ISOLASI DNA

UPAYA UNTUK MEMBEBASKAN MATERI

GENETIK DARI DINDING SEL DAN IKATAN
PROTEIN HISTON YANG TERUTAMA SEKALI
TERLETAK DALAM SEL DENGAN
MENGUPAYAKAN TINGKAT KERUSAKAN
MEKANIS /FISIS SEMINIMAL MUNGKIN.
 Sumber DNA
Berdasarkan DNA dalam Sel
DNA inti
DNA Mitokondria
Berdasar asal sel :
 fosil, sperma, tulang, darah, jaringan, air
seni, feses, dll
 TAHAP ISOLASI DNA
Pemecahan sel dari Jaringan
Deproteinasi DNA
Pemurnian DNA
 Pemecahan jaringan untuk
membebaskan sel
Secara Mekanis
 Menggunakan mortar dengan bantuan N2 cair,
bola-bola besi, butiran pasir atau kaca steril
 Menggunakan homogenisator
Secara kimiawi/Enzimatis
 Menggunakan enzim-enzim yang dapat
melarutkan senyawa selulosa atau pektin
 Setelah proses pemecahan jaringan dilakukan lisis
menggunakan bermacam-macam detergen spt:
-SDS (Sodium duodecyl sulfonate)
-EDTA (sodium deodocyl sulfat)
 Mekanisme kerja
 EDTA merusak sel dengan cara mengikat ion
magnesium yang berfungsi mempertahan kan
integritas sel dan aktifitas enzim nuklease
yang merusak asam nukleat.
 SDS sejenis deterjen yang dapat digunakan
untuk merusak membran sel
 Sisa sel akibat perusakan oleh SDS dan EDTA
di bersihkan dengan sentrifugasi
 Deproteinasi molekul DNA
 Menghilangkan protein dari larutan digunakan
senyawa fenol untuk mendegradasi protein
yang mengikat benang-benang DNA pada
kromosom. Kloroform digunanakan untuk
menghilangkan protein dan polisakarida

 Protein juga dapat dihilangkan dengan enzim

proteinase, dan RNA dengan enzim RNAse
yang merusak molekul RNA.
 Pemurnian DNA
 Pemisahan protein dan RNA maka DNA dapat
diisolasi secara utuh.
 DNA dicampur dengan ethanol dan NaCl yang
berfungsi memekatkan, memisahkan DNA dari
larutan dan Mengendapakan DNA.
 Endapan DNA dimurnikan lagi, lalu dilarutkan dengan
larutan TE. DNA selanjutnya dapat digunakan untuk
berbagai analisis molekuler.

Isolasi DNA sekarang juga banyak dilakukan dengan

menggunakan kit komersial yang dijual dipasaran.
 Mengukur Jumlah DNA

Prinsipnya adalah iradiasi sinar ultra violet (UV) yang

diserap nukleotida dan protein dalam larutan.
Penyerapan iradiasi sinar UV maksimal oleh DNA
pada panjang gelombang 260 nm dan protein pada
280 nm.
Optical density (OD260) sama dengan satu
menunjukkan konsentrasi DNA 50 µg/ml, atau 40
µg/ml RNA atau 20 µg/ml RNA. Atau dengan rumus:

Konsentrasi µg/ml = A260 x FP x 50 µg/ml (DNA)

FP = Faktor pengenceran
 Mengukur tingkat kemurnian DNA
 Kemurniaan DNA mempunyai hubungan
dengan kualitas DNA.
 Kemurnian DNA diukur dengan
spektrofotometer dengan membandingan
Absorbansi A260 dengan A280.
 Kemurnian DNA yang baik adalah jika
perbandingan kedua absorbansi 1.8-2.0
< 1.6 – protein contaminated
> 2.0 – chloroform /
phenol contaminated
Menentukan Ukuran Molekul DNA

Ukuran molekul DNA diketahui dengan cara

melakukan elektroforesis dari DNA kemudian
dilihat dengan bantuan “molekuler weigh DNA
marker”.
4.