Laporan Praktikum

Genetika Sel

Isolasi DNA Allium cepa L.
(dengan cara sederhana)










Universitas Gadjah Mada
Yogyakarta
2010


1

BAB I
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Metode yang ada untuk keperluan penelitian dalam biologi molekuler dan
genetik terus berkembang dengan cepat. Agar dapat digunakan untuk
manipulasi, diagnosis, dan terapeutik, DNA dan RNA harus diisolasi
dalam bentuk dan jumlah yang sesuai. Metode terbaik untuk isolasi DNA
dan RNA dan perbanyakannya tergantung pada tujuan penggunaan.
Walaupun hampir semua teknik melibatkan banyak kerja dan
membutuhkan sejumlah besar materi awal, penggunaan kit dari berbagai
perusahaan bioteknologi cukup menyederhanakan isolasi DNA dan RNA.
Isolasi baik secara klasik maupun dengan kit menggunakan prinsip dasar
yang sama (Lyrawati, 2004).
Isolasi DNA merupakan prosedur rutin dalam analisis molekuler. Jumlah,
kemurnian sampel DNA dan kondisi optimum reaksi menjadi hal yang
menentukan dalam analisis genetika molekuler. Oleh karena itu diperlukan
metode yang tepat dalam isolasi DNA (Pharmawati, 2009). Prosedur
isolasi DNA dapat berbeda-beda tergantung tujuan isolasi dan kuantitas
yang dibutuhkan (Remelia, 2008). Protokol sederhana dan singkat, seperti
dalam ekstraksi bawang atau pisang telah dikembangkan untuk
memfasilitasi eksperimen yang dapat dilakukan dengan peralatan
sederhana serta biaya yang relatif murah (De Boer, et.al., 2000)


B. Permasalahan
1. Bagaimana cara/tahapan untuk mengisolasi DNA dengan cara
sederhana?
2. Apakah metode yang digunakan mampu mengisolasi DNA Allium
cepa L.?
3. Bagaimana benang DNA hasil isolasi dari Allium cepa L.?

2

C. Tujuan
1. Mengetahui cara/ tahapan untuk mengisolasi DNA dengan cara
sederhana.
2. Mengetahui apakah metode yang digunakan mampu mengisolasi DNA
Allium cepa L.
3. Melihat benang DNA hasil isolasi dari Allium cepa L.


3

BAB II
LANDASAN TEORI
A. Tinjauan Pustaka
DNA merupakan polimer asam nukleat yang tersusun secara sistematis
dan merupakan pembawa informasi genetik yang diturunkan. Asam
nukleat merupakan polimer nukleotida yang tersusun atas:
1. Basa Nitrogen
Terdapat dua macam basa nitrogen yang menyusun asam nukleat, yaitu
basa purin yang terdiri dari Adenin dan Guanin,serta basa pirimidin
yang terdiri dari Sitosin, Timin dan Urasil.
2. Gula Pentosa
Gugus gula pada RNA adalah ribose, sedangkan pada DNA adalah
deoksiribosa. Perbedaan keduanya terletak pada atom C nomor 2 yang
dalam RNA berikatan dengan gugus hidroksil (OH), sedangkan dalam
DNA berikatan dengan atom H.
3. Gugus Fosfat
Gugus fosfat terikat pada atom C nomor 5 melalui ikatan fosfodiester.
Gugus ini yang menyebabkan asam nukleat bermuatan negatif kuat
(Yuwono, 2008)
DNA genom merupakan seluruh materi genetik yang dimiliki oleh suatu
organisme termasuk di dalamnya DNA yang berinteraksi dengan protein
dan RNA, yang terdapat pada suatu sel secara bersama-sama (Weaver dan
Hedrick, 1997). Ukuran DNA yang menyusun kromosom eukariot jauh
lebih panjang daripada ukuran selnya. Oleh karena itu, DNA dikemas
dalam sistem yang sangat efisien dan kompak mengunakan protein histon.
Kompleks DNA dan protein histon (nukleosom) menyebabkan kondensasi
atau pengemasan DNA menjadi enam kali lebih kompak. Ikatan antara
DNA dengan histon ini dapat dipisahkan mengunakan garam dengan
konsentrasi tinggi. Rangkaian nukleosom membentuk struktur yang
disebut kromatin, terdiri atas DNA, protein dan RNA (kurang dari 10%)
(Yuwono, 2008).
4

Dalam penerapan teknik molekuler, bahan pokok yang harus dimiliki adah
DNA atau RNA. DNA atau RNA ini dapat diperoleh melalui proses isolasi
(Pai, 1992). Isolasi DNA adalah pemisahan molekul DNA dari molekul
lain seperti dinding sel, membran sel dan membran ini sehingga
strukturnya dapat dilihat dengan jelas. Tahap dalam isolasi DNA tanaman
yaitu pengambilan sampel (jaringan), lisis dinding sel dan membran sel,
purifikasi, serta presipitasi (Kephart, 1999). Lisis sel dapat dilakukan
secara kimiawi atau enzimatik tergantung sumber DNA-nya. Zat kimia
yang biasa digunakan adalah detergen. Detergen akan menyebabkan
protein membran terdenaturasi sehingga struktur membran akan rusak.
Ekstraksi biasanya dengan menggunakan fenol-klorofom-isoamil alkohol
atau ammonium asetat yang akan mengendapkan protein. Presipitasi DNA
dapat menggunakan etanol absolute atau isopropanol, karena bersifat
sangat polar dan dapat menarik molekul air dari DNA sehingga DNA
mengendap (Schleic, 1998). Protokol ekstraksi DNA genom juga harus
memenuhi syarat, yaitu mencegah oksidasi zat fenolik yang dapat bereaksi
dengan asam nukleat dan protein untuk menghilangkan polisakarida yang
mengganggu dengan manipulasi enzimatik dalam penelitian biologi
molekuler (Oboh, 2009).


B. Hipotesis
Metode yang digunakan pada praktikum ini dapat digunakan untuk
mengisolasi DNA Allium cepa L.

5

BAB III
METODOLOGI
A. Alat
Tube plastik, mikropipet, tip, gelas beker, corong gelas, saringan, kertas
filter, blender, microsentrifuge.
B. Bahan
Umbi bawang bombay (Allium cepa L.), larutan buffer (dibuat dari
campuran akuades steril, NaCl, NaHCO
3
, dan detergen 10%), isoprophyl
alcohol dingin, alkohol 70%, buffer TE (tris EDTA).
C. Cara Kerja
Sel-sel umbi bawang bombay dihancurkan menggunakan blender. Juice
bawang Bombay kemudian disaring menggunakan saringan biasa,
dilanjutkan penyaringan menggunakan kertas filter. Filtrat yang diperoleh
dimasukkan ke tube plastik sebanyak 400L. Kemudian ditambahkan
larutan buffer sebanyak 800L. Tube digoyang-goyangkan dengan cepat
dan searah selama 3 menit untuk mencampur filtrat dan buffer.
Selanjutnya campuran disentrifugasi menggunakan microsentrifuge
dengan kecepatan 3000 rpm selama 15 menit.
Supernatan yang diperoleh dari hasil sentrifugasi dipindahkan ke tube baru
sebanyak 400L. Kemudian sebanyak 800L isoprophyl alcohol dingin
dimasukkan secara perlahan melalui dinding tabung. Tube digoyangkan
perlahan, lalu diamati benang-benang DNA yang mulai terpisah.
Selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm selama 5 menit
untuk presipitasi DNA.
Supernatan dibuang, pellet dicuci dengan menambahkan 100L alkohol
70% dan diresuspensi menggunakan sentrifuge dengan kecepatan 10000
rpm selama 5 menit. Larutan alkohol kemudian dibuang, pellet
dikeringanginkan untuk menghilangkan sisa alkohol (bias juga dengan
diserap menggunakan tisu). Selanjutnya pellet diberi 50 L pelarut DNA
(tris EDTA), lalu disimpan dalam freezer.

6

BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Hasil

Gambar 1. Presipitat DNA Allium cepa L. hasil isolasi (pellet putih di dasar tube)

B. Pembahasan
Tujuan dari praktikum ini adalah untuk melakukan isolasi DNA dari umbi
bawang Bombay (Allium cepa L.) dan melihat benang DNA yang
diperoleh. Penggunaan umbi dalam praktikum ini didasarkan bahwa pada
umbi kromosomnya lebih lengkap. Umbi bawang Bombay mudah didapat,
memiliki kandungan air yang tinggi dan memiliki kromosom yang relatif
besar.
Prinsip dasar isolasi total DNA dari jaringan adalah dengan memecah dan
mengekstraksi jaringan tersebut sehingga akan terbentuk ekstrak sel yang
terdiri atas sel-sel jaringan dan DNA. Kemudian ekstrak sel dipurifikasi
sehingga dihasilkan pelet sel yang mengandung DNA total. Pada teknik
isolasi DNA sederhana, purifikasi yang dilakukan hanya memisahkan
benang DNA dengan debris selnya. Dalam teknik isolasi ini tidak
diperoleh DNA murni, melainkan DNA kotor yang masih berikatan
dengan protein. Kemungkinan tidak hanya terdiri atas DNA tetapi juga
terdapat RNA.
7

Proses isolasi diawali dengan penghancuran sel yang dilakukan secara
mekanis menggunakan blender. Kemudian juice yang dihasilkan disaring
dua kali, menggunakan saringan biasa dan kertas filter. Ini bertujuan untuk
memisahkan DNA genom yang terlarut dalam sari umbi dengan sisa-sisa
jaringan umbi yang telah hancur. Proses dilanjutkan dengan penambahan
larutan buffer, yang terdiri atas 3gr NaCl, 10gr NaHCO
3
, 10ml detergen
10%, dan akuades, ke tube yang berisi filtrat umbi. Larutan buffer
merupakan larutan campuran garam dan detergen, digunakan untuk
merusak membran sel, sehingga komponen DNA dalam sitoplasma sel
dapat keluar dan diisolasi (DeBoer et al., 2000; Faatih, 2009). Garam
dalam buffer berfungsi untuk memisahkan molekul DNA dari komponen
lainnya dengan membentuk ikatan ionik dengan asam nukleat (kondisi
ionik yang lebih stabil). Deterjen dapat berasosiasi dengan protein
membran sehingga akan melarutkan protein tersebut sehingga membran
sel akan dengan mudah dilisiskan (Sambrook dan Russel, 2001).
Tube berisi campuran filtrat dan buffer digoyang-goyangkan dengan cepat
dan searah selama 3 menit agar larutan menjadi homogen. Selanjutnya
dilakukan sentrifugasi pada kecepatan rendah (3000 rpm) selama 15 menit.
Sentrifugasi ini dimaksudkan untuk memisahkan campuran menjadi dua
fase, yaitu fase terlarut dan fase organik. Fase terlarut (supernatant)
mengandung DNA genom karena memiliki berat molekul lebih ringan
dibandingkan fase organiknya. Menurut Seidman dan Moore (2000), fase
organik (pellet) yang terbentuk pada bagian dasar tabung merupakan
molekul-molekul protein dan polisakarida yang terdenaturasi.
Supernatant yang diperoleh dipindahkan ke tube yang lain, kemudian
ditambahkan isoprophyl alcohol dingin. Penambahan ke dalam supernatant
harus dilakukan perlahan-lahan dan melalui dinding sel agar tidak merusak
benang-benang DNA. Beberapa saat setelah penambahan isoprophyl
alcohol, akan tampak 3 lapisan pada tube. Lapisan pertama yang tampak
bening merupakan isoprophyl alcohol, lapisan kedua yang tampak seperti
8

kumpulan benang putih merupakan benang-benang DNA, sedangkan
lapisan paling bawah merupakan sisa supernatant DNA (Gambar 2)


Gambar 2. Presipitasi DNA setelah pemberian isoprophyl alcohol
(isopropanol), tampak benang- benang DNA (B) berwarna
putih diantara isopropanol (A) dan supernatant (C)
Penambahan garam berfungsi sebagai neutralize charge pada gula fosfat
DNA. ion-ion seperti Na
+
Mg2
+
akan menyelimuti rantai DNA yang
bermuatan negatif. Di dalam air, gaya elektrostatik antara ion positif (Na
+
)
dan negatif (DNA) masih lemah karena sebagian rantai DNA masih
berikatan dengan air. Fungsi penambahan pelarut organik seperti etanol
atau isopropanol adalah menurunkan konstanta dielektrik air atau
memperbanyak ikatan DNA dengan Na
+
sehingga membuat DNA lebih
mudah terpresipitasi.
B
A
C
9


Gambar 3. Aktivitas pelarut terhadap DNA

Selanjutnya dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm selama 5
menit untuk mengendapkan molekul DNA. Setelah sentrifugasi, DNA
mengendap sebagai pellet berwarna putih di dasar tube.
Pellet kemudian dicuci menggunakan alkohol 70% dan diresuspensi
dengan sentrifugasi 10000 rpm selama 5 menit. Setelah dicuci DNA
tampak seperti endapan tepung putih. Alkohol yang digunakan untuk
mencuci DNA dibuang kemudian pellet dikeringanginkan untuk
menghilangkan sisa alkohol. Pellet harus terbebas dari alkohol karena
dapat merusak pellet DNA. Kemudian ditambahkan buffer TE (Tris
EDTA) yang berfungsi melarutkan DNA dan melindungi dari kerusakan
oleh endonuklease. Dengan penambahan TE ini, DNA dapat disimpan
dalam waktu yang lama sebelum digunakan untuk analisis selanjutnya
karena senyawa Tris dapat mempertahankan pH, sedangkan EDTA
mampu menghambat aktivitas endonuklease (Seidman dan Moore, 2000).

Pelarut Isopropanol
10

BAB V
KESIMPULAN

1. Tahapan isolasi DNA dengan cara sederhana meliputi penghancuran
jaringan dan lisis sel, purifikasi dari debris sel dan presipitasi DNA.
2. Dari praktikum yang dilakukan diketahui bahwa metode ini dapat
digunakan untuk mengisolasi DNA genom Allium cepa L. Namun, DNA
yang diperoleh dari metode ini berupa DNA kotor yang masih berikatan
dengan protein, juga kemungkinan terdapat pula RNA.
3. Hasil isolasi DNA tampak benang-benang berwarna putih. Setelah
dilakukan presipitasi dan sentrifugasi DNA tampak sebagai endapan putih
di dasar tube.


11

DAFTAR PUSTAKA

DeBoer, R.L., Sobieski, R.J., and Crupper, S.S. 2000. Isolation and Restriction
Endonuclease Digestion of Onion in Junior College-High School Biology
Laboratory. Bioscience 26 (3): 15-17
Faatih, M. 2009. Isolasi dan digesti DNA kromosom. Jurnal Penelitian Sains &
Teknologi 10 (1): 61-67
Kephart, D. 1999. Rapid Isolation of Genomic DNA from Small Quantities of
Human Tissue. www.promega.com/profiles/203/ProfilsinDNA
Lyrawati, D. 2004. DNA Recombination and Genetic Techniques, Transmission of
Human Disease and Computer Resources for The Clinical and Molecular
Geneticist (transl.Indonesian). Agric. Fac. Unibraw Publ., Indonesia (ISBN 979-
508-543-3).
Oboh,B.Q., L.A.Ogunkanmi, N.Agwu. 2009. Rapid Isolation of Genome DNA suitable
for PCR from Tropical Almond (T.catappa) Plant Populations. International
journal of Botany 5(3):250-254
Pai, A.C. 1992. Dasar Dasar Genetika. Jakarta: Erlangga.
Pharmawati, M. 2009. Optimalisasi ekstraksi DNA dan PCR-RAPD pada
Grevillea sp. (Proteaceae). Jurnal Biologi 8 (1): 12-16
Ramelia, M. 2008. Analisis Insersi T-DNA Pembawa Transposon pada T0 dan
Aktivitas Ds pada T1 Tanaman Padi (Oryza sativa L.) Kultivar Nipponbare.
Jakarta: FMIPA UI
Sambrook, J.dan D.W. Russel. 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual.
3
rd
ed. New York: CSHL press
Schleic, R. 1998. Genetics and Molecular Biology.3
rd
ed. London: John Hopkins
University press.
Seidman, L.A. dan C.J.Moore. 2000. Basic Laboratory Method for Biotechnology.
London: Prentice Hall
Weaver, R.F. dan P.W.Hedrick. 1997. Genetics. 3rd ed. Chicago: Wm.C. Brown.
Publishers.
Yuwono, T. 2008. Biologi Molekuler. Jakarta: Erlangga