Kultur Cell Line (Sel Lini)

Arleni
( Lab Terpadu/ Ilmu Biomedik FKUI )
 Pengertian Dasar Kultur Sel
 Tipe Kultur Jaringan
 Keuntungan Kultur Jaringan
 Model eksperimental invitro
 Prinsip Dasar Pembuatan Kultur
 Kultur Cell Line (CL)
 Karakteristik cell line
 Bahan-bahan
 Alat-alat
 Protokol : Thawing, Culture + Subculture, Harvest,
Counting cells, Freezing cells.
 Hasil Kultur CL
 Kendala dan Penanganannya
Pengertian Dasar Kultur Sel
 Teknik memperbanyak sel secara invitro
 Pengujian & Pemanfaatan karakteristik
 morfologi dan fungsi sel
 Perkembangan dan diferensiasi sel
 Siklus sel dan modulasi ekspresi gen
 Fusi sel dan uji sitotoksisitas
Tipe Kultur Jaringan
 Kultur organ: morfologi dan ciri organ tetap
dipertahankan
 Kultur explant primer: fragment suatu
jaringan di kultur dan akan tumbuh keluar
sel-sel dari explant tersebut
 Kultur sel: sel diisolasi dari jaringan segar
atau dari hasil kultur explant primer dengan
cara mekanik atau enzimatik
Tipe
Kultur
Jaringan
Cell Line
 Cell line : Subkultur pertama dari kultur
primer.
 Dengan karakteristik:
 Fraksi pertumbuhan/ proliferasi tinggi
(>80%).
 Memiliki beberapa macam cell lineages
 Pertumbuhan terbatas (Finite) atau
tidak terbatas (continuous/immortal)
 Contoh Cell Line
 CL Finite ( jaringan Normal): IMR-90 :
Fibroblast; Lung; Human.
 CL Continuous (jar Normal):
CHO-K1: Fibroblast; Ovarium; Hamster.
Ha-Cat; Epithelial; Keratinocyt; Human.
 CL Continuous (jar Neoplastic):
MCF-7; Epithelial; Cairan Pleura dr pasien
kanker payudara.
K-562; Suspensi; Myeloid Leukemia; human
Keuntungan Kultur Sel
Kategori Keuntungan
Lingkungan physiko-kimia Kontrol pH, temperatur, osmolalitas,
gas

Kondisi physiologi Kontrol nutrien, suplemen, hormon, dll

Lingkungan mikro Regulasi matriks, interaksi antar sel,

difusi gas
Validitas Original, riwayat dan kemurniannya
dapat dicatat

Replikasi dan variabilitas Mudah diukur/kuantifikasi

Prinsip Dasar Pembuatan Kultur
 Peralatan
 Laminar Air Flow, Inkubator, Sentrifugasi
 Inverted microscope, pH meter, Autoclave
 Kondisi lingkungan
Lab, reduksi sumber kontaminasi, tekanan udara
positif
 Teknik aseptik / sterilitas
 Medium kultur dan suplemen
 Teknik isolasi dan kultur sel
Medium Kultur CL dan BHP lainnya

 Stock: DMEM-high glucose

 Komplit:

 DMEM stock

 10 % Fetal Bovine Serum (FBS)

 1 % Pen-Strep

 1% Amphotericine B

 PBS (Phosphate Buffer Saline)

 Trypsin-EDTA / Triple select

 TAHAPAN KULTUR CL DARI SIMPAN
BEKU
 Thawing (Pencairan) Sel : pd suhu 37° C, di
Inkubator atau Penangas air
 Suspensi sel dimasukan ke dalam tabung berisi
medium
 Pencucian sel dengan sentrifugasi 5 menit pada
1000 rpm
 Perhitungan jumlah sel dengan Neubauer
chamber
 Sel siap di kultur di TC flask atau Multi-well
dish, di Incubator 37 °C, CO2 5%
Observasi, Penggantian Medium dan
Subculture (Passage) Sel
 Observasi : pertumbuhan, morfologi,
ada/tidak kontaminan (dg Inverted
Microscope)
 Penggantian Medium Kultur : setiap 3 hari
 Subculture (Passage):
 Kultur confluen 70-80%.

 Tahapan Harvest (Pemanenan) Sel

 Split ratio : 1:2, 1:4, 1:8, 1:16

HARVEST (PANEN) SEL
 Kultur sel di cuci dengan PBS, 2x.
 Sel dipapar dengan Trypsin 0,05%-EDTA
0,02% atau Triple-select : 3 menit, 37 °C
 Observasi. Jk sel sudah terlepas dari dasar
tabung, ditambahkan medium komplit.
 Suspensi sel dipindahkan ke tabung steril,
disentrifugasi 5 menit, 1000 rpm.
 Di cuci dengan PBS, disentrifugasi 5 menit,
1000 rpm.
 Jumlah sel dihitung.
Subkultur Sel Endotel
 PERHITUNGAN JUMLAH SEL
 Penghitungan sel : 10 ul suspensi sel dengan
10 ul trypan blue dicampur lalu dihomogenkan
 10 ul campuran tersebut dimasukkan ke dalam
kamar hitung Improved Neubauer
 Sel-sel dihitung di bawah mikroskop.
Konsentrasi sel/ml dihitung pada lima lapang pandang
dengan rumus sbb:
(jumlah sel: jumlah lapangan pandang) x 2 x 104 /ml.
Viabilitas sel: (jmlh sel hidup : total jml sel) x 100%
FREEZING CELLS
 Medium cryo:
Medium complete:FBS:DMSO
5:4:1
 Pellet cells + 1- 2 ml medium cryo (homogenkan),
dimasukan ke Cryotube
 Pendinginan bertahap:
 -20 °C : 2 jam
 -80 °C : 2 jam – overnight
 Liquid N2
Hasil Kultur Sel MCF-7
Kendala pada Kultur CL dan
Penangannya
Kendala :
 Kontaminasi bakteri, yeast, atau fungi/jamur
 pH medium kultur diluar kisaran normal ( 7.2 -7.4 )
untuk pertumbuhan sel optimal
 Paparan Trypsin-EDTA yang tidak tepat (jumlah atau
waktu), sel-sel mati
Kendala pada Kultur CL dan
Penangannya
Penanganan :
 Sterilitas medium dan peralatan kultur di cek secara
rutin
 Operator harus menjaga sterilitas
 Kultur dengan kontaminasi parah harus di buang
 Secara teratur pH medium harus di cek
 Sesuaikan jumlah dan lamanya pemaparan trypsin-
EDTA dengan wadah kultur yang dipakai
 Components Molecular Weight Concentration (mg/L) mM

Amino Acids

Glycine 75.0 30.0 0.4

L-Arginine hydrochloride 211.0 84.0 0.39810428

L-Cystine 2HCl 313.0 63.0 0.20127796

L-Glutamine 146.0 584.0 4.0

L-Histidine hydrochloride-H2O 210.0 42.0 0.2

L-Isoleucine 131.0 105.0 0.8015267

L-Leucine 131.0 105.0 0.8015267

L-Lysine hydrochloride 183.0 146.0 0.7978142

L-Methionine 149.0 30.0 0.20134228

L-Phenylalanine 165.0 66.0 0.4

L-Serine 105.0 42.0 0.4

L-Threonine 119.0 95.0 0.79831934

L-Tryptophan 204.0 16.0 0.078431375

L-Tyrosine disodium salt dihydrate 261.0 104.0 0.39846742

L-Valine 117.0 94.0 0.8034188

Vitamins

Choline chloride 140.0 4.0 0.028571429

D-Calcium pantothenate 477.0 4.0 0.008385744

Folic Acid 441.0 4.0 0.009070295

Niacinamide 122.0 4.0 0.032786883

Komposisi Pyridoxine hydrochloride 206.0 4.0 0.019417476

DMEM-high Riboflavin

Thiamine hydrochloride
376.0

337.0
0.4

4.0
0.0010638298

0.011869436

glucose
i-Inositol 180.0 7.2 0.04

Inorganic Salts

Calcium Chloride (CaCl2) (anhyd.) 111.0 200.0 1.8018018

Ferric Nitrate (Fe(NO3)3"9H2O) 404.0 0.1 2.4752476E-4

Magnesium Sulfate (MgSO4) (anhyd.) 120.0 97.67 0.8139166

Potassium Chloride (KCl) 75.0 400.0 5.3333335

Sodium Bicarbonate (NaHCO3) 84.0 3700.0 44.04762

Sodium Chloride (NaCl) 58.0 6400.0 110.344826

Sodium Phosphate monobasic (NaH2PO4-

138.0 125.0 0.9057971
H2O)

Other Components

D-Glucose (Dextrose) 180.0 4500.0 25.0

Phenol Red 376.4 15.0 0.039851222