UJI EFEK ANTIDIABETES

 Dalam mengevaluasi obat antidiabetes, metode

mula-mula didasarkan pada penurunan kadar gula
darah pada hewan utuh (invivo) karena hewan utuh
secara teoritis memiliki semua mekanisme yang
terlibat dalam regulasi gula darah.

 Beberapa metode yang dapat digunakan untuk

maksud ini adalah pengujian penurunan kadar gula
darah baik pada hewan normal maupun hewan
diabetes (hewan yang diabetes secara
eksperimental)
 Hokfelt dan Jonsson dalam studi sejumlah besar
senyawa sulfonilurea, menggunakan metode
skrining kualitatif.
Metode ini memungkinkan untuk memilih senyawa-
senyawa yang paling aktif untuk penelitian
selanjutnya.
Hewan yang digunakan adalah kelinci normal dan
sebagai parameter adalah penurunan kadar gula
darah yang diamati selama 8 jam.
 Holland et al melakukan skrining obat yang
strukturnya berhubungan dengan klorpropamid
yang bekerja hipoglikemik. Skrining dilakukan
dengan menggunakan tikus jantan galur Wistar dan
parameter yang diamati adalah kadar gula darah.

 Pengujian aktivitas obat hipoglikemik pada hewan

diabetes dilakukan biasanya jika aktivitas telah
diamati sebelumnya pada hewan normal.
 Cara memperoleh hewan diabetes

1. Eksisi pankreas/pankreatektomi total : Diabetes

yang terjadi parah dan berlangsung pada
intensitas maksimum sampai hewan tsb mati
2. Eksisi pankreas sebagian
3. Induksi diabetes dgn menyuntikkan diabetogenik
seperti aloksan, streptozotosin, diaksosida,
adrenalin, glukagon, EDTA
4. Diabetes hipofisial : anjing atau kucing disuntik
dengan hormon pertumbuhan (GH)
5. Diabetes metahipofisial :
GH dosis tinggi selama beberapa minggu
6. Diabetes adrenokortikoid : pankreatektomi
subtotal + glukokortikoid injeksi
7. Diabetes spontan : terjadi pada anjing dan
hamster China
Hewan yang digunakan dan
rute pemberian
 Hewan yang dapat digunakan dalam uji aktivitas
antidiabetes in vivo diantaranya tikus, mencit, anjing, ayam,
kelinci, kucing, hamster, bebek, angsa, babi, ular, monyet
Rhesus, dan katak.

 Secara umum, uji efek antidiabetes invivo dapat dilakukan

pada tikus putih (galur Wistar, Sprague-Dawley, dll) atau
mencit dengan umur, jenis kelamin, bobot badan, makanan
yg sama serta breeding pada koloni yang sama.
 Rute pemberian zat uji dapat secara oral atau parenteral .
Metode uji
Metode yang dapat digunakan untuk menguji
aktivitas antidiabetes suatu bahan uji diantaranya :
1. Metode uji toleransi glukosa (in vivo)
2. Metode uji pada hewan diabetes diinduksi
diabetogen (in vivo)
3. Metode uji invitro : pengaruh terhadap sekresi
insulin dari pulau Langerhans
1. Metode uji toleransi glukosa
 Pada toleransi glukosa, hiperglikemia hanya berlangsung
beberapa jam setelah pemberian glukosa sebagai
diabetogen. Harus diperhatikan waktu dimana model
diabetes terjadi (pada rentang waktu berapa) untuk
pembandingan antara kelompok normal, kontrol dengan
kelompok uji.
 Penentuan kondisi hiperglikemia dapat dilakukan secara
kualitatif terhadap glukosa urin, sedangkan penentuan
kadar glukosa darah ditentukan secara kuantitatif dengan
kolorimetri atau spektrofotometri pada panjang gelombang
tertentu. Pereaksi kimia yang lazim digunakan adalah orto-
toluidin atau glukosa oksidase.
Prinsip metode
Kepada hewan yang telah dipuasakan selama lebih kurang
20-24 jam, diberikan larutan glukosa per oral setengah jam
sesudah pemberian sediaan obat yang diuji. Pada awal
percobaan sebelum pemberian obat, dilakukan
pengambilan cuplikan darah vena sebagai kadar glukosa
awal. Pengambilan cuplikan darah vena diulangi setelah
perlakuan pada waktu-waktu tertentu.

Prosedur
 Hewan dikelompokkan secara acak menjadi kelompok
normal, kelompok kontrol, kelompok uji, dan kelompok
pembanding, kemudian diberi tanda pengenal.
 Pada hari percobaan hewan ditimbang, lalu diukur
kadar gula darah awal pada t=0 sebelum pemberian
obat.
 Setiap kelompok diberi perlakuan yang sesuai, dimana
kelompok normal dan kontrol diberi pembawa,
kelompok uji diberi sediaan uji, dan pembanding diberi
obat antidiabetes oral pembanding.
 Sediaan obat diberikan dalam larutan/suspensi secara
per oral. Satu jam kemudian sediaan glukosa 50% dosis
1 g/kg bb diberikan per oral kepada semua kelompok
hewan kecuali kelompok normal,
 Segera lakukan pengambilan darah selesai pemberian
glukosa. Cuplikan darah ditampung dalam tabung
sentrifus mikro dan disentrifuga 5 menit dengan
kecepatan 3000-6000 rpm dan supernatan diambil
untuk penentuan kadar glukosa lebih lanjut
 Pengukuran kadar gula darah dilakukan pada menit ke-
90, 120, 150, 180.
Parameter
 Parameter yang diamati adalah kadar gula darah
hewan pada waktu-waktu tertentu
Evaluasi hasil
 Penurunan kadar glukosa darah pada kelompok uji
diketahui dengan membandingkan hasil yang diperoleh
dgn hasil dari kelompok kontrol, kemudian data dianalisis
secara statistik dengan analisis variansi atau uji t.
 Dapat dibuat kurva dosis respons kadar gula darah
sebagai fungsi dosis dan waktu penentuan kadar gula
darah
 Dihitung pula persentase penurunan kadar gula pada
tiap waktu pengamatan
2. Metode uji pada hewan yang
diinduksi diabetogen
 Pada uji hewan diabetes yang diinduksi
diabetogen harus diperhatikan bahwa kadar gula
awal setelah diinduksi diabetes harus diupayakan
tidak terlalu berbeda jauh (deviasi harus rendah)
sehingga pengamatan selanjutnya deviasi di
dalam kelompok juga rendah.
 Sensitivitas hewan uji thd induksi oleh diabetogen
berbeda-beda shg ada yg harus dilakukan
pengulangan induksi
 Induksi harus menghasilkan kondisi DM tipe II
Prinsip metode
Induksi diabetes dilakukan terhadap hewan uji dengan
diabetogen seperti aloksan dll dimana perkembangan
hiperglikemia diperiksa setiap hari. Pemberian obat
antidiabetik secara oral terhadap hewan uji diabetes
dapat menurunkan kadar glukosa darah hewan uji
tersebut dibandingkan kontrol.

Prosedur
 Hewan diinduksi diabetes dengan diabetogen dosis
tertentu (misal aloksan dosis 70 mg/kg bb).
 Hewan diabetes dikelompokkan secara acak menjadi
kelompok kontrol, kelompok uji, dan kelompok
pembanding, kemudian diberi tanda pengenal.
 Pada hari percobaan hewan dipuasakan 16 jam
ditimbang , lalu diukur kadar gula darah awal pada
t=0 sebelum pemberian obat.
 Setiap kelompok diberi perlakuan yang sesuai, dimana
kelompok kontrol diberi pembawa, kelompok uji diberi
sediaan uji, dan pembanding diberi obat antidiabetes
oral pembanding. Sediaan obat diberikan dalam
larutan/suspensi.
 Semua kelompok hewan diberi sediaan uji dan
pembanding kecuali kel. kontrol hanya diberi
pembawa selama waktu pengujian (14-28 hari)
 Dua jam setelah pemberian obat diukur kadar gula
darah hewan, lalu hewan diistirahatkan dan diberi
makan minum ad libitum.
 Pada hari ke-7, 14, dan 21 atau 28 diulangi
pengukuran kadar gula darah pada hewan uji yang
telah dipuasakan terlebih dulu
Parameter
Parameter yang diamati adalah kadar gula darah hewan

Evaluasi
 Penurunan kadar glukosa darah kelompok uji diketahui
dengan membandingkan thd kel. kontrol positif,
kemudian data dianalisis scr statistik dngn analisis
variansi atau uji t.
 Dapat dibuat kurva dosis respons kadar gula darah
sebagai fungsi dosis dan waktu penentuan kadar gula
darah serta persentase penurunan kadar gulanya
3. Metode uji invitro : pengaruh thd sekresi
insulin dari pulau Langerhans terisolasi
 Untuk mengurangi faktor-faktor yang dapat
mempengaruhi efek suatu obat (kemampuan
terabsorpsi, ikatan protein, distribusi,
biotransformasi, obat) maka dilakukan pengujian
dengan menggunakan organ terisolasi.
 Pengujian ini terutama penting dalam mencari
hubungan struktur kimia dengan kerja
farmakologi suatu obat karena semakin banyak
faktor yang mempengaruhi kerja obat, semakin sulit
untuk menyatakan hubungan struktur dengan
aktivitas.
 Untuk pengujian in vitro mula-mula telah digunakan segmen
pankreas kelinci, tikus dan sapi. Tetapi karena banyak kesulitan
yang diperoleh dengan penggunaan segmen pankreas maka
diusahakan untuk mengisolasi pulau-pulau Langerhans.
 Pulau-pulau yang diisolasi antara lain telah digunakan untuk
mempelajari aktivitas enzimatik dan pemakaian oksigen dari
pulau Langerhans serta studi metabolik lain secara in vitro.
 Untuk mempelajari efek langsung senyawa tertentu terhadap
sekresi insulin telah digunakan segmen utuh pankreas kelinci
oleh Coore (1964), pankreas tikus oleh Mallory et al (1964),
dan pankreas sapi oleh Taylor et al (1964).
Keterbatasan
Kesulitan utama dalam menggunakan preparat ini adalah :
 Pulau Langerhans hanya menyusun beberapa % dari volume
total pankreas mamalia
 Enzim-enzim proteolitik dibebaskan dari bagian eksokrin
pankreas dan mengakibatkan kerusakan insulin yang
bervariasi selama periode inkubasi
 Perubahan-perubahan enzimatik dan metabolik langsung
dalam pulau tak dapat ditentukan
 Pulau Langerhans yang digunakan selain mengandung sel
beta (terbanyak) juga mengandung sel lain seperti sel alfa,
sel delta, sel PP yang dapat mempengaruhi sekresi insulin
 Pengembangan metode invitro
 Menambahkan insulin serum pada medium untuk mengikat
dan melindungi insulin terhadap kerja enzim proteolitik
yang dibebaskan dari pankreas eksokrin, shg insulin
terlindungi dan bagian utama dari preparat tetap terdiri
dari jaringan asinar yang aktif secara metabolik.
 Penggunaan toadfish dan goosefish (letak pulau-pulaunya
dalam tubuh terpisah dari pankreas eksokrin)
menghilangkan gangguan sel-sel asinar tapi ini berarti
menggunakan jaringan hewan yang bukan mamalia
 P.E. Lacy dan M.Kostianovsky (1967) mengembangkan
metode sedimentasi sederhana untuk mengisolasi pulau
Langerhans utuh dari pankreas mamalia.
 Prinsip metode
a. Prinsip Metode
Melihat pengaruh zat uji terhadap sekresi insulin pulau
Langerhans dibandingkan dengan kontrol
b. Prinsip Teknik Isolasi
o Perusakan parenkhim asinar dengan menyuntikkan larutan Hanks
(larutan garam berdapar) ke dalam sistem duktus pankreatik
kemudian inkubasi pankreas dalam enzim kolagenase
o Pemisahan pulau-pulau dari campuran tersebut dengan cara
sedimentasi
o Pulau-pulau dipilih dengan menggunakan stereomikroskop
c. Prinsip Penentuan Kadar Insulin
 Prinsip penentuan insulin dengan metode RIA
(RadioImmunoAssay).
 Insulin dicampurkan dengan insulin bertanda dan antibodi
insulin. Antibodi yang digunakan harus mempunyai afinitas
yang sama terhadap insulin bertanda atau tidak yang
terdapat dalam medium (sampel).
 Insulin tak bertanda bersaing dengan insulin bertanda
terhadap sejumlah terbatas tempat ikatan antibodi yang
tersedia. Dengan demikian jumlah insulin bertanda yang
terikat pada antibodi akan berkurang. Karena itu kadar
radioaktif yang terikat berbanding terbalik degan
konsentrasi insulin dalam sampel atau standar.
 Setelah periode inkubasi yang cukup, fraksi yang
terikat dan fraksi bebas dipisahkan dan
radioaktivitas diukur dengan menggunakan
scintillation counter.

Parameter
 Kadar insulin dalam medium
Prosedur
Pengujian pengaruh suatu senyawa terhadap
sekresi insulin dari pulau Langerhans terisolasi
meliputi :
a. Isolasi pulau Langerhans dari pankreas hewan
b. Inkubasi awal
c. Inkubasi utama
d. Penentuan jumlah insulin yang dibebaskan ke
medium dengan metode RIA
e. Penentuan kadar
a. Isolasi pulau Langerhans dari pankreas hewan
 Mula-mula tikus dibius dengan eter kemudian 10 ml
larutan Hanks disuntikkan ke dalam pankreas melalui
duktus pankreas.
 Organ pankreas dipisahkan dari limpa, usus, lambung
dan hati dan dimasukkan ke dalam cawan petri yang
berisi larutan Hanks dan dibersihkan dari jaringan
lemak disekitarnya yang masih terbawa.
 Pankreas yang sudah diperoleh dengan cara diatas
dipotong halus dan merata dan dimasukkan dengan
menggunakan alat suntik 10 ml ke dalam gelas ukur
25 ml dingin.
 Potongan pankreas dibersihkan dari darah dan lemak
dengan menggunakan larutan Hanks dingin, larutan
Hanks yang ada diatas potongan pankreas dibuang dan
sisa cairan disedot dengan menggunakan jarum suntik.
 Ke dalam gelas ukur yang berisi potongan pankreas
yang telah bersih dimasukkan enzim kolagenase (650
uU/g bobot basah pankreas) lalu gelas ukur dimasukkan
ke dalam penangas air 37C, diaduk dengan stirrer
selama 2 menit dengan kecepatan 1100 rpm dan dengan
kecepatan rendah selama 12 menit hingga diperoleh
pencernaan jaringan eksokrin.
 Isi gelas ukur dimasukkan ke dalam cawan petri dan
diperkecil ukurannya dengan memasukkan dan
mengeluarkan jaringan tsb kedalam alat suntik 10 ml
beberapa kali. Jaringan ini dimasukkan ke dalam gelas ukur
yang berisi 20 ml larutan Hanks dingin, dan dipisahkan
jaringan eksokrin pankreas dengan membuang larutan
Hanks yang ada diatas jaringan yang mengendap.
 Seleksi pulau Langerhans dengan menggunakan
stereomikroskop dan pipet Petersen. Semua pengerjaan
kecuali proses pencernaan dilakukan dalam penangas es
0 C.
 Inkubasi pulau Langerhans terisolasi dalam medium yang
mengandung glukosa dan senyawa yang diuji pada
kondisi tertentu
b. Inkubasi awal
 Untuk regenerasi proses metabolisme pulau Langerhans
setelah proses isolasi maka dilakukan inkubasi awal
dengan 2 ml larutan KRB yang terdiri dari 2% albumin
serum sapi + sejumlah glukosa dalam tabung reaksi yang
dialiri gas karbogen.Inkubasi pada 37C dan frekuensi
pengocokan 40 gerakan/menit selama 30 menit.
 Setelah diinkubasi, pulau Langerhans dibersihkan dari
insulin dengan menggunakan larutan Hanks dingin.
c. Inkubasi utama
 Inkubasi utama meliputi 2 tahap inkubasi yaitu
tahap pertama selama 30 menit dengan medium
mengandung glukosa kadar 2,8 atau 11,1 mM
sedangkan tahap kedua yaitu inkubasi dengan
medium yang mengandung senyawa yang diuji.
 Jumlah pulau Langerhans yang digunakan untuk
tiap tabung adalah 5 pulau. Kondisi inkubasi
sama dengan inkubasi awal hanya frekuensi
pengocokan 100 gerakan/menit.
 Sampel diambil sebanyak 100 ul pada waktu-waktu
tertentu, simpan dalam penangas es kemudian freezer -15
C sampai dilakukan penentuan insulin dengan metode RIA

d. Penentuan jumlah insulin yang dibebaskan ke medium

dengan metode RIA
 Penyiapan larutan standar
 Larutan standar insulin dibuat dengan menggunakan larutan
dapar dan besarnya konsentrasi disesuaikan dengan kadar
insulin yang diperkirakan terdapat dalam medium uji, yaitu
antara 25-400 uU/ml
e. Penentuan kadar
 Penyiapan kurva standar dan larutan sampel harus
dilakukan secara simultan. Untuk penentuan kadar ini
diperlukan pemipetan yang hati-hati dan teliti. Penentuan
kadar dilakukan minimalnya duplo.
 Isi tabung dicampur dan diinkubasi dalam lemari es pada
suhu 2-8C selama 6 jam.
 Masukkan ke dalam semua tabung 0,1 ml insulin bertanda.
Kocok isi tabung dan inkubasi dalam lemari es pada suhu 2-
8 C selama 18 jam.
 Pipet 1 ml larutan dapar fosfat ke dalam semua tabung
(kecuali untuk aktivitas lokal).
 Sentrifuga semua tabung pada suhu 4 C 4000 rpm selama 18
menit.
 Dekantasi dengan hati-hati semua tabung, hindarkan pengocokan
tabung selama dekantasi. Tetesan supernatan yang masih
tertinggal pada leher tabung dihilangkan dengan pompa vakum.
 Ukur radioaktivitas semua tabung dengan alat scintillation counter.

Evaluasi hasil
 Kadar insulin yang terdapat dalam medium yang mengandung
senyawa uji dibandingkan dengan kadar insulin dalam medium
kontrol.
 Selanjutnya hasil dianalisis secara statistik
Kelebihan/manfaat
Pulau Langerhans yang diisolasi dengan cara ini dapat
digunakan :
 menapis senyawa yang diduga berkhasiat antidiabetes
dengan mengamati pengaruhnya terhadap sekresi
insulin
 mempelajari efek langsung senyawa tertentu terhadap
sekresi insulin
 mempelajari mekanisme sekresi insulin yang diinduksi
senyawa tertentu dengan mengamati pengaruhnya
terhadap siklik-AMP, aliran ion kalsium, kalium dan
status redoks pulau
4. Metode evaluasi mekanisme kerja obat
yang memiliki efek antidiabetes
Untuk mengevaluasi mekanisme kerja obat/senyawa yang
mempunyai efek antidiabetes dapat dilakukan hal-hal
sebagai berikut :
1. Antagonisme terhadap faktor-faktor hiperglikemik
2. Lokalisasi tempat kerja umum
3. Kerja pada hati
4. Naiknya oksidasi glukosa
5. Naiknya transpor glukosa
6. Kerja pada enzim intrasel