Untuk menghitung jumlah mikroorganisme tersebut biasanya sample dari makanan atau

produk susu atau dari air limbah tersebut di uji menggunakan media agar PCA (Plate
Count Agar) dengan metode TPC (Total Plate Count).
Plate Count Agar (PCA) atau yang juga sering disebut Standard Methods Agar
merupakan sebuah media pertumbuhan mikroorganisme yang umum digunakan untuk
menghitung jumlah mikroorganisme total yang terdapat pada setiap sample makanan,
produk susu, air limbah dan sample-sample lainnya yang biasanya menggunakan
metode Total Plate Count.
Plate Count Agar (PCA) terdiri dari casein, yeast extract, dextrose dan juga agar.
Komposisi PCA untuk setiap liter yaitu :

Casein. 5 gram

Yeast extract.. 2.5 gram

Dextrose 1 gram

Agar.. 15 gram

Penggunaan PCA sebagai media untuk menghitung jumlah total dari mikroorganisme
sudah dilakukan sejak lama. Sekarang industri-industri seperti makanan, produk susu
dan juga pengolahan limbah sudah menerapkan penghitungan jumlah total
mikroorganisme pada sample mereka sesuai dengan standar yang ada menggunakan
PCA.
Media APDA berfungsi untuk menumbuhkan dan menghitung jumlah khamir dan yeast
yang terdapat dalam suatu sampel. Khamir dan yeast akan tumbuh dengan optimal
pada media yang sesuai. Adanya asam tartarat dan pH rendah maka pertumbuhan
bakteri terhambat. APDA dibuat dengan merebus kentang selama 1 jam/45 menit, agar
dilelehkan dalam 500 ml air. Campurkan ekstrak kentang dalam agar lalu ditambahkan
glukosa dan diaduk rata. Pada APDA jadi ini juga ditambah asam tartarat.

a.
b.
c.
d.
e.

Media ini berguna guna menumbuhkan dan menghitung jumlah dari khamir beserta
yeast dalam suatu sample. Komposisi dari media APDA ini adalah:
Asam tartarat
Kentang
Agar
Air
Glukosa
Yeast dan khamir akan tumbuh dengan baik jika dengan media yang sesuai.

2.1.1 Uji Reduktase dengan Methylen Blue

Bertujuan menentukan adanya kuman-kuman di dalam susu dalam waktu cepat.
Kualitas susu salah satunya dilihat dari kualitas mikrobiologisnya. Susu merupakan
media pertumbuhan yang tepat untuk organisme perusak yang umum. Perubahan yang
tidak dikehendaki dalam susu dipengaruhi oleh pertumbuhan mikroba dan
metabolismenya. Susu rusak diakibatkan oleh mikrorganisme yang dapat merombak
senyawa di dalam susu. Misalnya bakteri asam laktat yang merombak laktosa dalam
susu menjadi asam laktat sehingga susu menjadi basi.
Salah satu pengujian mikrobiologi susu adalah dengan uji biru metilen (methylene blue
test). Uji ini dapat memberikan perkiraan jumlah bakteri dalam susu dengan mengamati
waktu yang dibutuhkan oleh bakteri untuk melakukan aktivitas yang dapat
menyebabkan perubahan zat warna biru metilen. Semakin tinggi jumlah bakteri dalam
susu, semakin cepat terjadinya perubahan warna.
Aktivitas enzim reduktase dapat diketahui dengan cara menambah zat warna metilen
biru dalam susu. Apabila terdapat aldehid hasil aktivitas enzim reduktase, maka metiilen
blue akan tereduksi. Enzim ini akan tidak aktif pada suhu 130C.Organisme yang
tumbuh dalam susu akan menghasilkan oksigen yang ada. Karena oksigen habis,
terjadi reaksi oksidasi-reduksi untuk kelangsungan hidup mikroba. Sitrat yang
merupakan metabolit mikroba berfungsi sebagai donor hidrogen, methylene blue
sebagai aseptor hidrogen, dan enzim reduktase yang diproduksi mikroba merupakan
katalis. Reaksi oksidasi yang terjadi harus dapat menyediakan energi untuk
pertumbuhan mikroba. Oleh karena itu, dengan enzim reduktase mikroba menurunkan
potensial oksidasi-reduksi, dengan mereduksi methyelene blue. Karena tereduksi maka
methyelene blue berubah warnanya dari biru menjadi putih metilen/methylene white.
Tabel perkiraan jumlah Bakteri Berdasarkan Lama Waktu Inkubasi Pada Uji Reduktase
Lama Waktu Jumlah Bakteri Grade
Lebih dari 8 jam 500.000 Sangat Baik
6-8 jam 1-4 Juta Baik
2-6 jam 4-20 juta Cukup
Kurang dari 2

SNI 01-3141-1998.
Susu Segar :
1.Berat Jenis (pada suhu 27,5C) minimum 1,0280 gr/cm
2.Kadar lemak minimum 3,0 %, b/b3.
3.Kadar bahan kering tanpa lemak minimum 8,0 %, b/b.
4.Kadar protein minimum 2,7 %, b/b.
5.Warna, bau, rasa dan kekentalan tidak ada perubahan.

6.Derajad asam 6 - 7SH.

7.Uji alkohol (70 %) negatif .
8.Cemaran mikroba maksimum :
a. Total kuman Maks 1 x 10koloni/ml
b. Salmonella negatif
c. E. coli (patogen) negatif
d. Coliform maks 20/ml.
e. Streptococcus Group B negatif
f. S taphylococus aureus maks 1x102/ml
9. Cemaran logam berbahaya, maksimum :
a. Timbal (Pb) Maks 0,3 mg/kg
b. Seng (Zn) Maks 0,5 mg/kg
c. Merkuri (Hg) Maks 0,5 mg/kg
d. Arsen (As) Maks 0,5 mg/kg
10. Residu :- Antibiotika; sesuai dengan peraturan- pestisida/insektisida keputusan
bersama menteri kesehatan dan menteri pertanian yang berlaku.
11. Kotoran dan benda asing dan uji pemalsuan negatif
12. Titik beku -0,520C s/d -0,560C
13. Angka reduktase 2 - 5 (jam).
14. Uji Katalase Maks 3 ml. jam Lebih dari 20 juta Rendah

Susu mengandung bermacam-macam unsur dan sebagian besar terdiri dari zatmakanan yang juga diperlukan bagi
pertumbuhan bakteri. Oleh karenanyapertumbuhan bakteri dalam susu sangat cepat, pada suhu yang sesuai. JenisjenisMicrococcus dan Corybacterium sering terdapat dalam susu yang baru diambil.Pencemaran berikutnya
timbul dari sapi, alat-alat pemerahan yang kurang bersih dantempat - tempat penyimpanan yang kurang bersih,
debu, udara, lalat dan penangananoleh manusia (Buckle, et. al., 1987).Emulsi lemak yaitu globulan pada susu
dikelilingi globula yang mengandungglikoprotein, lipid polar, sterol dan beberapa enzim termasuk xanthine
oksida.Sayangnya, akibat dengan adanya membran tersebut maka struktur dapat denganmudah rusak pada saat
ada tekanan dan pendinginan (Robinson, 1987).Kualitas mikrobial dalam susu segar sangat penting bagi penilaian
dan produksiproduk susu yang berkualitas. Susu dapat disebut telah rusak apabila terdapatgangguan dalam tekstur,
warna, bau dan rasa pada kondisi dimana susu tersebutsudah tidak patut lagi dikonsumsi oleh manusia. Kerusakan
yang disebabkan olehmikroorganisme dalam makanan sering melibatkan degradasi dari zat zat nutrisiseperti
protein, karbohidrat dan lemak, baik oleh mikroorganisme itu sendiri maupunenzim yang diproduksinya
(Anonimous, 2006).
Susu yang masih terdapat di dalamkelenjar susu, dinyatakan sebagai susu steril tetapi susu yang
telah dikeluarkan dari kelenjarsusu dan kotak dengan udara sekitar, belum tentu masih steril
seperti pada saat di dalamkelenjar susu. Untuk menguji kesterilan dari susu tersebut maka perlu
diadakan ujimikrobiologi. Uji ini dapat dilakukan dengan metode DMC atau
direct microscopic count
(perhitungan mikroskop langsung), uji reduktase biru metilen atau BM dan uji resazurin.

3.1 Metode
Mikroskopik Langsung (DMC) atau Metode Breed
Pada praktikum uji mikrobiologi susu digunakan beberapa metode analisissalah satunya metode breed. Hitungan
mikroskopik dengan metode Breed sering
digunakan untuk menganalisis susu yang mengandung bakteri dalam jumlah yangtinggi. Misalnya susu yang
diperoleh dari sapi yang terkena mastitis, yakni suatupenyakit infeksi yang menyerang kelenjar susu sapi. Cara ini
merupakan suatu cepat,yaitu menghitung bakteri langsung dengan menggunakan mikroskop.Metode Breed
memeliki kelemahan yaitu tidak dapat dilakukan terhadap susuyang dipasteurisasi karena secara mikroskopik
tidak dapat dibedakan antara sel-selbakteri yang masih hidup atau yang telah mati karena perlakuan pasteurisasi.
Dalammetode Breed, luas areal pandang mikroskop yang akan digunakan harus dihitungterlebih dahulu. Hal ini
dapat dilakukan dengan cara mengukur diameter arealpandang menggunakan micrometer yang dapat dilihat
melalui lensa minyak emersi.Untuk menghitung jumlah bakteri didalam contoh, sebanyak 0,01 ml contoh
dipipetdengan pipet mikro dandisebarkan di atas gelas obyek sehingga mencapai luas 1 cm
2
,kemudian didiamkan sampai kering, difiksasi, dan diwarnai dengan birumetilen(m
ethylene blue levowitz
). Rata-rata jumlah bakteri per areal pandang mikrokopdihitung setelah mengamati 10 sampai 60
kali areal pandang, tergantung dari jumlah bakteri per areal pandang.Pada sapi yang terserang mastitis,
susunya biasanya mengandung sel-seldarahputih dalam jumlah tinggi. Setelah pewarnaan dengan biru metilen,
sel-sel darah putihakan terlihat sebagai sel yang bulat atau berbentuk tidak teratur, bewarna biru denganukuran
lebih besar daripada bakteri.Mastitis adalah peradangan pada ambing yang biasanya disebabkan olehinfeksi
kuman. Banyak kuman yang dapat menyebabkan mastitis termasuk bakteri,kapang, dan khamir. Spesies yang
sering menyebabkan mycoplasma mastitis adalahMycoplasma bovis. Mikroorganisme ini umumnya berada pada
saluran pernafasanatas, sering dihubungkandengan saluran pernafasan komplek dan pneumonia enzooticpada sapi
(Jasper, 1984). Sapi harus yang dicurigai terinfeksi mycoplasma jikamempunyai mastitis yang bersifat purulen dan
kadang tidak menampakkan gejalaklinis yang nyata. Sapi umumnya terkena mastitis lebih dari satu kwartir,
dengandiikuti terjadi penurunan produksi susu

Uji MBRT
Salah satu pengujian mikrobiologi susu adalah uji bitu metilen atau MBRT.Uji ini dapat memberikan perkiraan
jumlah bakteri dalam susu dengan mengamatiwaktu yang dibutuhkan oleh bakteri untuk melakukan aktifitas
dengan memberikanperubahan pada zat biru metilen. Semakin tinggi jumlah bakteri dalam susu semakincepat
perubahan warnayangterjadi. Pada uji biru metilen kali ini menggunakan 2 sampelyangberbeda.SampelAberisikansususegar,dan
sampelBberisikansususegaryangtelah ditambahkan bakteri (susu rusak) dan sampel C berisikan susu segar yang
telahditambahkanbanyakbakteri.Pengujianinidilakukandengancaramemipet10mlcontohsusu bersuhu 36
o
C kedalam tabung reaksi steril bertutup ulir. Kemudian ditambahkan 1ml larutan biru metilen tiosianat. Tabung
reaksi dibalikkan 3 kali agar biru metilentiosianat dan susu tercampur. Lalu tabung reaksi tersebut ditempatkan
didalam
water bath
36
o

C. Setelah5 menit,tabungreaksi dibalikkan lagiuntukmencampur zat warna.Kemudian dilakukan pengamatan dengan

mengamati perubahan warna setiap 30menit sampai 4/5 bagian contoh susu didalam tabung berubah warna
menjadi putih.Berdasarkan hasil pengamatan, dari kedua sampel tersebut baik dari sampel Ayang berisi susu segar
maupun sampel B dan sampel C yang berisi susu segar yangditambahkan bakteri kedalamnya terjadi perubahan
warna menjadi biru pudar setelah30 menit ke-4 dan menghasilkan endapan pada 30 menit ke-3. Jika dilihat
padasampel A dan sampel B bahwa kedua sampel tersebut mempunyai mutu yang masihdikatakan baik karena
keduanya mengalami perubahan sedikit dari warna awal birusangat pekat menjadi biru pekat dan tidak
terdapatnya endapannya sampai 30 menit
ke-4. Kemudian pada sampel B dan C mengalami perubahan pada 30 menit ke 3namun pada 30 menit ke4 endapannya telah berkurangOrganisme atau bakteri yang tumbuh dalam susu akan menghasilkan oksigen.Jika
oksigen habis, maka akan terjadi reaksi oksidasi-reduksi untuk kelangsunganhidup mikroba. Sitrat yang
merupakan metabolit mikroba berfungsi sebagai donorhidrogen, methylene blur sebagai aseptor hidrogen, dan
enzim reduktase yangdiproduksi mikroba merupakan katalis. Reaksi oksidasi yang terjadi harus
dapatmenghasilkan energi untuk pertumbuhan mikroba. Oleh karena itu, dengan enzimreduktase mikorba
menurunkan potensial oksidasi-reduksi, dengan mereduksimethylene blue. Karena zat methylene blue tereduksi
makan akan terjadi perubahanwarna dimana warna methylene akan berubah menjadi methylene white
dimanamenandakan jumlah aktifitas mikroba yang meningkat dengan cepat.Mekanisme biru metilen dalam uji
reduktase susu yaitu didalam susu segarterdapat enzim reduktase yang dibentuk oleh kuman yang dapat
mereduksi zatmethylene blue menjadi methylene white. Penambahan zat methylene blue untuk mengetahui
aktivitas enzim reduktase pada susu. Apabila terdapat aldehid hasilaktivitas enzim reduktase, maka methylene blue
akan tereduksi, namun enzim initidak akan aktif pada suhu 130
0
CPada uji biru metilen ini digunakan sampel susu segar A. Pengujian inidilakukan dengan cara memipet 10 ml
contoh suhu kedalam tabung reaksi steril.Kemudian ditambahkan 1 ml larutan biru metilen thiosianat, lalu tabung
reaksidihomogenkan dengan cara dibolak-balikan 3 kali. Lalu tabung reaksi tersebut ditaruhdidalam penangas air
36
0
C. Setetlah 5 menit, tabung reaksidibalikan lagi untuk mencampur zat warna. Kemudian dilakukan pengamatan
hingga 7 kali setiap 30menit hingga 4/5 bagian susu pudar atau berubah warna. Namun pada praktikumkelompok
B P1, pengamatan yang dilakukan hanya sebanyak 4 kali.Berdasarkan hasil pengamatan sampel A dari 30 menit
pertama hingga 30menit ke-4 perubahan warna yang terlihat warna biru yang terbentuk semakin pekathingga
pengamatan terakhir. Dapat disimpulkan bahwa susu sampel A memiliki mutuyang baik dimana dengan tidak
adanya perubahan warna yang terjadi menandakan
jumlah mikroba dalam susu tersebut sedikit dan tidak mengalami pertumbuhan yangsignifikan.
Hal ini dapat disebabkan mungkin karena pengamatan seharusnyadilakukan sampai 7 kali agar mendapatkan hasil
data yang akurat. Namunberdasarkan klasifikasi yang ada, sampel A tidak termasuk kelas manapun,
karenapengamatan yang dilakukan hanya sebanyak 4 kali atau 2 jam. Sehingga praktikantidak mengetahui
perubahan warna yang terjadi setalah 4 kali pengamatan

DAFTAR PUSTAKA
Anonim. 2011.
http://repository.usu.ac.id
.
Mikro-susu. [12 Oktober 2012]Angkap, J. 2010.
Mycoplasma
Mastitis Pada Sapi Perah
. http://duniaveteriner.com[12 Oktober 2012]Budi, U. 2006. Dasar Ternak Perah. Medan: Departemen Peternakan
FP USU.Siagian, A. 2002.
Mikroba Patogen Pada
M
akanan Dan Su
m
ber Pence
m
arannya
.Medan: FKM Universitas Sumatera Utara.Sri, B. 1998.
Sanitasi dala
m
Industri Pangan
. Bogor: Pusat Antar Universitas,Institut Pertanian Bogor.Wibowo, Marlia Singgih. 2011.
Uji Sterilitas
. Bandung: Sekolah Farmasi ITB