EFEK EKSTRAK ETANOL BIJI KAKAO (Theobroma cacao

SEBAGAI
ANTIFUNGI TERHADAP Candida albicans
SECARA INVITRO
Usulan Penelitian
Ivan Firmansyah
112010101029
FAKULTAS KEDOKTERAN
UNIVERSITAS JEMBER
2014

3.

Obat-obatan antifungi
memiliki banyak efek samping :
Gol. Imidazole : Mikonazole
iritasi, reaksi alergi, dan
terbakar pada kulit
Gol. Imidazole : Ketokonazole
gangguan cerna, eksanteam,
pusing, gatal, bersifat
hepatotoksisitasnya.
Amfoterisin B : mudah resisten
terhadap Candida

Patogen
. Infeksi jamur tersering adalah
kandidiasis :
Flora
normal

Menyerang segala usia, laki-laki

dan wanita 70% wanita
Disebabkan oleh berbagai
spesies Candida C.albicans,
C. stalloidea, C. tropicalis C.
albicans paling patogen dan
penyebab utama
(Sutanto I. et al, 2006)

1.

Tingginya angka
kejadian penyakit infeksi
karena jamur :
Iklim tropis
Kelembaban tinggi
Kurangnya
pengetahuan tentang
kebersihan diri

(Hariana, 2005)

LATAR BELAKANG

Efek Ekstrak Etanol Biji Kakao (T. cacao)

sebagai Antifungi terhadap Candida albicans

3.
4.

2.
1.

4.

Indonesia merupakan salah

satu laboratorium tanaman obat :
80% herbal dunia tumbuh
(Suryani, 2007)
Salah satunya kakao
mengandung senyawa polifenol
senyawa favonoid (katekin,
prosianidin, antosianin) dan
tannin antioksidan, antibakteri,
hambat tumor dan kanker,
kurangi penyakit akibat oksidasi
LDL (Misnawi, 2003)
Bersifat antifungi (Hertiani, 2002)

LATAR BELAKANG

RUMUSAN MASALAH

Apakah ekstrak etanol bijji kakao (T.

cacao) dapat menghambat
pertumbuhan C. albicans?

Berapakah konsentrasi minimum

ekstrak etanol biji kakao (T.
cacao) yang mampu
menghambat pertumbuhan C.
albicans?

TUJUAN PENELITIAN

Umu
m

menginformasikan kepada
masyarakat bahwa biji kakao
mempunyai kandungan senyawa
kimia yang penting bagi tubuh.

Khus
us

Mengetahui efek ekstrak etanol

kakao (T. cacao) dalam
menghambat pertumbuhan
jamur C. albicans.
Menentukan konsentrasi
minimum ekstrak etanol biji
kakao (T. cacao) yang mampu
menghambat pertumbuhan
jamur C. albicans.

 mengetahui efek ekstrak etanol biji kakao (T.

cacao) dalam menghambat pertumbuhan
jamur C. albicans dasar penelitian
Khusus
selanjutnya
menentukan konsentrasi minimum ekstrak
etanol biji kakao (T. cacao) yang mampu
menghambat jamur C. albicans dasar
penelitian selanjutnya.
menambah pengetahuan dan informasi bagi
masyarakat bahwa biji kakao mempunyai
kandungan senyawa kimia yang penting bagi
tubuh.

Umum

MANFAAT PENELITIAN

TINJAUAN PUSTAKA
Candida albicans
Taksonomi fungi Candida albicans
Kingdom

Fungi

Phylum

Ascomycota

Subphylum

Saccharomycotina

Class

Saccharomycetes

Family

Saccharomycetaceae

Genus

Candida

Spesies

Candida albicans (C.P Robin)Berkhout 1923

Sinonim

Candida stellatoidea dan Oidium albicans

Sumber : Setiawati, 2012

Sumber : http://pathmicro.med.sc.edu

C. albicans
Jamur dimorfik :
blastopora, pseudohifa
Membran sel :
fosofolipid ganda +
sterol target
antimikotik
Tumbuh pada pH 4,56,5, suhu 28-37 C
Dibedakan dengan
spesies jamur lainnya :
proses asimilasi dan
fermentasi.
Sumber : Tjampakasari, 2006

Representasi dari siklus ragi, hifa, dan pseudohifa

(Berman J., 2002)

Kultur C. albicans pada media SDA (Yuri, 2009)

Patogenitas C. albicans
Mekanisme infeksi

Dindin
g Sel

Sifat
dimor
fik

Faktor
Virulen
si

Hidrofobisitas permukaan sel

berperan penting pada
patogenesis oportunistik C.
albicans :
-Perlekatan pada epitel, endotel,
protein matriks ekstraseluler :
hidrofobik>hidrofilik
- Semakin hidrofobik permukaan
sel C. albicans semakin mudah
melekat pada jar.hospes

Diperantarai
mannan,
mannoprotein
, atau
polisakarida

Penetrasi
Penetras ike
dalam
mukosa

Enzim
hidrolitik :
proteinase,
lipase, dan
fosfolipase.

Pelepasan
enzim

Adhesi

Kandidiasis
Oral

Vulvo- Paronyvaginal
chial

Interdigital

Intertrigeni
mus

Antifungi Secara Sistemik

Amfoteris
in B

Berikatan dengan ergosterol membran sel

membran sel bocor kerusakan sel.
Spesies Candida mudah resisten.

Flusitosin

Penghambatan langsung sintesis DNA

sintesis protein sel terganggu

Imidazol
dan
Triazol

Spektrum luas.
Gol. Imidazol : ketokonazol, mikonazol,
klotrimazol
Gol. Triazol : Itrakonazol, Flukonazol, dan
Vorikonazol.

Biji Kakao (T. cacao)

Kakao (T. cacao)
Kingdom

Plantae

Divisi

Spermatophyta

Sub divisi

Angiospermae

Kelas

Dicotyledoneae

Sub Kelas

Dialypetalae

Ordo

Malvales

Famili

Sterculiaceae

Genus

Theobroma

Spesies

Theobroma cacao

Sumber: Siregar et al. (2002)

Sumber
perkebunan.litbang.deptan.go.id

Karakteristik T. cacao
Habitat
Iklim
tropis
Di
bawah
naunga
n pohon
tinggi
Sumber : Spillane, 1995

Buah
kakao
Kulit
Buah
Pulp
Plasent
a
Biji

Varietas
Criollo
Foraster
o
Trinitari
o
Naciona
l

Sumber : Afoakwa, 2010

Biji Kakao
Komposisi kimia biji kakao
Komponen

Keping biji (%)

Kulit biji (%)

Pulp

Kadar air

5.0

4.5

Lemak

54.0

1.5

Kotiled
on

Kafein

0.2

Theobromin

1.2

1.4

Polihidroksifenols

6.0

Protein kasar

11.5

10.9

Pati

6.0

Pentosa

1.5

7.0

Selulosa

9.0

26.5

Asam Karboksilat

1.5

Abu

2.6

8.0

Komponen lain

1.5

0.1

Testa

Sumber: Belitz and Grosch. (1999).

Sumber :
http://ditjenbun.pertanian.go.id/bbpptpsurabaya/foto_berita
/586.jpg

 Mengandung senyawa favonoid : katekin, prosianidin, dan

antosianin (Misnawi, 2003)
Flavonoid, tannin, dan saponin senyawa yang mempunyai efek
antijamur ()(Harmita, 2006; Sulistyawati et.al., 2009)
Flavonoid dan minyak atsiri pada berbagai tumbuhan efek
antifungi (Hertiani, 2012)

Biji kakao mengandung senyawa polifenol 120-180 g/kg (Misnawi,

2003)
Kandungan >> anggur merah maupun teh (Hastuti, 2010)
Polifenol memiliki antioksidan antimikroba, antkarsinogenik,
antimutagenik, hambat tumor dan kanker, kurangi penyakit
karena oksidasi LDL (Kattenberg, 2000; Osakabe et al., 2000,)

2.
1.

Polifenol dan Flavonoid Biji

Kakao

Polifenol dan Flavonoid Biji

Kakao

Flavonoi
d
Katekin
Tannin

Membentuk kompleks dengan protein

dan merusak membran sel dengan
mendenaturasi ikatan protein membran
sel membran sel lisis ((Harmita, 2006;
Sulistyawati et.al., 2009))

Adalah senyawa fenol

Bersifat antimikroba fenol berikatan
dengan protein struktur protein rusak
(Setiadevi, 2010)

Target polipeptida dinding sel

kerusakan membran sel sifat
permeabilitas membran sel hilang
(Ajizah, 2004)

Uji Aktivitas Antimikroba

Metode
Difusi

Sumber : Pratiwi,
2008

Metode
Dilusi

Kerangka Konseptual
Ekstrak Etanol Biji Kakao
(Theobroma cacao)

Katekin

Mengganggu
permeabilitas
membran sel.

Tanin

Menyebabkan
hilangnya sifat
permeabilitas
membran sel,
sehingga keluar
masuknya zat-zat
seperti air, nutrisi,
dan enzim, tidak
terseleksi.

Daya hambat antibakteri

(KHM)

Flavonoid

Membentuk kompleks
dengan protein dan
merusak membran sel
dengan cara
mendenaturasi ikatan
protein pada membran
sel, sehingga membran
sel menjadi lisis dan
senyawa tersebut
menembus ke dalam inti
sel menyebabkan jamur
tidak berkembang

Ketokonazole

Berikatan
dengan
ergosterol
membran sel,
sehingga
permeabilitas
membran sel
terganggu

Hipotesis
Pemberian larutan ekstrak etanol biji kakao (T. cacao)
pada berbagai konsentrasi dapat menghambat
pertumbuhan C.albicans.
Candida albicans yang diberi larutan ekstrak etanol biji
kakao (T.cacao) 100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25%,
3,125%, 1,56%, dan, 0,78% menunjukkan
pertumbuhan yang lebih rendah dibandingkan dengan
yang tidak diberi larutan ekstrak etanol biji kakao
(T.cacao).
Larutan ekstrak etanol biji kakao (T.cacao) dengan
konsentrasi 100% merupakan larutan dengan
konsentrasi paling efektif yang mampu menghambat
pertumbuhan C. albicans.

METODE PENELITIAN

Jenis Penelitian
Penelitian Eksperimental
Semu/ Quasy Experimental
Design

Rancangan Penelitian

Post test only Control Group

Design

Skema Rancangan
Penelitian
B

K(+)

KK(+)

DK(+)

K(-)

KK(-)

DK(-)

P1-8

KP1-8

DP1-8

Keterangan :
B
: Biakan Candida albicans
M
: Media Saboraud Dextrose Agar
K(+) : Kelompok kontrol positif
K(-) : Kelompok kontrol negatif
P1-8 : Kelompok perlakuan 1-8
KK(+)
: Perlakuan berupa kontak dengan Ketokonazole konsentrasi 0.125 g/ml
KK(-) : Tanpa perlakuan dan pengobatan
KP1-8 : Perlakuan berupa kontak dengan ekstrak etanol kakao konsentrasi 7,8;
15,6; 31,2; 62,5; 125; 250; 500; 1.000 mg/ml
DK(+)
: Data perlakuan dengan kontrol positif
DK(-)
: Data perlakuan dengan kontrol negatif
DP1-8
: Data perlakuan dengan ekstrak etanol kakao konsentrasi 7,8;
15,6; 31,2; 62,5; 125; 250; 500; 1.000 mg/ml

Uji
KHM

Sampel Penelitian

Metode
difusi
Lempeng
Agar

Koloni jamur C. albicans dari

stock culture Lab. Mikrobiologi
FK UJ yang disesuaikan
dengan standar 0,5 Mc Farland
Pengulangan :
Rumus Federer (1977)
(n-1)(t-1) 15
(n-1)(10-1) 15
(n-1) 15/9
n 1, 6667 n 2

Keterangan :
n = jumlah pengulangan

t = jumlah perlakuan, KP 1-8,

KK(-), KK(+) = 10 perlakuan
Penelitian ini akan melakukan
pengulangan 4x

Tempat dan Waktu

Penelitian
Tempat :
Laboratorium Mikrobiologi Fakultas
Kedokteran Universitas Jember
Waktu :
September 2014

 Pembuatan biakan jamur, pembuatan ekstrak etanol biji kakao,

media agar Saboraud Dextrose Agar, Saboraud Dextrose
Broth, autoklaf, inkubator, suspensi obat, dan aquades steril.
Suhu pengeraman (inkubasi) jamur 370C dan lama inkubasi 24
jam.
Metode pengamatan pada Uji KHM
Prosedur penelitian.

Diameter Zona Hambat ekstrak etanol biji

kakao (T. cacao) terhadap pertumbuhan jamur
C. albicans

Konsentrasi ekstrak etanol biji kakao (T. cacao)

yang diuji adalah pada konsentrasi 0,78%,
1,56%, 3,125%, 6,25%, 12,5%, 25%, 50%, dan
100%.

Variabel
Terikat
Variabel
Terkendal
i
Variabel
Bebas

Variabel Penelitian

Definisi Operasional
Ekstrak etanol biji kakao hasil ekstraksi biji kakao dengan
menggunakan pelarut etanol 90%.
Jamur C. albicans yang telah dikembangbiakkan di Laboratorium
Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Jember.
Kontrol negatif adalah aquades steril sebanyak 100l.
Kontrol positif adalah bubuk ketoconazole 0,125 g dilarutkan
dalam aquadest steril 1 ml lalu diambil sebanyak 100l.
Uji Aktivitas Antijamur adalah uji sensitivitas dan efektivitas suatu
antijamur dalam melawan jamur patogen.
Uji KHM (Kadar Hambat Minimal) dengan metode difusi lempeng
agar adalah menentukan kadar atau konsentrasi minimal larutan
ekstrak etanol biji kakao (T. cacao) yang mampu menghambat
pertumbuhan jamur uji (C. albicans), dengan melihat diameter
zona hambat setelah diinkubasikan selama 18-24 jam.

Alat dan Bahan

Alat

sterilisator, kertas
saring, beker glass,
centrifuge, vial, tabung
reaksi, rak tabung
reaksi, vortex,
autoclave, cawan petri,
timbangan, ose bulat,
lampu bunsen,
incubator, mikropipet,
tabung Elenmeyer,
jangka sorong, hotplate
stirrer/kompor listrik

Baha
n

Saboraud Dextrose Agar

(SDA), Saboraud Dextrose
Broth (SDB), aquades
steril, suspensi C.
albicans, ekstrak etanol
biji kakao, spirtus

Prosedur Penelitian
1. Persiapan Alat
2. Pembuatan Ekstrak Etanol Biji Kakao
3. Pembuatan Larutan 0,5 Mc Farland
4. Pembuatan Media
5. Pembuatan Suspensi Jamur
6. Pembuatan Suspensi Ketokonazole MIC 0,125 g/ml
7. Tahap Perlakuan
8. Analisis Data

Prosedur Penelitian
Pembuatan Ekstrak Etanol Biji Kakao
1. 4000 mg ekstrak + 4ml aquadest vortex
50 detik vial 1 (100%)
2. vial 1 diambil 2 ml vial 2 (sudah diisi 2 ml
aquadest) vortex 60 detik vial 2 (50 %)
3. vial 2 diambil 2 ml vial 3 (sudah diisi 2 ml
aquadest) vortex 60 detik vial 3 (25%)
dst sampai vial 8
4. Masukkan kertas disk ke dalam masingmasing pengenceran volume kertas saring

Prosedur Penelitian
Pembuata
n Media

Suspensi
Jamur

SDA : Media agar ditimbang

38 gram dilarutkan dalam
aquadest steril sebanyak 1
liter dengan cara dididihkan.
Setelah larut, disterilkan
dengan autoklaf suhu 121C
selama 15 menit. Larutan
dituang ke dalam cawan
petri steril sampai ketebalan
9 mm dan ditutup lalu
dibiarkan sampai memadat
di suhu ruangan.
SDB : media agar SDB
sebanyak 30 gram
dilarutkan 1 liter aquadest
steril destilasi sampai
didapatkan suspense yang
homogen dan dipanaskan
selama 1 menit. Kemudian
supensi disterilisasi dalam
autoklaf dalam suhu 121 C
selama 15 menit

Satu ose kuman dari

kultur, kemudian
dimasukkan ke dalam
media Saboraud
Dextrose Broth,
selanjutnya diinkubasi
37oC selama 24 jam.
Setelah 24 jam
suspensi kuman yang
telah diinkubasi
disesuaikan dengan
standar larutan 0,5 Mc
Farland (1x108 CFU/ml)
dengan menambah
aquades steril
(Warsinah, Kusumawati,
et Sunarto, 2011).

Suspensi
Ketokonaz
ole
Antifungi diambil dari
sediaan tablet 200 mg,
dihancurkan hingga
halus dan diambil 0,125
g. Kemudian dilakukan
pengenceran dengan
aquades steril sebanyak
1 ml. Kemudian diambil
sebanyak 100l

Prosedur Penelitian
Tahap
Perlaku
an

1. Dari masing - masing

pengenceran diambil kertas disk
dan dimasukkan pada sumur di
media agar Saboraud Dextrose
Agar yang sudah distreaking
suspensi jamur.
2. Pemberian label konsentrasi
sesuai konsentrasi yang telah
dimasukkan. Kemudian diinkubasi
selama 18-24 jam dalam suhu
370C.
3. Amati dan hitung zona hambat
dari masing-masing kertas saring
dengan jangka sorong untuk
menentukan nilai KHM.

Alur Penelitian
1. Pengenceran Ekstrak
4000 mg ektrak + 4 Aquades steril
ml aquades steril
2 ml

Aquades steril
2 ml

Aquades steril Aquades steril Aquades steril

2 ml
2 ml
2 ml

Aquades steril
2 mll

Aquades steril
2 ml

Alur Penelitian
2. Uji Aktivitas Antijamur
Kertas disk yang telah direndam dalam masing-masing pengenceran
ekstrak etanol kakao (100%, 50%, 25%,12,5%, 6,25%, 3,125%, 1,56%, 0,78%)

Dimasukkan ke sumur media agar Saboraud Dextrose Agar

100
%

50%

6,25%

3,125
%

12,5%

25%

0,78%

1,56
%

Tentukan nilai KHM setelah inkubasi 24 jam dengan suhu 37 o C

Alur Penelitian : Kontrol Positif dan

Kontrol Negatif
Timbang bubuk antibiotik sesuai data MIC : Ketokonazole 0, 125 g/ml

Campur dengan 1 ml aquadest steril

Letakkan kertas saring pada larutan antibiotik sampai meresap minimal 10 menit

Letakkan kertas saring yang menyerap larutan antibiotik pada media agar MH sebagai kontrol positif dan
kertas saring yang menyerap aquadest steril sebagai kontrol negatif

K(+
)

K(-)

Amati zona hambatnya dengan jangka sorong setelah inkubasi 24 jam dengan suhu 37 o C

ANALISIS DATA
Data dianalisis dengan uji normalitas KolmogorovSmirnov dengan p>0,05 uji regresi linier untuk
mengetahui pengaruh antara variabel bebas
terhadap variabel terikat.
Perbandingan lebih dari dua variabel yang tidak
berpasangan dilakukan uji nonparametrik KruskalWallis dan dilanjutkan dengan Uji Post Hoc multiple
comparisons dengan metode Mann-Whitney. Uji ini
dilakukan untuk mengetahui adanya perbedaan
pada masing-masing konsentrasi terhadap
konsentrasi yang lain maupun terhadap kontrol yang
ada (Wulandari, 2012). Batas kepercayaan yang
digunakan dalam peneltian ini adalah 95% (p<0,05).