Polimerase Chain Reaction (PCR)

Tahun 1985, Kary Mullis, California Metode untuk meng-amplifikasi (melipat gandakan) fragment DNA (Gen) Dibutuhkan : DNA atau RNA Oligonucleotidprimer (PRIMER) Enzym Taq-Polimerase Campuran dari 4 Basa Nukleotida (dNTPs) 10 x Reactions Buffer Larutan MgCl

Alat : Thermal Cycler

Prinsip : perobahan temperatur secara otomatis dengan waktu yang telah ditentukan Dapat diatur (Program) Contoh : 95 C------ Denaturasi 55 C------ Hybridisasi (Annealing) 72 C------ Synthese DNA (Extension) Lama reaksi, bervariasi tergantung

DNA
DNA di-isolasi dari sel (darah atau jaringan) DNA menjadi template atau matrix untuk proses amplifikasi Sense : 5- ATG(Start) -GGT-TCT-GTTGCT-GCT-TGG-TAA(Stop)- 3 Antisense : 3 - TAC-CCA-AGA-CAACGA-CGA-ACC-ATT- 5 Exon dan/atau Intron dapat berfungsi sebagai Matrix untuk amplifikasi

RNA
Single strand (Uracil pengganti Thymin) Transkripsi dari DNA mRNA Mengandung informasi genetik dari Exon Dengan Enzym Reverse Transkriptase diperoleh DNA dari RNA cDNA Reaksi PCR nya disebut RT-PCR

Taq-Polimerase
Klenow - DNA Polymerase dari E.Coli 1988 : Taq-Polymerase dari Bakteri Thermus aquaticus Hybridisasi dan Polimerisasi berlangsung pada temp. 50-70 C Perhatikan : Buffer yang digunakan (10 x RB) dan diperlukan MgCl2

Primer
Sequence dari Nukleotida tertentu (Intron atau Exon) : 20 30 bp Prinsip : merupakan complementare dari kedua strand DNA (Forward Primer dan Reverse Primer). Dari kedua Primer ini disinthese DNA yang baru dan seterusnya berfungsi sebagai matrix untuk siklus berikutnya. Penentu bagi fragment DNA yang akan diamplifikasi

PCR-REACTION

PCR-Reaction

PCR Product (Amplifikat)

Gel-elektrophorese (Agarose) Southern Blot (Hybridisasi dengan Sonde DNA spesifik) Dot - Blot (deteksi : Enhanced Chemie Luminescense = ECL) Denaturating Gradient Gel Electrophorese (DGGE) atau Pulse Field Gel Electrophorese (PFGE) Enzym Restriksi : Restriction Endonuclease Sequence analysis (DNA Sequencing)

cytoplasmic proteins

free ribosomes

Protein Traffic

RER

Aplikasi teknologi DNA

INFEKSI SALURAN CERNA : Membedakan jenis : pathogen non pathogen (Eschericia coli) Untuk bakteri yang sulit dikultur oleh karena memerlukan syarat tertentu (Campylobacter) Membedakan jenis bakteri dari toxin yang diproduksinya (E. coli dan Shigela sp.) Subklas bakteri : Campylobacter, Helicobacter Mengidentifikasi jenis Rotavirus (A, B, C)

Aplikasi teknologi DNA

Mycobacterium tuberculosis : Membedakan jenis atypic, dengan mikroskop hal ini tidak mungkin Kultur : waktu yang lama dan bakteri harus banyak (terutama untuk sensitivity test) Diagnose cepat dibutuhkan, mis. pada penderita AIDS. Ditemui jenis yang multi drug resistant (MDR) Diagnosa dengan PCR dan Hybridisasi (contoh : dot-blot)

Carcinogenesis (Colorectal
Cancer)

Penerapan Teknologi Gen/DNA dalam Therapy

Produk dari gen untuk therapy dan prophylaxis : Erythropoietin Insulin Hormon pertumbuhan Faktor pembekuan darah VIII Plasminogen aktivator Vaksin Hepatitis B

Aplikasi gen dalam Forensik

Sebelum teknologi DNA diterapkan (1978) biasanya digunakan protein, misalnya antigen gol.darah, HLA, dll. 1985 : DNA Polymorphismus. Nov.1987 : DNA sebagai barang bukti di pengadilan di Inggris. Sampai akhir 80-an : lebih dari 1000 perkara dibantu oleh bukti-bukti DNA Juga dapat menentukan Paternity Profil DNA tiap individu berbeda