ANALISIS

MIKROBILOGI PADA Apt. Galih Satrio Putra, M.Farm

SEDIAAN FARMASI
LATAR BELAKANG
Mengapa perlu dilakukan uji mikrobilogi pada
sediaan farmasi?
Karena perna terdapat kasus tidak strerilnya
sediaan tetes mata menyebabkan kebutaan mata
permanen pada pasien
LATAR BELAKANG
1970 – 1971 : 40 kematian akibat infus tidak steril yang
terkontaminasi dengan : Enterobacter cloacae dan Enterobacter
agglomerans

1971-1972 : 5 kematian akibat infus tidak steril yang

terkontaminasi Klebsiella aeroginosa

1964 : kebutaan pasien setelah operasi mata : Pseudomonas

aeroginosa
 SEDIAAN FARMASI
Secara garis besar :
A. Produk nonsteril (tablet, kapsul, sirup dll)
terdapat batasan cemaran mikroba
B. Produk steril (tetes mata, segala jenis injeksi baik
IV, IM dll)  harus steril dari mikroba
BATAS KADAR MIKRO ORGANISME DALAM
SEDIAAN ( USP ) /FIV

1. Parenteral : 0
2. Obat Mata : 0
3. Obat untuk Luka Terbuka atau untuk irigasi : 0

4. Sediaan Lokal : <102 cfu/g atau cfu/ml

( Staph.Aureus & Pseudo.aeruginosa = 0 )
5. Sediaan Oral : < 102 cfu/g atau cfu/ml
( E. Coli dan Salmonell sp=0 )
 UJI CEMARAN MIKROBA PADA
PRODUK NON STERIL

A. Penetapan Angka Kapang dan Khamir (AKK) 

Jamur
B. Uji Angka Lempeng Total (ALT)  bakteria
C. PENGUJIAN MIKROBA SPESIFIK

 ANALISIS MIKROBIOLOGI

GASAL 2012-2013 6
DALAM FI V UJI MIKROBILOGI
JUGA TELAH TERCANTUKAM
DENGAN JELAS
 PENYIAPAN SAMPEL
Sediaan Larut Air Larutkan atau encerkan sediaan yang akan diuji (biasanya 1 dalam 10) pada
media Soybean-Casein Digest Broth bila perlu atur pH hingga 6 - 8.
Sediaan Bukan Lemak yang Tidak Larut dalam Air Suspensikan atau encerkan sediaan yang
akan diuji (biasanya 1 dalam 10) pada media Soybean-Casein Digest Broth bila perlu atur pH
hingga 6 – 8. Dapat ditambahkan surfaktan seperti Polisorbat 80 1 g per L untuk membantu
mensuspensikan bahan yang sulit dibasahi
Sediaan Berlemak Larutkan atau encerkan sediaan yang akan diuji dalam isopropil miristat
steril yang disterilkan dengan cara penyaringan atau campurkan sediaan yang akan diuji
dengan sesedikit mungkin surfaktan Polisorbat 80 steril atau surfaktan noninhibitor lain steril,
PENENTUAN AKK PADA
SEDIAAN FARMASI
Jumlah Sediaan yang Digunakan untuk Pengujian
Jika tidak dinyatakan lain gunakan 10 g atau 10 ml sediaan uji
bahan aktif dengan jumlah sampel terbatas atau ukuran bets sangat kecil (misalnya kurang dari 1000 ml
atau 1000 g) jumlah sampel yang diuji harus 1% dari bets
Untuk sediaan dengan total keseluruhan bets kurang dari 200 unit ukuran sampel dapat dikurangi menjadi
dua unit atau satu unit jika kurang dari 100 unit.
Media
 Sampel dipindahkan pada media Sabouraud Dextrose Agar, diinkubasi pada suhu 20° - 25° selama 5 - 7
hari.
Perhitungan AKK
Hitung jumlah koloni per g atau per ml sediaan, harus <100 cfu/g atau cfu/ml
UJI ANGKA LEMPENG
TOTAL (ALT) PADA SEDIAAN
FARMASI
Jumlah Sediaan yang Digunakan untuk Pengujian
Jika tidak dinyatakan lain gunakan 10 g atau 10 ml sediaan uji
bahan aktif dengan jumlah sampel terbatas atau ukuran bets sangat kecil (misalnya kurang dari
1000 ml atau 1000 g) jumlah sampel yang diuji harus 1% dari bets
Untuk sediaan dengan total keseluruhan bets kurang dari 200 unit ukuran sampel dapat dikurangi
menjadi dua unit atau satu unit jika kurang dari 100 unit.
Media
 Sampel dipindahkan pada media Soybean-Casein Digest Agar pada suhu 30° - 35° selama 3 - 5
hari
Perhitungan AKK
Hitung jumlah koloni per g atau per ml sediaan, harus <100 cfu/g atau cfu/ml
 PENGUJIAN MIKROBA
SPESIFIK
Mikroba Galur Media
Uji Escherichia coli ATCC 8739, NCIMB 8545, CIP 53.126 atau MacConkey Broth
NBRC 3972 MacConkey Agar
Uji Salmonella Salmonella enterica subsp enterica serovar Rappaport Vassiliadis Salmonella
Typhimurium ATCC 14028 Enrichment Broth
Xylose Lysine Deoxycholate Agar
Salmonella enterica subsp enterica serovar Rappaport Vassiliadis Salmonella
Abony NBRC 100797, NCTC 6017 atau CIP Enrichment Broth
80.39 Xylose Lysine Deoxycholate Agar

Uji Pseudomonas Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, NCIMB Cetrimide Agar

aeruginosa 8626, CIP 82.118 atau NBRC 13275
Uji Staphylococcus Staphylococcus aureus ATCC 6538, NCIMB Mannitol Salt Agar
aureus 9518, CIP 4.83 atau NBRC13276
Uji Clostridia Clostridium sporogenes seperti ATCC 11437 Reinforced Medium for Clostridia
(NBRC 14293, NCIMB 12343, CIP 100651) atau Columbia Agar
ATCC 19404 (NCTC 532 atau CIP 79.3).
PENGUJIAN JAMUR SPSEIFIK
mikroba Galur Media
Uji Candida albicans ATCC 10231, NCPF Sabouraud Dextrose Broth
3179, IP 48.72 atau NBRC Sabouraud Dextrose Agar
1594
 UJI mikrobilogi PADA PRODUK
STERIL

A. Uji Sterilitas
B. Uji Endotoksin
 UJI STERILITAS
SEDIAAN STERIL
 JUMLAH SAMPEL (FI V)
ISI Vol sampel min. Volume Volume Jmlh
(mL) (ml) Yang hrs Media(ml) Media(ml) Wadah per
diambil per (Metode Inokulasi (netode media
langsung) penyaringan
wadah membran)

< 10 1 atau semua 15 100 20 atau 40

10-<50 5 40 100 20

50- <100 10 80 100 20

50- <100 Semua - 100 10

IV

100- 500 Semua - 100 10

>500 500 - 100 10

 JUMLAH MINIMUM YANG DIGUNAKAN UNTUK TIAP MEDIA
ISI PER WADAH (mL)
Larutan ( kecuali antibiotik)
Kurang dari 1 ml…………………………….
1 – 40 ml …………………………………….
<40 ml - ≤ 100 ml…………………………...
> 100 ml……………………………………...
Larutan antibiotik
Larut dalam air atau isopropil miristat…….
Tidak larut,krim,salep,tersuspensi/emulsi…
Zat Padat
<50mg…………………………………………
50 mg atau lebih, < 300 mg………………...
300 mg – 5 g…………………………………
> 5g …………………………………………..
Jumlah minimum yang digunakan (bila
tidak dinyatakan lain
Seluruh isi tiap wadah
½ isi setengah wadah, tidak kurang dari 1 ml
20 ml
10% isi wadah, tidak kurang dari 20 ml
Seluruh isi/wadah,sebdg tidak kurang 200mg
Seluruh isi/wadah,sebdg tdk kurang 200 mg
Seluruh isi tiap wadah
½ isi tiap wadah, tdk kurang dari 50 mg
150 mg
500 mg
Isi per wadah Jumlah minimum ang digunakan
(bila tidak dinyatakan lain)
Benang bedah dan peralatan 3 potong/helai ( a 30 cm)
bedah lain untuk hewan…………..

Pembalut/kapas/perban (dlm
kemasan…………………………… 100 mg/kemasan

Benang bedah dan bahan sejenis

yang dikemas untuk sekali pakai.. Seluruh alat

Alat kesehatan lainnya…………… Seluruh alat, potong kecil-kecil atau

diurai
Jumlah minimum bahan Yang diuji sesuai dengan jumlah
bahan dalam bets

Sediaan parenteral :
Tidak lebih dari 100 wadah………..
>100 wadah,tidak lebih 500 wadah
> 500 wadah………………………..
Sediaan volume besar…………….
10% /4 wdh(pilih yg. banyak)
10 wadah
2% / 20wdh (pilih yg.sedikit)
2%/10 wdh (pilih yg sedikit)

Antibiotik padat
Ruahan bhn farmasi dl kemasan(<5g)… 20 wadah
Ruahan bhn farmasi dl kemasan (≥5g).. 6 wadah
Ruahan dan campuran…………………. Lihat produk ruahan padat
Sediaan mata (sediaan lain yang tidak disuntikkan)
≤ 200 wadah…………………………… 5%/ 2 wadah (pilih yang besar)
> 200 wadah…………………………… 10 wadah
Batch> 200 : minimal 20 wadah
Batch 10-200 : minimal 10%
LVP : minimal 10 wadah
Otoklaf : minimal 10 wadah
Selain otoklaf : minimal 20 wadah

Pengambilan sampel atas dasar statistik,

sampel semakin besar semakin valid
Keterangan Tabel :

Otoklaf : minimal 10 wadah

Selain otoklaf : minimal 20 wadah

Pengambilan sampel atas dasar statistik,

sampel semakin besar semakin valid
2 . MEDIA
 A. Media Thioglikolat Cair (FluidThioglycolate Media)
NAMA BAHAN JUMLAH FUNGSI
L-Sistin P 0,5 Antioksidan
Agar 0,75 Nutrient dan konsistensi
NaCl 2,5 Bahan pengisotoni
Glukosa 5,5 Nutrient
Ekstrak Ragi 5,0 Nutrient
Digesti Pankreas kasein P 15,0 Nutrient
Na-Tioglikolat/ 0,5 Antioksidan
Asam Tioglikolat 0,3 ml
Na-resazurin 1,0 ml Indikator Redoks
Air Ad 1000 ml

pH 7,1 ± 0,2
 FTM

 Menetralisir pengawet golongan merkuri

 Tidak dapat menumbuhkan spora Bacillus subtilis dalam

sediaan padat / didaerah anaerob dibagian bawah
media
 Media segar dapat digunakan sampai 2 hari setelah
pembuatan

 Penyimpanan 2 0 C– 25 0C pada tempat gelap : dapat >

2 HARI

 Serbuk media : Dalam tempat kedap ≤ 1 tahun

 Dalam tempat tidak kedap : ≤ 1 bulan

Suasana Aerob-anaerob
Na Resazurin + oksigen berwarna rosa

Ukuran Tabung Untuk Media tergantung Volume

Media (untuk menjamin adanya oksigen):
 Volume media 15 ml : 20x150 mm
 Volume media 40 ml : 25x 299 mm
 Volume media 75-100 ml : 38x200 mm
B. MEDIA TIOGLIKOLAT ALTERNATIF

NAMA BAHAN JUMLAH FUNGSI

L-Sistin 0,5 Antioksidan
Na Cl 2,5 Pengisotoni
Glukose 5,5 Sumber energi-Nutrient
Ekstrak Ragi 5,0 Nutrient
Digesti Pankreas Kasein 15,0 Nutrient
Na Tioglikolat / Antioksidan Antioksidan
Asam Tioglikolat
Air
pH 7,1 ± 0,2
FTM Alternatif digunakan untuk :

a. Alat dengan lumen yang sempit

b. Sediaan parenteral yang keruh
c. Sediaan parenteral yang kental
C. MEDIA SOYBEAN CASEIN DIGEST / TRYPTICASE SOY BROTH (TSB)

NAMA BAHAN JUJMLAH FUNGSI

Na Cl 5,0 Pengisotoni
Digesti Pankreas Kasein 17,0 Nutrient
Digesti peptik tepung 3,0 Nutrient
kedelai
K Fosfat dibasa 2,5 Buffer
Glukosa 2,5 Nutrient
Air Ad 1000 ml
pH 7,3 ± 0,2
 pH lebih basa dibanding FTM
 Untuk pertumbuhan jamur
 TSB juga dapat menumbuhkan
bakteri maupun jamur
 TSB sesuai untuk Slow Growing
Aerobic Microorganism
3. INKUBASI : WAKTU-SUHU

 Lama inkubasi : memperhatikan lag time (waktu yang diperlukan

mikroorganisme untuk beradaptasi dengan media)

 Bila sediaan obat bereaksi dengan media, dan timbul kekeruhan: dibiarkan
sampai hari ke 3 dan ke 7 dan dipindah pada media sejumlah yang sama.
Waktu inkubasi total tidak berubah

 Uji sterilitas untuk iv admixture paling lambat 1 jam setelah dicampur

- Bakteri dengan FTM pada suhu : 300 C
- Jamur/ragi dengan TSB : 20 0C-250 C

MEDIA METODE UJI LAMA SUHU

INKUBASI INKUBASI

FTM Inokulasi Langsung 14 hari 30-35

Filtrasi Membran (≤ 100 ml) 7 hari 30-35
Filtrassi membran (≥ 100 ml) 7 hari 30-35

TSB Inokulasi Langsung 14 hari 20-25

Filtrasi Membran (≤ 100 ml) 7 hari 20-25
Filtrassi membran (≥ 100 ml) 7 hari 20-25
 2 MACAM METODE UJI
1. INOKULASI LANGSUNG

- Ambil sediaan dengan pipet atau spuit

injeksi, secara aseptis, untuk 2 media

- Campur tanpa aerasi berlebih

- Inkubasi pada suhu yang sesuai

- Amati pada hari ke 3,4,5,7,8 dan 14

 Bila mengandung
bakteriostatik/fungistatik

- Diencerkan

- Dinetralkan

- Uji dengan metode penyaringan

membran
BAHAN METODE INAKTIVASI
Senyawa merkuri
-Fenilmerkurinitrat (1:50.000) 10 ml FTM
-Mertiolat (1:10.000)  10 ml FTM atau 12% Na Thiosulfat

Phenol  diserapkan pada 0,1% Darco

Benzalkonium Klorida Lesitin dan polisorbat 80

Sulfonamida P-Aminobenzoic acid

Penisilin Penisilinase

Sefalosporin -Sefalosporinase

Sterptomisin -Sistein HCl 2% dalam media asam

Kresol Encerkan 0,35% kresol dengan 60 ml media

Khlorobutanol Encerkan 0,5% klorobutanol dengan 40 ml

media
 KONDISI KHUSUS
 Salep dan minyak yang tidak larut dalam isopropil miristat :
didispersikan dalam air steril

 Zat padat : zat padat/yang telah disuspensi atau dilarut dl pembawa

yang sesuai diinokulasi min.40ml media

 Kapas Murni ,perban,pembalut,benang bedah : diambil bag yang paling

dalam, antara 100-500 mg diinokulasi

 Alat kesehatan steril :

- Masukkan semua bagian dalam media
- Bila alat besar, ambil yang tersembunyi, inokulasi
- Lumen sempit, aliri dengan Tioglikolat Alternatif,tampung dan inkubasi

 Alat Suntik : Isi dengan media, keluarkan media lewat jarum dan
inokulasi pada media yang sesuai
II. METODE PENYARINGAN

1.Sampel disaring dengan filter :

-porositas 0,45 µm
-diameter 47 mm
-kecepatan penyaringan 55ml-75ml per menit
-Tekanan 70 cm Hg

2. Filter ditanam pada media (satu media satu filter atau satu filter
dibagi untuk 2 media)
 Mikroba Untuk Uji Media

Media MIKRO ORGANISME SUHU KONDISI

INKUBASI
( 0C )
FTM Bacillus Subtillis 30 -35 Aerob
Candida Albicans 30-35 Aerob
Bacteroides Vulgatus 30-35 Aerob

Tioglikolat Bacteroides Vulgatus 30-35 Anaerob

Alternatif

TSB Bacillus Subtillis 20-25 Aerob

Candida Albicans 20-25 Aerob
PENAFSIRAN HASIL
I. Kontrol positif : adanya pertumbuhan
Kontrol negatif : tidak ada pertumbuhan

- Media ditambah sampel uji ada pertumbuhan, sediaan tidak

steril
- Media ditambah sampel uji tidak adanya pertumbuhan,
sediaan steril

II. Bila ada keraguan terhadap hasil uji Tahap I, maka uji sterilitas
diulang dengan menggunakan sampel dengan ketentuan :
- Jumlah sampel 2 kali dari Tahap I
- Volume sampel sama
 UJI ENDOTOKSI
SEDIAAN STERIL
INJEKSI
 ENDOTOKSIN
• Pirogen yang paling poten
• Penyusun dinding sel bakteri bagian luar
• Komponen utama :
1. Lipid
2. Polisakharida

LIPOPOLISAKHARIDA
(LPS)
Efek endotoksin bagi tubuh
• demam
• aktivasi sistem sitokin
• rusaknya sel-sel endotelial
• permeabilitas pembuluh darah berubah sehingga
menyebabkan turunnya tekanan darah
Terjadinya demam akibat endotoksin
Endogenous pyrogen (Endotoksin,virus
etc)

Phagocytic Leucocytes (Makrophag)

Pusat Termoregulator di otak

Panas
 SIFAT FISIKA KIMIA
1.Amphiphilic
- Ujung polisakharida : hidrofilik
- Lipid A : hidrofobik
- Teragregasi dan diabsorbsi
- Ukuran agregat kecil , kelarutan besar semakin toksik

Ukuran agregat dipengaruhi oleh :

a. Bentuk garam : TEA agregatnya paling kecil
dibanding garam lain
b. Kation valensi 2 : mengurangi muatan negativ,
sehingga ukuran membesar
c. Chelating agent : memperkecil ukuran agregat
d. Surfaktan : memperkecil ukuran partikel
e. pH naik : ukuran partikel semakin kecil

2. Pada pH 2, endotoksin bermuatan negativ

3. BM besar
4. Stabil
5. Ukuran : 1 – 50 mikron
6. Tidak dapat mengendap
 II. UJI ENDOTOKSIN

LAL = Limulus Amebocyte Lysate

Reaksi :
Endotoksin + Reagen LAL Jendal-Gel
Pyrogenic Tresshold berbeda, jadi perlu standard
Contoh : Salmonella Thyposa = 0,1-0,14
E Coli = 1,0
Pseudomonas = 50 – 70
Standard Reagen LAL:
- Primer (RSE) - Sekunder (CSE)
 REAKSI REAGEN LAL DENGAN ENDOTOKSIN

ENDOTOKSIN

Active Cloting Enzyme

C--------------N
Ca2+
C N (Coagulogen)
Proenzyme C -------------N

Peptida bebas + Coagulin yg tidak larut

 METODE UJI ENDOTOKSIN
1. Metode Jendal Gel :
- Reagen LAL mempunyai parameter
kepekaan (‫ = )ג‬konsentrasi endotoksin
0,125 =‫ ג‬EU/ml artinya reagen LAL akan
mengendap bila di + endotoksin minimal
0,125 EU/ml

- Merupakan uji semi kuantitatif karena ada

rentang hasil
 CARA UJI
- Sampel diencerkan dengan beberapa derajat pengenceran
- Masing-masing di + reagen LAL dg ‫ ג‬tertentu
- Tetapkan end point ( pengenceran terbesar yang masih
menghslkan jendal gel +)

Contoh :
Misal 0,125 = ‫ ג‬EU/ml
Hasil : 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64
+ + + + + - -
+ + + + + - -
+ + + + + - -
End Point terjadi pada pengenceran = 1 : …16….
Kadar Endotoksin = …16…..x…0,125…. = …2….. EU/ml
Jumlah Endotoksin dalam sediaan = ……..x…….
Perhitungan Rata-rata Geometrik :
1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64
+ + + + + - -
+ + + + + - -
+ + + + - - -
+ + + + - - -
End Point :
1. 16x0,125 = 2 log2=
2. 16x0,125 = 2 log 2=
3 8x0,125 = 1 log 1= jumlah =
4. 8x0,125 = 1 log 1= Rata-rata
Anti Log =
 2. METODE TURBIDIMETRI

A. Uji End Point

- Lar Standard berbagai konsentrasi di + reagen LAL
- Kekeruhan yang terjadi diukur dengan spektrofotometer
atau diukur dengan plate reader
- Didapatkan harga beberapa ODC (Optical Density)
- Dibuat kurva baku antara kadar dan OD
- Kelemahan : kekeruhan tergantung dengan waktu

B. Metode Turbidimetrik Kinetik

- Menghitung onset of time atau waktu untuk mencapai
/mendapatkan kekeruhan dengan derajat tertentu
 3. METODE KHROMOGENIK

- Reagen LAL di + Endotoksin + Substrat sintetik

- Susbstrat Sintetik : substrat peptida dengan ujung
asam amino. Ujung ini merupakan kromofor yang
tidak berwarna selama melekat pada substrat
- Endotoksi dapat melepas kromofor ini sehingga
larutan menjadi berwarna kuning
- Semakin tinggi kromofor senakin kuat warna
kuning yang timbul
 BATAS ENDOTOKSIN SEDIAAN
BERAT BAHAN OBAT- VOLUME SEDIAAN
Persyaratan Endotoksin untuk bahan obat : 5EU/Kg BB/Jam
(Intra Thecal : ≤ 0,2 EU/Kg/Jam)
- Berat Badan Rata-Rata : 70 Kg
- Luas Permukaan : 1,8 m2
Syarat : 5 EU/kg atau 194 EU/m2

Persyaratan Endotoksin untuk sediaan di Industri lebih ketat :

- LVP : 0,5 EU/ml
- WFI/SWFI : 0,25 EU/ml
- Sediaan Radio Farmasi : 175 EU/ml
- Intra Thecal : 14 EU/Volume
 Menghitung Batasan Endotoksin
Contoh Soal :
- Takaran Maksimal = 1,0 gram atau 1.0/70
= 14,3 mg / kg BB
- Batasan Endotoksin = 5 EU/Kg : 14,3 mg/kg
= 0,35 EU/mg
- Konsentrasi sediaan : 100 mg/ml
- Batasan Endotoksin per wadah :
0,35EU/mgx100mg/ml = 35 EU/ml
- Catatan : dalam Farmakope persyaratan ditulis
dalam EU/ml