LAPORAN PRAKTIKUM KI-3261

Metabolisme dan Informasi Genetik

Percobaan 06 :

Induksi β-Galaktosa

Nama : Ronaldo G.S

NIM : 10515011

Kelompok : II

Tanggal Percobaan : 22 Maret 2018

Tanggal Pengumpulan : 29 Maret 2018

Asisten : Fildzah Istiqomah

LABORATORIUM BIOKIMIA

PROGRAM STUDI KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNGBANDUNG

2018
 Percobaan 06

Induksi β-Galaktosa

I. Tujuan percobaan
Membandingkan aktivitas enzim β-galaktosidase pada media cair NB, NBL
(media cair + laktosa), dan NBL (media cair + laktosa + glukosa).

II. Teori dasar

Ekspresi gen atau sintesis enzim dapat diatur. Enzim merupakan katalis yang
berperan menjalankan metabolisme pada makhluk hidup. Keberadaan enzim akan
menentukan berjalannya suatu metabolisme. Bila suatu metabolisme di dalam sel
sudah mencapai kuantitas yang cukup. Metabolisme tersebut akan dihentikan.
Penghentian ini dilakukan dengan cara menghentikan produksi enzim melalui
ekspresi gen pengkodenya. Mekanisme pengaturan ekspersi gen ini dinamakan
regulasi ekspresi gen.

Regulasi ekspresi gen terbagi menjadi dua sistem regulasi, yaitu sistem
regulasi operon lactosa ( lac operon ) dan operon triptopan ( operon trp ). Pada
percobaan ini ingin dipelajari pengendalian sintesis enzim lac operon. Operon
adalah sekumpulan gen yang ekspresinya dikendalikan oleh satu promotor yang
sama. Regulasi dibedakan menjadi dua berdasarkan regulatornya yang bersifat
aktivasi dan deaktivasi operator. Sistem lac operon adalah sistem pengendalian
ekspresi gen-gen yang bertanggung jawab dalam metabolisme laktosa.

Pada lac operon terdapat tiga gen struktural utama yaitu gen Lac Z, Lac Y,
dan Lac A. Gen Lac Z adalah gen yang mengkode enzim β-galaktosidase yang
memutus ikatan β-glikosidik disakarida menjadi monomernya. Pada percobaan
ini ingin dibandingkan aktivitas enzim β-galaktoside pada berbagai media
menggunakan metode spektofotometri. Sehingga digunakan substrat yang dapat
menghasilkan produk yang dapat diukur dengan alat spektrofotometer. Substrat
yang digunakan adalah ONPG ( ortho-nitrofenil-β-D-galaktopiranosida ). ONPG
memiliki ikatan β-glikosidik yang dapat diputus oleh bantuan enzim β-
 galaktoside. Pemutusan ini menghasilkan dua monomer yaitu ONP (orto-
nitrofenol) dan galaktosa.

Gambar 1. Reaksi hidrolisis ONPG oleh enzim β-galaktosidase.

ONP yang dihasilkan berwarna kuning. Sehingga intensitas warna yang

dihasilkan dapat diukur dengan spektrofotometer pada 420 nm. Banyaknya ONP
yang terbentuk sebanding dengan banyaknya enzim β-galaktoside yang
digunakan.

III. Data Pengamatan

1. Data pengukuran optical density (OD) E. Coli pada setiap medium pada
panjang gelombang 600 nm.

Media Absorbansi
NB 0,348
NBL 0,436
NBLG 0,261
Tabel 1. Nilai OD setiap medium pada panjang gelombang 600 nm.

2. Data pengukuran absorbansi setiap medium pada setiap waktu inkubasi pada
panjang gelombang 420 nm.

Absorbansi
Media 0 10 20 30 40
menit menit menit menit menit
NB 0,051 0,064 0,128 0,190 0,233
NBL 0,449 1,727 1,727 1,727 1,727
NBLG 0,081 0,382 0,626 0,980 1,167
Tabel 2. Nilai absorbansi setiap medium pada setiap waktu inkubasi pada
panjang gelombang 420 nm.
IV. Pengolahan Data
1. Data grafik absorbansi setiap media terhadap waktu.

Grafik Absorbansi terhadap Waktu

2
1.8
1.6
1.4
Absorbansi

1.2
1 NB
0.8 NBL
0.6 NBLG
0.4
0.2
0
0 1 2 3 4 5 6
Waktu (menit)

Grafik 1. Grafik absorbansi terhadap waktu

2. Penentuan aktivitas enzim β-galaktoside pada setiap media.

𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖420
𝐴𝑘𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡𝑎𝑠 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚 =
𝑇𝑖𝑛𝑘𝑢𝑏𝑎𝑠𝑖 × 𝑉 × 𝑂𝐷600

Contoh perhitungan aktivitas enzim pada media NB pada waktu inkubasi 10

menit :
𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖420
𝐴𝑘𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡𝑎𝑠 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚 =
𝑇𝑖𝑛𝑘𝑢𝑏𝑎𝑠𝑖 × 𝑉 × 𝑂𝐷600
0,064
𝐴𝑘𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡𝑎𝑠 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚 =
10 𝑚𝑒𝑛𝑖𝑡 × 0,5 𝑚𝐿 × 0,348
𝐴𝑘𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡𝑎𝑠 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚 = 0,036782 𝑚𝑒𝑛𝑖𝑡 −1 𝑚𝑙 −1

Dengan perhitungan yang sama diperoleh aktivitas enzim pada setiap media
dengan tiap waktu inkubasi data sebagai berikut :

Aktivitas enzim (menit-1 mL-1)

Media
0 menit 10 menit 20 menit 30 menit 40 menit
NB - 0,036782 0,036782 0,036398 0,033477
NBL - 0,992529 0,496264 0,330843 0,248132
NBLG - 0,21954 0,179885 0,187739 0,167672
 Tabel 3. Nilai aktivitas enzim pada setiap media dengan tiap waktu inkubasi.

V. Pembahasan
Operon adalah sekumpulan gen yang ekspresinya dikendalikan oleh satu
promotor yang sama. Gen-gen semacam ini pada umumnya adalah gen-gen yang
terlibat di dalam suatu rangkaian reaksi metabolism yang sama. Pada percobaan
ini misalnya metabolisme laktosa. Pengelompokan gen semacam ini di dalam
suatu operon membuat sel menjadi lebih efisien di dalam melakukan proses
metabolisme.
Secara umum dikenal dua sistem pengendalian ekspresi genetic yaitu
pengendalian positif dan pengendalian negative. Pengendalian pada suatu gen
atau operon melibatkan aktivitas gen regulator. Pengendalian positif pada suatu
operon artinya operon tersebut dapat diaktifkan oleh produk ekspresi gen
regulator. Sebaliknya, pengendalian negative berarti operon tersebut
dinonaktifkan oleh produk ekspresi gen regulator. Produk gen regulator ada dua
macam yaitu activator, yang berperan dalam pengendalian secara positif dan
repressor yang berperan dalam pengendalian secara negative. Pengikatan
activator atau repressor pada promoter ditentukan oleh keberadaan suatu molekul
efektor. Molekul efektor yang mengaktifkan ekspresi suatu gen disebut inducer,
sedangkan yang bersifat menekan ekspresi suatu gen disebut repressor.
Sistem lac operon adalah sistem pengendalian ekspresi gen-gen yang
bertanggung jawab di dalam metabolism laktosa. Laktosa adalah disakarida yang
tersusun atas glukosa dan galaktosa. Jika bakteri E. coli ditumbuhkan dalam
medium yang mengandung sumber karbon glukosa dan laktosa secara bersama-
sama maka E. coli akan menunjukkan pola pertumbuhan yang spesifik. E. coli
menggunakan glukosa sebagai sumber karbon sampai akhirnya glukosa habis dan
E. coli menggunakan laktosa sebagai sumber energi. Namun sebelum dipakai
menjadi energi, laktosa dihidrolisis oleh enzim β-galaktosidase menjadi
monomernya, yaitu glukosa dan galaktosa. Dimana glukosa dapat digunakan
sebagai sumber energi. Peristiwa ini dinamakan matabolisme laktosa. Sehingga
pada percobaan ini ingin dibandingkan aktivitas enzim β-galaktosidase pada
media cair yang tidak mengandung laktosa maupun glukosa dengan media cair
yang mengandung laktosa saja dan media cair yang mengandung laktosa dan
glukosa.
Operon laktosa terdiri atas 3 gen structural utama yaitu gen lac Z mengkode
enzim β-galaktosidase yang memutus ikatan β-glikosidik pada disakarida
menghasilkan monomernya. Gen lac Y mengkode permease galaktosida, yaitu
enzim yang berperan dalam pengangkutan laktosa dari luar ke dalam sel, dan gen
lac A mengkode enzim transasetilase thiogalaktosida yang perannya mentransfer
gugus asetil pada asetil Co-A ke β-galaktosidase. Ketiga gen struktural tersebut
dikendalikan ekspresinya oleh satu promoter yang sama dan menghasilkan satu
mRNA. Selain ketiga gen structural tersebut, juga terdapat gen regulator lac I
yang mengkode suatu protein repressor dan merupakan bagian sistem
pengendalian operon laktosa.

Gen pengatur lacl terletak di luar operon, mengkode protein repressor yang
dapat mengubah operon lac ke keadaan off dengan cara mengikatkan diri pada
operator. Dalam keadaan ini, suatu molekul kecil yang spesifik, disebut induser,
mendeaktivasi represor. Untuk operon lac, indusernya adalah alolaktosa, sebuah
isomer dari laktosa yang terbentuk dalam jumlah kecil dari laktosa yang masuk ke
dalam sel.
 Pada keadaan tidak ada laktosa (sehingga alolaktosa juga tidak ada),
repressor lac akan berada dalam konfigurasi aktifnya, dan gen-gen operon lac
akan berada dalam keadaan diam. Jika laktosa ditambahkan ke medium nutrient
sel tersebut, alolaktosa akan mengikatkan diri pada repressor lac dan mengubah
konformasinya, menghilangkan kemampuan repressor untuk mengikatkan diri
pada operator. Sehingga proses transkripsi terjadi dimana gen-gen structural yang
ada akan mengkode enzimnya.

Bakteri E. coli dapat mengetahui konsentrasi glukosa didalam selnya

dikarenakan adanya interaksi antara protein pengatur yang dinamakan CRP pada
bakteri dengan molekul organik yang dinamakan AMP siklik (cAMP) pada sel.
Interaksi antara CRP dan cAMP ini mengubah bentu CRP sehingga mengikat ke
promotor yang membantu kerja operator dan RNA polymerase bekerja optimal.
Dimana jumlahnya akan berakumulasi bila glukosa tidak ada. Sehingga saat
jumlah dari glukosa di dalam sel meningkat, konsentrasi cAMP akan menurun
dan CRP yang berinteraksi dengannya juga akan sedikit. Dimana CRP adalah
protein yang membantu kerja RNA polymerase sehingga proses transkripsi
berjalan dengan optimal. Sehingga dapat disimpulkan saat glukosa semakin
banyak cAMP akan semakin sedikit dan CRP yang berinteraksi dengan cAMP
juga akan sedikit sehingga bentuk aktif CRP tidak akan terlalu banyak berikatan
dengan promotor dan kerja operattor dalam menerima RNA polymerase tidak
akan optimal.
Pada percobaan ditumbuhkan E. coli pada tiga medium, yaitu medium cair
saja (NB), medium cair ditambah laktosa (NBL), dan medium cair ditambah
laktosa dan glukosa (NBLG). Diharapkan E. coli dapat menghasilkan enzim β-
galaktosidase. Pengukuran optical density dilakukan pada panjang gelombang
600 nm. Pengukuran optical density berfungsi untuk menentukan konsentrasi E.
coli dalam medium.
Penambahan buffer Z berfungsi untuk mengekstraksi media yang digunakan
sehingga memisahkan enzim β-galaktosidase tetap dalam pelet. Di dalam buffer Z
terdapat β-mercaptoethanol yang berfungsi memutus ikatan disulfida, sehingga
membran sel pada E. coli rusak dan enzim dapat dikeluarkan. Penambahan SDS
0.1% membantu lisis dari membran sel agar semakin lebih mudah. Kloroform
berfungsi untuk melarutkan organel-organel sel dan zat pengotor yang tidak
diinginkan. Dengan dilakukan sentrifugasi dan penambahan tiap zat, diharapkan
enzim keluar dari membran sel dan berada dalam larutan sehingga aktivitasnya
dapat diukur melalui metode spektrofotometri. Pengukuran absorbansi larutan
produk dilakukan hingga 40 menit reaksi dengan interval waktu 10 menit.
Na2CO3 berfungsi menghentikan reaksi enzimatis, dimana Na2CO3 yang
menyebabkan struktur enzim berubah dan tidak terjadi hidrolisis substrat lagi.
Hasil yang diperoleh menunjukkan aktivitas enzim yang paling tinggi seiring
berjalannya waktu ada pada media NBL disusul dengan media NBLG lalu NB.
Hal ini dikarenakan pada media NBL, laktosa yang ditambahkan mengalami
isomerisasi membentuk alolakatosa yang saat berikatan dengan represor
mengubah konformasinya sehingga tidak dapat berikatan dengan operator. RNA
polymerase dapat lewat dan proses transkripsi terjadi sehingga gen lac Z dapat
mengkode enzim β-galaktosidase untuk menghidrolisis substrat ONPG. Pada
media NBLG terdapat glukosa yang mengakibatkan energi dalam sel dapat
terpenuhi tanpa harus mengkode enzim β-galaktosidase untuk menghidrolisis
substrat. Selain itu dengan adanya glukosa jumlah cAMP akan semakin sedikit.
CRP yang berinteraksi dengan cAMP akan sedikit juga. Sehingga bentuk aktif
CRP akan berjumlah sedikit yang berikatan dengan promotor yang membantu
kerja operator agar RNA polymerase dapat lewat. Sehingga enzim β-
galaktosidase yang dikodekan pun akan lebih sedikit pada media ini dibanding
media NBL. Pada media NB terjadi aktivitas enzim namun tidak sebesar pada
media NBL dan NBLG dikarenakan kerja lac operon pada enzim ini tidak
ddibantu oleh spesi apapun. Selain dari nilai aktivitas enzim yang diperoleh
secara kuantitatif. Grafik absorbansi yang diperoleh pada percobaan ini dapat
digunakan untuk memprediksi aktivitas enzim β-galaktosidase. Pada grafik
absorbansi terhadap waktu setiap media dapat dilihat absorbansi yang paling
 tinggi ada pada media NB. Hal ini memperlihatkan bahwa enzim β-galaktosidase
yang bereaksi dengan substrat jauh lebih banyak pada media NB dibandingkan
media lainnya.

VI. Kesimpulan
Melalui percobaan yang telah dilakukan. Diperoleh bahwa aktivitas enzim
paling tinggi ada pada media pertumbuhan NBL disusul media pertumbuhan
NBLG lalu NB dibuktikan dengan data dibawah ini :

Aktivitas enzim (menit-1 mL-1)

Media
0 menit 10 menit 20 menit 30 menit 40 menit
NB - 0,036782 0,036782 0,036398 0,033477
NBL - 0,992529 0,496264 0,330843 0,248132
NBLG - 0,21954 0,179885 0,187739 0,167672
Tabel 4. Nilai aktivitas enzim pada setiap media dengan tiap waktu inkubasi.

VII. Daftar Pustaka

J.H. Miller in “Experiments in Molecular Genetics”, 1972, Cold Spring Harbor
Laboratories, p. 352-355.
Stryer L., 1998, Biochemistry, 4th ed., W. H. Freeman and Company, New York.
Nelson, David L. and Cox, Michael M., 2005, Principles of Biochemistry
4th edition, United States: University of Wisconsin-Madison.
Fional Frais, Practical Biochemistry an Introductory Course, st Ed., Butterworths
Co., London, 1972, 124.