ISOLASI DNA &

RNA
Sumber DNA atau RNA

fatchiyah TABM JB UB 2
- Melisiskan DNA dari nukleus
Penggerusan (homogenasi) Mortar dan pestle
atau lainnya

-Memisahkan DNA dari-

komponen-
komponen sel yang lainnya
-
Bufer ekstraksi SDS (Sodium Dodecyl Sulfat),
CTAB (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide)
Sentrifugasi 10.000 rpm lebih 3
 Extraction/Precipitation Method
Step 1: penghancuran dinding sel dengan pengerusan

Step 1+2: gangguan mekanis dan

homogenisasi dalam buffer ekstraksi

Grind sample into a fine powder to

shear cell walls and membranes

Step 2: Lysis cells menggunakan

extraction buffer

Mix thoroughly with extraction

buffer to dissolve cell membranes Crude lysate
and inhibit nuclease activity 4
 Digunakan fenol (pendenaturasi protein)

 Fenol + kloroform (1:1) = deproteinasi lebih efektif

jika digunakan 2 macam pelarut organik. Kloroform
juga menghilangkan lipid dan pada tahap akhir
ekstraksi, membantu menghilangkan sisa fenol.

 Isoamil alkohol membantu pemisahan fase, menurunkan

jumlah material kontaminan yang terikut pada fase
cair dan interfase serta membantu menurunkan busa.

5
 Garam (NH4+, Na+, NaOAc, NaCl, NHOAc)
 Dan ethanol 100% atau isopropanol
- ethanol sebanyak 2-2,5 x volume
- isopropanol 0.6-07 X volume
untuk Isopropanol sering digunakan
untuk presipitasi pertama, tetapi
tidak
mengendapkan garam
untuk tahap akhir dibanding
karena ethanol.
cenderung

6
Garam yang biasa ditambahkan dalam
presipitasi alkohol
Secar umum Na+ = 3 M; NH4+ = 7.5 M
a
Jenis garam Larutan stok Konsentrasi akhir

Na asetat 2.5 M (pH 5,2-5,5) 0.25 M – 0.3 M

NaCl 5,0 M 0,1 M (optimal < 0,15 M)

Amonium asetat* 4,0 M 1,3 M

sterilisasi menggunakan filter, jangan di autokloaf 7

Komponen Sifat Pengaruh
pH Penghambat enzim
degradative
Tris bufer Menjaga pH
Ethylene diamine Mengkelat kation (Mg),
tetraacetate (EDTA) menghambat enzim yg tgt
logam (nuklease, DNase)
Na/K garam Menstabilkan inti
Proteinase K enzim Mendigest protein
Sodium dodecyl Detergent Merusak membran sel,
sulfat (SDS) anionik mendenaturasi protein,
menghambat aktivitas
nuklease

8
Komponen Sifat Pengaruh
Cetyltrimetilamonniu Detergen Merusak membran sel,
mbromide (CTAB) kationik mendenaturasi protein,
membentuk kompleks dengan
DNA, menghambat aktivitas
nuklease
Chloroform-isoamyl Ekstraksi protein
alkohol (CIA)
Isopropanol) Presipitasi kompleks CTAB-
DNA
Hidroksikuinolin Agen Menghambat proses oksidasi,
Glukosa, cystein pereduksi melindungi DNA dari quinone,
disulfit, peroxidase,
β-merkaptoethanol polyphenoloksidase, mencegah
Glutation, Na2S2O5 pencoklatan oleh polifenolik
Dithiothreitol
Asam askorbat

9
Komponen Sifat Pengaruh
Polyvinilpirolidon (PVP) Absorben Mengurangi efek polifenol,
Bovin serum albumin polyfenol quinon, tanin
(BSA) BSA = denaturasi enzim
degradatif
Dietylpyrocarbonate Poliamin Melindungi dari
Bentonite RNase

Spermine
Spermidin

Dietylditiocarbamic Inhibitor Mengkelat Cu2+

acid (DIECA) fenoloksidas
e
Cyanide Melindungi dari enzim2
oksidase logam berat
NH 2/28/2011 fatchiyah TABM
Melindungi
JB UB
dari H+ 10
 Extraction/Precipitation Method

Step 4: Pengendapan Asam Nukleat

Before After
After Centrifuge Wash Centrifuge
Supernatant 70%
EtOH

Pellet Larutkan
 Pellet mengandung
• Pellet asam
down nucleic acids. pellet (H2O,
Tambahkan alkohol nukleat
dan garam untuk TE, dll.)
 Cuci pellet dengan
mengendapkan menggunakan etanol 70% untuk
asam nukleat dari menghilangkan sisa-sisa garam
fraksi larutan dan kontaminan yang lainnya
 Hilangkan ethanol dan
keringkan pellet
11
 DNA yang diperoleh selanjutkan dinilai
kemurniannya dan dikuantifikasi
menggunakan spektrofotometer-UV.
 Kemurnian DNA dinilai dari perbandingan
absorbansi  260 dan 280 nm
 Konsentrasi [DNA] = Å260 x factor
pengenceran x 50g/ml
Å260/Å280 antara 1,8 – 2,0
Å230/Å260 sekitar 0,5 (hanya untuk
tanaman)
12
Checking for Degradation: DNA

genomic
DNA  Metode umum untuk melihat
tingkat degradasi DNA adalah
dengan menggunanakan agarose
gel
 DNA dengan Kualitas baik harus
RNA bisa bermigrasi sebagai pita/band
(degraded)
dengan berat molekul yang tinggi,
dengan sedikit atau tanpa
smear/tanda

13
 Plasmid Isolation
Molekul DNA berbentuk sirkuler
yang terdapat dalam sel bakteri
atau ragi disebut plasmid.
Plasmid ini merupakan molekul
DNA nonkromosom yang dapat
berpindah dari bakteri satu ke
bakteri yang lain dan memiliki
sifat pada keturunan bakteri
sama dengan induknya

14
 Plasmid Isolation

o Pertama, pisahkan sel dari media pertumbuhan

o Lisis sel inang untuk melepaskan DNA plasmid
tapi bukan DNA genomnya ( biasanya dilakukan
dalam larutan alkali dan SDS)
o Netralkan dengan asam untuk memungkinkan
DNA genom untuk renature dan agregat
o DNA ukuran besar dan protein yang terikat pada
SDS
 Isolating Recombinant Plasmids

 Sel disuspensikan kembali dalam buffer (P1) yang

mengandung Tris, EDTA, dan RNase.
 EDTA menstabilkan membran sel dengan mengikat
kation divalen (Mg2+dan dan Ca++)
 RNase menghancurkan RNA sel.

NOTE: DO NOT VORTEX!

Source: DNA Science: The First Course in Recombinant DNA Technology

15
 Isolating Recombinant Plasmids

Sel-sel yang diresuspensi

selanjutnya direaksikan
dengan SDS dan natrium
hidroksida (P2).
SDS melarutkan fosfolipid
dan protein komponen
membrane sel .
Membran sel lisis,
melepaskan sel isi
Source: DNA Science: The First Course in Recombinant DNA Technology

16
 Isolating Recombinant Plasmids
 Natrium hidroksida,
mendenaturasi kedua plasmid
dan DNA kromosom menjadi
untaian tunggal.
 DNA kromosom memisah
sepenuhnya menjadi untaian
individu.
 untai tunggal-plasmid loop
tetap dihubungkan bersama
seperti cincin yang saling
bertautan. Source: DNA Science: The First Course in Recombinant DNA Technology

17
 Quantifying Plasmid DNA

Kuantifikasi DNA menggunakan absorbansi

UV
 absorbansi UV DNA pada 260 nm
 Absorbansi UV protein pada 230 nm (ikatan
peptida) dan 280 nm (asam amino aromatic)
 Perbandingan absorbansi pada 260 nm/280 nm
adalah ukuran kemurnian sampel DNA; harus
antara 1,65 dan 1,85.

18
 Isolasi RNA
Prosedur isolasi RNA HARUS dilakukan dalam
kondisi RNase-free.
Sampel yang akan diisolasi RNAnya harus
bebas dari kontaminasi dengan ribonucleases
(RNase).
Peralatan yang dipergunakan harus terlebih
dahulu diautoklaf atau ditreatment
(disemprot ethanol 70%) untuk mencegah
kontaminasi RNase. 19
 Isolasi RNA
 Selama melakukan isolasi RNA, peneliti harus
menggunakan sarung tangan (gloves) baru untuk
melindungi pengguna dan melindungi RNA hasil
isolasi dari nucleases yang terdapat pada kulit.
 Reaksikan dengan 0,1% DEPC. DEPC
menonaktifkan nuklease secara kovalen
memodifikasi residu-Nya dalam protein. Umumnya
dianggap tidak perlu untuk ekstraksi DNA. Tidak
kompatibel dengan larutan yang mengandung Tris
atau HEPES.

DEPC: diethyl pyrocarbonate, RNase-Free

untuk semua larutan & peralatan yg akan
digunakan
 Using Nucleases to Remove Unwanted DNA or RNA

Add DNase

+ DNase (protein)

Add RNase

+ RNase (protein)

pada saat penambahan nuklease dilakukan, mungkin perlu

untuk: ulangi langkah pemurnian untuk menghilangkan
protein (misalnya ekstraksi fenol/kloroform).

21
 Solution for RNA
 isolation
RNA diisolasi dengan cara menghomogenasi jaringan
pada buffer ekstraksi yang mengandung Guanidinium
Thiocyanate (GTC) untuk melisiskan sel dan
menonaktifkan RNase endogenous.
 Lithium Chloride (LiCl) yang ditambahkan pada
homogenasi yang kedua berfungsi sebagai selective
precipitation pada isopycnic centrifugation yang
menggunakan Caesium Trifluoroacetate (CsTFA).
 Isopycnic centrifugation adalah suatu
mekanisme
pemisahan molekul berdasarkan perbedaan
Berat
 Jenis (BJ) antara DNA (1.5 – 1.7 g/ml) dengan
protein berada di atas supernatan, DNA terlarut
RNA
dalam supernatan. Pellet RNA selanjutnya dicuci
(1.7
untuk– menghilangkan
2 g/ml). kontaminan protein dan DNA.
Sesudah sentrifugasi, RNA berada pada pellet, 22
Kuantifikasi dan Kemurnian RNA

 RNA yang diperoleh selanjutkan dinilai

kemurniannya dan dikuantifikasi menggunakan
spektrofotometer-UV. Kemurnian RNA dinilai
dari perbandingan absorbansi pada  260 dan
280 nm. Sampel RNA murni mempunyai rasio
A260/A280 sebesar 2  0.05.
 Kuantifikasi RNA dilakukan berdasarkan
absorbansi pada  260 nm.
 Konsentrasi RNA pada absorbansi dengan nilai
1 adalah 40 g/ml.
 Konsentrasi RNA pada sampel dapat dihitung
menggunakan rumus berikut.
 [RNA] = A260 x D x 40 g/ml
 D = faktor pengenceran 23
Checking for Degradation: RNA

 RNA ribosom (rRNA) membentuk

lebih dari 80% dari total sampel
RNA.
25S
18S
 RNA total harus menampilkan dua
pita menonjol pada gel
elektroforesis.
 sesuai dengan 25S dan 18S rRNA,
yaitu 3,4 kb dan 1,9 kb di
Arabidopsis (masing-masing).
RNA berkualitas baik akan memiliki:
Rasio 25S/18S antara 1,8 - 2,3 dan
24