Program Studi SI Farmasi

STIKES Rumah Sakit Anwar Medika

ANALISIS SENYAWA AKTIF DALAM
SEDIAAN LIKUIDA MENGGUNAKAN
KROMATOGRAFI CAIR KINERJA
TINGGI (KCKT)

Eviomitta Rizki Amanda, S.Si., M.Sc.

 SEDIAAN FARMASI BENTUK
LIKUIDA
■ SIRUP
■ ELIKSIR
■ INJEKSI
■ TETES
■ INFUS
BENTUK dan PEMAKAIAN
■ Bentuk ■ Pemakaian
■ Larutan ■ Peroral
■ Suspensi ■ Tetes mata
■ Emulsi ■ Tetes telinga
■ Parentral
■ Topikal
 ANALISIS BAHAN AKTIF
DALAM SEDIAAN LIQUID DENGAN KCKT
■ SEDIAAN LIKUID ■ KCKT
 KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI/
HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY

• PERANAN DAN KEUNGGULAN

1 • PRINSIP PEMISAHAN

• KROMATOGRAM DAN RESOLUSI

2 • INSTRUMENTASI
• APLIKASI : ANALISIS KUALITATIF
• APLIKASI : ANALISIS
3 KUANTITATIF
PERANAN KCKT

Tidak kurang dari 145 bahan

baku dan/atau sediaan
farmasi yang menggunakan
KCKT untuk identifikasi
dan penetapan kadar
 KEUNGGULAN KCKT

■ Penggunaannya luas

■ Sesitivitas dan selektifitas baik

■ Akurasi dan presisi baik

■ Dapat untuk analisis senyawa non volatile

■ Dapat untuk analisis senyawa termolabile

 MEKANISME PEMISAHAN KCKT

• FENOMENA INTERAKSI
ADSORBS ANALIT DENGAN
I PERMUKAAN PARTIKEL
PADAT FASE DIAM (S)

• PERBEDAAN KELARUTAN
ANALIT DALAM DUA
PARTISI MACAM FASE CAIR YANG
TAK SALING CAMPUR
(IMISCIBLE) DALAM FASE
DIAM (S)
MEKANISME PEMISAHAN KCKT

• FENOMENA PERTUKARAN
ION ANTAR ANALIT DAN
ION FASE DIAM /RESIN
EXCHANGE PENUKAR ION : ANION
ATAU KATION

PERMEA • PERBEDAAN UKURAN

MOLEKUL/ BERAT MOLEKUL
SI ANTAR ANALIT
 KOMPARASI
HPLC GC
■ Suhu kamar, dapat ■ Suhu tinggi, tidak
untuk analit yang dapat untuk analit
termolabile yang termolabile,
■ Fase gerak dapat ■ Fase gerak terbatas,
bervariasi, sehingga pemakaian terbatas,
melalui optimasi tetapi relatif sangat
pemakaian sangat luas murah
tapi relatif mahal
 PRINSIP PEMISAHAN KCKT
UPIN DAN IPIN NONTON PAMERAN LUKISAN

S S S S S S S S

S S S S S S S
S

Tidak suka lukisan, maka keluar duluan

(Cs <, Kd<, tR <)

Kd = Cs/Cm Suka lukisan maka keluar belakangan.

(Cs>, Kd >, tR >)
 Besaran Kromatogram
Waktu retensi (tr)

tY
Respons
Detektor Luas Puncak/Peak Area (A)
tX

Tinggi puncak/peak height (h)

tM

Waktu
Lebar puncak/peak width (w)
Kemungkinan Rs
EFESINSI SELEKTIFI KAPASITAS
TAS
A KURAN KURANG KURANG
A G

B BAIK KURANG CUKUP

B
C KURAN BAIK CUKUP
G
C
D BAIK BAIK BAIK
D
INSTRUMENT KCKT
SKEMA INSTRUMENT KCKT
KOMPONEN UTAMA KCKT

POMP
A

DETEK
TOR INJEK TOR

KOM
PONEN

KOLO ELUEN
M
 POMPA

■ Mengalirkan eluen kedalam injektor, kolom dan detektor dengan

tekanan tinggi
■ Dapat diprogram untuk mengatur kecepatan dan komposisinya
(isokratik atau gradient).
■ Terbuat dari bahan yang inert, tidak korosif dan reaktif terhadap eluen
atau analit
 INJEKTOR

■ Aliran henti : waktu menyuntikkan sampel fase gerak

dihentikan dulu, sehingga pada kondisi tekanan atmosfer
■ Menggunakan septum, waktu penyuntikan sampel fase
gerak tetap berjalan pada tekanan 60-70 atmosfer
MEKANISME : POMPA-INJEKTOR-KOLOM
KOLOM REVERSE-PHASE (RP)
■ ADA KOLOM ANALISIS DAN KOLOM PREPARATIF,
■ KOLOM ANALISIS : DIAMETER=2-6mm, PANJANG 10-30 cm,
DIGUNAKAN UNTUK ANALISIS KUALITATIF DAN
KUANTITATIF
■ KOLOM PREPARATIF : DIAMETER 6mm, PANJANG 25-100 cm,
DIGUNAKAN UNTUK ISOLASI BAHAN AKTIF ATAU
PEMISAHAN ANALIT DALAM CAMPURAN
■ ADA NORMAL PHASE (NP) DAN REVERSE PHASE (RP)
JENIS KOLOM RP

NAMA JUMLAH TYPE DAN UKURAN

C
HIPERSIL/SAS C-1 NP-SPHERICAL
SPHERISORB/S5P PHENYL NP-SPERICAL
LICHROSORB/RP-18 C-18 NP-SPHERICAL
NOVA-PAK/C-18 C-18 NP-SPHERICAL
NUCLEOSIL/C-18 C-18 NP-SPHERICAL
PARTISIL/10-SAX SULFONA IRREGULAR
T
LICHROSORB-CN/RP- CH3-CN IRREGULAR
CN
KOMPARASI
KARAKTERISTIK FASE NORMAL (NP) FASE BALIK (RP)
Polaritas fase solid Tinggi Rendah
Polaritas fase mobile Rendah-medium Medium tinggi
Urutan elusi Makin non polar lebih Makin polar lebih
dulu dulu

Tipe fase mobile Heptane/CHCl3 Metanol/air

Retensi makin tinggi Polaritas fase mobile Polaritas fase mobile
jika makin kecil makin tinggi
Hubungan Polaritas - tr

2 3
1

4 5
Hubungan Polaritas Analit - tr
Urutkan waktu retensi (tr)....?

1 2

4
3
Urutkan waktu retensi (tr)....?

1 3
2

5 6
4
Urutkan waktu retensi (tr)....?

2
1 3

5 6
4
ELUEN/FASE GERAK

Syarat :
■ Murni,
■ Inert ( tidak merusak kolom dan analit),
■ Sesuai detektor yang dipakai
■ Melarutkan seluruh analit,
■ Viskositas rendah,
■ Memungkinkan mengisolasi kembali analit
■ Relatif murah
MACAM DETEKTOR

■ UV-detector
■ Flourescense-detector
■ Electrochemical-detector
■ Refractive-detector
■ Multipurpose-detector
■ Ftir-detector
■ Mass-spectra-detector
SYARAT DETEKTOR

■ Sensitif
■ Linier
■ Universal
■ Respon dapat diprediksi
■ Stabil, tidak terpengaruh oleh perubahan kondisi
■ Non-destruktif
■ Murah/biaya opersaional rendah
TAHAPAN ANALISIS KCKT

PREPARASI SAMPEL
ISOLASI CLEAN UP

PENYIAPAN KONSISI KCKT

FASE
KOLOM DETEKTOR
GERAK/ELUEN

LARUTAN BAKU
BAKU EKSTERNAL BAKU INTERNAL
 Kondisi KCKT
■ Mengacu pada:
- Farmakope
- literatur (journal, buku, dsb)
- hasil penelitian yang pernah dilakukan
■ Apabila belum ada harus menentukan sendiri
dengan melakukan studi optmasi
■ Optimasi : pemilihan kolom dan fase gerak
(Segitiga Snyder atau Window Diagram)
Prinsip Pemilihan Kolom

Eluen non
polar
Fase normal
Analit polar
Kolom
Eluen polar
Fase balik
Analit non
polar
 Contoh : Analit polar
■ Campuran kalium sulfoguayakolat, dekstrometorfan-HCl,
difenhidramin-HCl
■ Ditambahkan ion-pair : dietilamine atau heksan sulfonat
■ Polaritas akan menurun mendekati non-polar, sehingga
dapat digunakan kolom fase balik
■ Kolom fase balik (non-polar) : lichrosorb CN
■ Fase gerak/eluen: Metanol-dietilamine pH 5 atau metanol-
heksan sulfonat pH 5.
 Ion –Pair : Adrenalin injeksi

ADRENALI
N

SOSA (sodium
octanesulfonic acid

KOLO
M ODS
Ion-Pair : Ascorbic Acid
Injection/Syrup

ASCORBIC
ACID

CETRIMID (AMONIUM
KUARTERNER)

KOLOM
ODS
 2. Pemilihan detektor

■ Dasar : struktur komponen dari analit

■ Ditentukan detektor spektrofotometer, maka:

- Tentukan ‫ ג‬analisis, dimana a(serapan) masing2

komponen analit cukup besar

- Tentukan dulu ‫ ג‬maksimum masing2 komponen

 Derivatisasi
■ Meningkatkan respon detektor
■ Meningkatkan Rs dan α
■ Meningkatkan efektivitas proses ekstraksi dan
clean up analit
■ Membedakan respon detektor relatif antara dua
analit yang berbeda
■ Dapat dilakukan pra-kolom dan pasca-kolom
 Derivator pra-kolom
Derivator Gugus fungsi analit
Bromofenasil Asam karboksilat
Benzoill khlorida Alkohol
Nitrobenzioil khlorida Amina
Dinitrofenilhidrazin Aldehid / keton
Dansil khlorida Peptida
Piridoksal Asam amino / amina
 Derivator pasca-kolom
Derivator Gugus fungsi analit
O-nitrofenol Asam karboksilat
Ninhidrin Amina
Difenil hidrazin Aldehid / keton
Floresamina Peptida

Floresamina Asam amino / amina

Derivatisasi Neomycin (tetes mata)

NEOMYCIN (TIDAK
ADA GUGUS
CHROMOPHOR)

FLURODINITROBEN
ZEN (DIBERI GUGUS
KROMOFOR (R)

DERIVAT
NEOMYCIN
DENGAN GUGUS
KHROMOFOR
SEKALIGUS
MENURUNKAN
POLARITAS
ANALISIS KUANTITATIF
MENGGUNAKAN HPLC
 Aplikasi : Analisa Kuantitatif

■ Prinsip : Tinggi/luas puncak kromatogram berbanding

linier dengan konsentrasi solut/sampel
■ Ada 3 (tiga) macam:
 Metode standar eksternal,
 Metode standar internal,
 Metode standar adisi (Spike)
 Metode Standar Eksternal

Multilevel / Multipoint Calibration

■ Buat kurva kalibrasi zat standar antara area puncak vs
konsentrasi satu seri larutan standar (5-6) macam kadar
yang mendekati kadar sampel,
Diuji linieritas, r>0,999
 Kadar dihitung berdasarkan persamaan regresi linier y=bx
+ a (y=peak area, x=konsentrasi analit, b=respon factor,
a=konstanta/respon noise)
Persamaan dan garis regresi

PA y = bx + a

Konsentrasi analit

Pada KCKT ada yang dilengkapi dengan komputer yang dapat

langsung menghitung kadar zat dalam sampel
 Metode Standar Eksternal

Single point calibration/standart/Metode Perbandingan

Konsentrasi
■ Dibuat satu macam kadar standar yang mendekati kadar analit dalam
sampel (Cst)
■ Larutan standar dan larutan sampel diinjeksikan dengan volume
penyuntikan dan kondisi KCKT yang sama
■ Dari data peak area analit dalam sampel (Pax) dan analit standar
(PAst) dapat dihitung kadar analit dalam sampel (Cx) dengan rumus
:
■ Cx=(PA x:PA st)xCst
 Tiap satu sendok pakai (5ml) eliksir
mengandung 30 mg
pseudoephedrine, 1,25mg tripolidine
hidrochloride, 10mg
dextrometorphan hidrobromide

Mengandung Pemanis non gula,

Pewarna dan Pengawet, sehingga
tidak kental (dapat dipipet)

Setiap komponen mempunyai ƌ maksimum dan kadar

yang berbeda, maka jika digunakan detektor UV harus
dipilih ƌ yang tepat (memberikan serapan cukup tinggi)
maka sebaiknya menggunakan DAD
 Dipipet tepat 5,0 ml sirupsampel kedalam corong
pisah, tambahkan 1ml amonia 10 M (suasana basa)
disari 2x dengan masing-masing 10ml khloroform.
Lapisan khloroform dikumpulkan dan diuapkan di
evaporator samapai kering. Residu dilarutkan
dengan 10ml methanol dan dipindahkan ke labu
ukur 100ml kemudian encerkan dengan fase diam
yang digunakan sampai garis tanda.

Dibuat baku yang mengandung pseudoephedrine, tripolidine

hidrochloride, dan dextrometorphan hidrobromide dengan
perbandingan dan kadar yang setara dengan yang ada dalam
sampel
Kolom yang digunakan adalah kolom
ODS 25cmx4,6mm, dengan fase gerak
asetonitril/buferfosfat 0,05M pH 6,8
(35:65), 1ml/menit, detektor DAD pada
260nm)

Sampel dan standar disuntikkan ke KCKT

dengan volume penyuntikan dan kondisi
yang sama, kemudia kromatogram yang
dihasilkan direkam data-datanya.
Berdasarkan data yang diperoleh
dilakukan penghitungan kadar analit
dalam sampel menggunakan data larutan
standar
Kromatogram
Data kadar dan peak area
 Perhitungan kadar : single point

■ Kadar pseudoefedrine (Cp)

Cp=(318.915:325.178)x31,23=30,63mg/100ml
■ Residu dari 5ml eliksir sampel diencerkan sampai
100ml
■ Setiap 5ml sampel eliksir mengandung 30mg
pseudoefedrine, maka % recovery =
(30,63:30)x100%=102,10%
Hitung kadar komponen yang lain!!!.....
2. Metode Standar Internal

■ Keuntungan : mengurangi kesalahan-kesalahan pada

ekstraksi, penyuntikan secara manual,
■ Cara:
- Zat standar dan sampel ditambahkan sejumlah tertentu
standar internal
- buat kurva kalibrasi antara rasio area/tinggi puncak zat
standar terhadap area/tinggi puncak standar internal vs
konsentrasi
Syarat standar internal
■ Mempunyai sifat fisika dan kimia sama atau
hampir sama dengan zat yang akan
ditentukan
■ Mempunyai respon faktor hampir sama
dengan analit yang akan ditentukan,
■ Harga Rs cukup baik > 1,5
■ Zat tersebut tidak boleh ada di dalam sampel
■ Zat tersebut harus murni dan stabil dalam
penyimpanan.
 Metode Standar Internal..1

Multilevel / Multipoint Calibration

a. Membuat kurva baku
■ Buat satu seri (5-6) konsentrasi standar analit bervariasi
kemudian ditambah dengan standar internal pada
konsentrasi yang tetap.
■ Dibuat kurva kalibrasi melalui persamaan regresi y=bx+a,
dimana y=rasio PAzat standar/PA zat internal standar,
x=kadar zat standar.
Diuji linieritas, r>0,999
Persamaan dan garis regresi

PAst
y = bx + a
PAst.i
Kons. Stand.
 Metode Standar Internal..1 (cont.)

b. Membuat larutan sampel (Analisis Sampel)

■ Larutan sampel ditambah dengan larutan
internal standar, kemudian disuntikkan ke
KCKT dengan volume dan kondisi yang sama
dengan standar dan akan diperoleh data PA
standar dan PA internal standar
■ Kadar analit dalam sampel (Cx) dihitung
berdasarkan persamaan regresi yang didapat,
dimana y=PAst/PAist dan x=Cx.
Contoh aplikasi : Miconazole tetes telinga

Penetapan kadar miconazole dengan standar

internal econazole
Data konsentrasi standar dan PA

1. Hitunglah persamaan regresi dan harga r

2. Hitunglah konsetrasi miconazole dalam larutan sampel , jika
diketahui PA miconazole=119.923, dan PA econazole = 124.118
 Metode Standar Internal..2

Single-level / One-point Calibration

a. Membuat larutan standar
■ Buat satu konsentrasi standar analit (Cst) yang mendekati
kadar analit dalam sampel kemudian ditambah dengan
satu macam konsentrasi standar internal.
■ Larutan campuran tersebut disuntikkan ke dalam KCKT
dengan kolom, fase gerak dan pada kondisi tertentu akan
menghasilkan data PA standar dan PA internal standar.
 Metode Standar Internal..2
b. Membuat larutan sampel
■ Larutan sampel hasil isolasi dari sediaan
ditambah dengan larutan internal standar,
kemudian disuntikkan ke KCKT dengan volume
dan kondisi yang sama dengan standar dan akan
diperoleh data PA standar dan PA internal
standar
■ Kadar analit dalam larutan sampel (Cx) dihitung
berdasarkan rumus:
 Contoh : Penetapan Kadar
Hidrokortison
■ Penetapan kadar hidrokortison dengan standar internal betamethazon
■ Data kromatogram adalah sebagai berikut :

Analit Kadar (ppm) Peak Area Peak Area

Hidrokortison 10 ppm 345.210 -
Betametason 5 ppm - 245.055
Campuran ?? 380.545 288.905

Hitunglah kadar hidrokortison dalam larutan sampel

Kromatogram

Standar +
internal standar
Sampel +
internal standar
3. Metode Standar Adisi/Spike

■ Digunakan pada analisis kadar sampel

yang relatif kecil
■ Misal : - Kadar obat/metabolitnya dalam
cairan biologis
- Analisis runut (trace analysis)
-Analisa Residu

Luas area sampel (Px) = Luas area saampel spike – luas area std.
Konsentrasi sampel spike (Cx)= Px/Pstd * Cstd
Lanjutan..
■ Cara :
- Sampel ditambahkan zat yang sama (standar)
dengan zat yang akan ditentukan
- Buat minimal 4 konsentrasi yang berbeda
sehingga didapat kurva linier hubungan antara
kadar zat yang akan ditambahakan dan area/tinggi
puncak kromatogram
Lanjutan..

Luas area/tinggi
puncak
y = ax + b

c2
c4
c1
c3

Kadar penambahan zat

Lanjutan..
Luas area/tinggi puncak

x=0 y=b y = ax + b

(Tanpa ada
penambahan)
c2
c4
c1
c3

Kadar penambahan zat

0
b
y=0 x= -
a
(Kadar sampel)
■ Ekstrapolasi kekiri Area/tinggi puncak
memotong sumbu y didapat
harga b (area/tingi puncak
tanpa penambahan zat). b
Y = aX
■ Jadi b=area/tinggi sampel
■ Harga -b/a adalah kadar
terukur dari sampel
0 b/a