct ELISA digunakan untuk mengukur konsentrasi antigen
pada sampel. Direct ELISA mendeteksi antigen dengan cara mengikat antigen
dengan antibodi yang telah dilabel seara langsung dengan enzim. Reaksi
pengikatan tersebut terjadi secara spesifik (Ausubel, 2003). Diret ELISA memiliki
keuntungan diantaranya lebih cepat karena prosedur dan reagen yang dibutuhkan
lebih sedikit (Elisa, 2017).
Indirect ELISA banyak digunakan untuk mengukur konsentrasi antibodi.
Enzim diikatkan pada antibodi sekunder yang berikatan dengan antibodi primer.
Antibodi sekunder biasanya adalah antispeies antibody dan sering dipakai
antibody poliklonal. Indirect ELISA memeiliki keuntungan diantaranya
sensitivitasnya tinggi dan lebih hemat karena membutuhkan antibody berlabel
yang lebih sedikit (Elisa, 2017).
Sandwich ELISA dicirikan oleh antibodi penangkap antigen yang diikatkan
pada fase padat. Teknik tersebut terdiri dari dua macam, yaitu direct sandwich
ELISA dan indirect sandwich ELISA. Antibodi penangkap pertama kali
diletakkan ke dalam well kemudian antigen dari darah atau urin ditambahkan ke
dalam well sehingga berikatan dengan antibodi penangkap. Jika ke dalam well
langsung ditambahkan antibodi detektor yang telah dilabel enzim maka disebut
dengan direct sandwich ELISA, sedangkan apabila ditambahkan antibodi detektor
yang tanpa dilabel enzim terlebih dahulu disebut dengan indirect sandwich ELISA
(Berg 2002). Prosedur ini memiliki keuntungan diantaranya spesifitasnya tinggi,
dapat digunakan untuk sampel kompleks dan sensitif (Elisa, 2017).
Competitive ELISA adalah teknik paling kompleks yang digunakan untuk
mengukur konsentrasi antigen atau antibodi dalam sampel dengan mengobservasi
campur tangan pada output sinyal yang diinginkan. Teknik ini sering digunakan
ketika hanya ada satu antibodi tersedia untuk antigen yang diinginkan atau ketika
sampel sedikit dan tidak dapat diikat oleh dua antibodi yang berbeda (Elisa,
2017).
Pengamatan hasil ELISA dilakukan secara kuantitatif maupun kualitatif.
Hasil ELISA secara kuantitatif dapat diamati dari nilai optical density (OD) yang
diukur dengan menggunakan ELISA reader. Hasil kuantitatif diinterpretasikan
dalam perbandingan dengan kurva standar (purifikasi antigen) agar dapat secara
tepat digunakan untuk menghitung konsentrasi antigen dalam berbagai sampel
(Elisa, 2017). Hasil ELISA secara kualitatif dapat diamati dengan adanya
perubahan warna menjadi kuning pada reaksi pengujian jika sampel yang diuji
mengandung antigen. Semakin tinggi intensitas warna yang terbentuk, maka
semakin tinggi pula konsentrasi antigen pada sampel tersebut (Miller, 2006). Data
ELISA biasanya digambarkan dengan nilai optical density (OD) dan konsentrasi
log untuk menghasilkan kurva sigmodial. Hal ini dapat dilakukan dengan
menggambar grafik langsung atau dengan software MS Excel curve fitting yang
ada pada ELISA reader (Elisa, 2017).
1.2 Tujuan
Tujuan dari praktikum Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) ini
adalah sebagai berikut:
1. Memahami prinsip kerja Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA).
2. Mampu melakukan pemeriksaan kuantitatif IL-10 dengan metode ELISA.
3. Mampu membuat grafik dari pengenceran standart dan memperoleh rumus
persamaan perhitungan konsentrasi sampel.
4. Mampu mengetahui kadar IL-10 pada sampel.
 BAB II
METODE PRAKTIKUM

2.1 Waktu dan Tempat

Praktikum Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) ini dilaksanakan
pada Rabu, 28 Februari 2018, dan bertempat di Labroratorium Sentral
Biomedik Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya.
2.2 Alat dan Bahan
A. Alat
Alat-alat yang digunakan pada praktikum Enzyme-linked
Immunosorbent Assay (ELISA) ini adalah sebagai berikut:
1. Elisa Reader
2. Mikropipet single & tip
3. Mikropipet Multichennel 20-200 µl
4. Inkubator
5. Tabung Ependof
6. Vortex
B. Bahan
Bahan-bahan yang digunakan pada praktikum Enzyme-linked
Immunosorbent Assay (ELISA) ini adalah sebagai berikut:
1. Serum tikus
2. Pre-coated ELISA Plate
3. Standard Solution
4. Standard Diluent
5. Streptavidin-HRP
6. Stop Solution
7. Substrate Solution A & B
8. Wash Buffer Concentrate
9. Biotin-Conjugate Anti-Rat IL-10 Antibody
10. Plate Sealer
11. Deionized or distilled water
2.3 Prosedur Kerja
Praktikum yang dilakukan menggunakan teknik Sandwich Indirect
ELISA. Adapun prosedur kerja yang dilakukan saat praktikum adalah sebagai
berikut :
1. Semua reagen, larutan standart dan contoh disiapkan sesuai intruksi.
2. Disiapkan pengenceran standart dan wash buffer
a. Pengenceran standart (diencerkan 120 µl Standard Solution ke dalam
120 µl Standard Diluent).

b. Wash Buffer (diencerkan Wash Buffer Concentrate 15 ml ke dalam

deionized or distilled water dan di tambahkan 300 ml).
3. Ditambahkan 50 µl standart ke masing-masing well plate.
4. Ditambahkan 40 µl sampel ke well plate dan 10 µl antibody anti-IL-10,
kemudian tambahkan 50 μl streptavidin-HRP ke well plate sampel dan
well standart (Not blank control well).
5. Diinkubasi selama 60 menit pada suhu 37 °C (well ditutup dengan sealer).
6. Sealer dibuka, dan well dicuci sebanyak 3 kali dengan wash buffer.
7. Ditambahkan 50 µl Substrate Solution A ke masing-masing well,
kemudian ditambah 50 µl Substrate Solution B
8. Dinkubasi selama 10 menit pada suhu 37°C.
9. Ditambahkan 50 µl stop solution ke masing-masing well (warna biru akan
berubah menjadi kuning).
10. Ditentukan Optical Density (OD), dan dibaca dengan Elisa Reader pada
panjang gelombang 450 nm, dalam 30 menit setelah penambahan Stop
Solution.
11. Dibuat kurva standart (software MS Excel curve fitting).
 BAB III
HASIL DAN PEMBAHASAN
3.1 Hasil Pengamatan

A. Hasil Pengukuran Standart

No Konsentrasi (pg/mL) Absorbansi

1 50 0.136
2 100 0.236
3 200 0.33
4 400 0.66
5 800 1.01

B. Kurva Standart

S =0.03460486
r =0.99756498
1
1.1

3
0.9
Y Axis (u nits)

4
0.7

6
0.5

7
0.3

9
0.1

0
0.0
0.0 146.7 293.3 440.0 586.7 733.3 880.0

X Axis (units)

C. Nilai Absorbansi dan Kadar IL-10 pada Sampel

No Sampel Absorbansi Kadar

(Pg/ml)
1 Sampel 1 0.22 109.11
2 Sampel 2 0.49 280.58
3 Sampel 3 0.601 361.88
4 Sampel 4 0.548 322.06
5 Sampel 5 0.612 370.4
 D. Plate Layout

Keterangan: Well A1: Blank, Well A2-A6 berisi Standart, Well A7-A11
adalah sampel.

3.2 Pembahasan

ELISA adalah suatu metode yang dikerjakan sebagai sarana

mengukur kadar antigen atau antibodi dalam suatu medium cair, seperti
serum atau organ yang telah dicairkan/dilarutkan. Metode ELISA yang
dilakukan dalam praktikum ini merupakan metode untuk mengukur kadar
IL-10 dalam serum tikus. Prinsipnya adalah adanya ikatan antigen-
antibodi yang akan dibaca dengan reaksi enzimatis yang dapat
mengakibatkan terjadinya perubahan intensitas warna pada larutan.
Intensitas warna ini kemudian akan diukur pada ELISA reader.

Metode ELISA yang dipakai pada praktikum ini adalah model

ELISA Sandwich Indirect (doubel antibody). Antibodi monoklonal atau
poliklonal dapat digunakan sebagai antibodi penangkap pada tipe
sandwich ELISA. Antibodi monoklonal mempunyai monospesifitas yang
memungkinkan hasil deteksi yang baik dan perbedaaan kuantitas yang
kecil pada konsentrasi antigen. Antibodi poliklonal digunakan untuk
menarik sebanyak mungkin antigen.

Plate dilekatkan dengan antibodi, lalu dimasukkan sampel antigen

kemudian ditambah antibodi kedua terkonjugasi enzim. Jika pada sampel
terdapat antigen maka akan terjadi kompleks antibodi. Antibodi primer 1,
Antibodi primer 2, Sinyal pertama-antigen-antibodi kedua terkonjugasi
enzim. Selanjutnya, dimasukkan substrat enzim sehingga enzim akan
memecah substrat dan menghasilkan warna. Hasil positif dideteksi dengan
melihat nilai absorbansi (OD) dan secara visual. Hasil positif ini
berbanding lurus yaitu semakin banyak antigen pada sampel maka
semakin banyak antibodi yang terdeteksi dan semakin tinggi nilai optical
densitinya

Hasil absorbansi yang didapatkan pada praktikum menunjukkan

bahwa semakin besar konsentrasi maka nilai OD semakin besar
(berbanding lurus). Tabel hasil pengukuran standar dapat dibuat kurva
standart dimana sumbu x adalah konsentrasi (pg/ml) dan y adalah nilai
absorbansi. Dari kurva standart dapat diketahui nilai regresi r=0,99756.
Persamaan tersebut akan digunakan untuk menghitung konsentrasi kadar
sampel.

Pada sampel 1 didaptkan nilai absorbansi 0,22 setelah dimasukkan

persamaan kurva standar di dapatkan nilai kadar IL-10 adalah 109,117
pg/ml. Sampel 2 nilai absorbansi 0,49 dan kadar IL-10 adalah 280,587
pg/ml. Sampel 3 nilai absorbansi 0,601 dan kadar IL-10 adalah 361,884
pg/ml. Sampel 4 nilai absorbansi 0,548 dan kadar IL-10 adalah 322,065
pg/ml. Sampel 5 nilai absorbansi 0,612 dan kadar IL-10 adalah 370,404
pg/ml.
 BAB IV

PENUTUP

4.1 Kesimpulan
Kesimpulan dari praktikum Enzyme-linked Immunosorbent Assay
(ELISA) ini adalah sebagai berikut:
1. Prinsip kerja ELISA didasarkan pada reaksi antara antigen dan
antibodi secara spesifik, dengan menggunakan enzim sebagai
penanda reaksi. Metode yang dipakai adalah metode ELISA
Sandwich Indirect (doubel antibody). Kelebihan dari metode ini
adalah sampel tidak harus dimurnikan sebelum dianalisis, dan
pengujiannya bisa sangat sensitif.
2. Hasil kuantitatif diinterpretasikan dalam perbandingan dengan
kurva standar Optical Density (OD), dari kurva standar didapatkan
nilai regresi r=0,99756, hasil absorbansi menunjukkan bahwa
semakin besar konsentrasi maka nilai OD semakin besar
(berbanding lurus).
3. Kadar IL-10 pada sampel 1 adalah 109,117 pg/ml, sampel 2 adalah
280,587 pg/ml, sampel 3 adalah 361,884 pg/ml, sampel 4 adalah
322, 065 pg/ml, sampel 5 adalah 370, 404 pg/ml.
 DAFTAR PUSTAKA

Ausubel, F.M., R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.G. Seidman, J.A. Smith &
K. Struhl. 2003. Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons,
Inc., USA.
Azwar, I. G. M. 1985. Kemungkinan Penggunaan Enzyme-linked Immunosorbent
Assay (ELISA) Dalam Diagnosa Serologis Brucellosis. IPB: Bogor.
Baker, G.B, S. Dunn & A. Latja. 2007. Handbook of neurochemistry and
molecular neurobiology: Practical nerochemistry methods, vol. 6. Springer
Science, New York.
Berg, J. M. 2002. Indirect ELISA and Sandwich ELISA. (Online).
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK22420/ diakses 9 Oktober 2018.
Elisa, 2017. Elisa Basics Guide. Life Sciences Groub, Canada
Miller, D. C. 2006. Mechanism of enhanced vascular cell response to polymeric
biomaterials with nano-structured surface features. ProQuest Information and
Learning Company, Ann Arbor.
Yusrini, H. 2005. Teknik Analisis Kandungan Aflatoksin B1 Secara Elisa Pada
Pakan. Buletin Teknik Pertanian Vol. 10, Nomor 1. Bogor.